CC BY
28
УДК 678+544.34; 544.45;544.47; 577.15; 577.34
ЛЮЦИФЕРАЗА СВЕТЛЯКОВ КАК ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ ПОИСКА И ИЗУЧЕНИЯ МАГНИТНО-ИЗОТОПНЫХ ЭФФЕКТОВ В АТФ-ЗАВИСИМЫХ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЯХ
Д.В. Смирнова1, В.К. Кольтовер2, С.В. Носенко3, И.А. Стрижова1'2, Н.Н. Угарова1*
(1 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; 2 Институт проблем химической физики РАН; 3 Институт проблем технологии микроэлектроники и особочистыхматериалов РАН; *e-mail: nugarova@gmail.com)
Клетки и ткани состоят из атомов химических элементов, некоторые из которых имеют два типа стабильных изотопов: магнитные и немагнитные. Недавно в экспериментах с живыми клетками, обогащенными магнитными и немагнитными изотопами магния, были обнаружены магнитно-изотопные эффекты (МИЭ), которые могут быть обусловлены более высокой эффективностью ферментов в клетках, обогащенных магнитным изотопом магния. При изучении МИЭ в биологических системах необходим мониторинг концентрации АТФ как главного источника энергии в клетке. Наиболее чувствительный и быстрый метод определения АТФ основан на использовании люциферин-люциферазной системы светляков. Так как люцифера-за сама является АТФ-зависимым ферментом и активируется ионами магния, необходимо выяснить, насколько фермент чувствителен к ядерному спину магнитного изотопа магния. В настоящей работе изучены спектры биолюминесценции и ферментативная активность люциферазы светляков в присутствии магнитного (25М^) и немагнитных (24М£ и 26М^) изотопов магния. Установлено, что кинетика реакции окисления люциферина, катализируемой люциферазой, и спектры биолюминесценции не зависят от типа изотопа магния. Таким образом, магнитно-изотропные эффекты в люциферазной реакции не были обнаружены. Следовательно, биолюминесцентный метод может быть использован для поиска и изучения магнитно-изотопных эффектов в АТФ-зависимых ферментативных реакциях в биологических системах, включая ферментативный синтез и гидролиз АТФ.
Ключевые слова: люцифераза светляков, люциферин, комплекс АТФ-М^, магнитно-изотопный эффект, магний.
Принятые в статье сокращения: МИЭ - магнитно-изотопный эффект, АТФ - аденозин-5'-трифосфат, Р; - неорганический фосфат, прMgCl2 - хлорид магния природного изотропного обогащения.
Клетки и ткани состоят из химических элементов, некоторые из них имеют два типа стабильных изотопов: магнитные и немагнитные. Атомные ядра некоторых магнитных изотопов создают магнитные поля (на расстоянии порядка длины химической связи), превышающие в десятки раз магнитное поле Земли (~0,05 мТ) [1]. Например, магний имеет три стабильных изотопа (24Mg; 25Mg и 2бMg с природным содержанием 78,70; 10,13 и 11,17% соответственно),
25
один из которых ( Mg) обладает магнитным спином (I = 5/2) и, как следствие, создает магнитное поле, в то время как два других (24Mg и 2бMg) магнитным спином не обладают (I = 0) и являются немагнитными [1]. Катион магния (Mg2+) служит кофактором многих важных фер-
ментов, в том числе ферментов синтеза и гидролиза АТФ. Недавно были обнаружены магнитно-изотопные эффекты (МИЭ) магния в живых клетках [2, 3]. Клетки дрожжей S. cerevisiae, обогащенные магнитным изотопом магния
25
( Mg) восстанавливаются после облучения ко -ротковолновым ультрафиолетовым светом в два раза быстрее, чем клетки, обогащенные немагнитным изотопом магния [2]. В экспериментах с другой клеточной моделью, бактериями E. coli, было обнаружено, что клетки значительно быстрее адаптируются к среде, обогащенной магнитным изотопом магния по сравнению со средой, обогащенной немагнитным изотопом [3].
Хорошо известно, что для адаптации клеток к стрессовым условиям (пострадиационное
восстановление, пересадка на новую среду роста) нужен АТФ - главный источник энергии в клетке. На основании этого рационально предположить, что МИЭ, обнаруженные в экспериментах с живыми клетками, обусловлены более высокой эффективностью ферментов в клетках, обогащенных магнитным изотопом магния. Способность контролировать скорость реакций образования и разрушения АТФ посредством магнитных изотопов и магнитных полей может найти терапевтическое применение [4-6].
При изучении МИЭ в биологических системах необходим мониторинг концентрации АТФ или продукта его синтеза или гидролиза. Для этого используют разные методы. Например, определяют концентрацию неорганического фосфата (Рг), образующегося в ходе реакции гидролиза АТФ, с помощью радиоактивной метки 32Р [7], в сочетании с ИРЬС-разделением радиоактивных продуктов. Этот метод достаточно сложен и кропотлив, требует специальной про-боподготовки и специального оборудования для работы с радиоактивной меткой. Альтернативным методом мониторинга концентрации АТФ является метод Фиске-Суббароу, который основан на измерении концентрации окрашенного комплекса молибдата аммония с неорганическим фосфатом (Рг), высвобождаемым в ходе реакции гидролиза АТФ. Однако данный метод обладает относительно низкой чувствительностью [8].
В настоящее время как наиболее чувствительный, надежный и простой в исполнении способ определения концентраций АТФ в биологических системах можно рассматривать биолюминесцентный люциферин-люциферазный метод [9, 10]. Люцифераза светляков катализирует реакцию окисления люциферина молекулярным кислородом в присутствии комплекса АТФ с магнием (Mg-ATP). Оксилюциферин (продукт реакции) образуется в синглетном электронно-возбужденном состоянии, и его переход в основное состояние сопровождается излучением кванта света в видимой области спектра [11]. При этом интенсивность свечения в присутствии люциферазы, люциферина и О2 прямо пропорциональна концентрации АТФ и служит показателем содержания АТФ в реакционной смеси [12]. Биолюминесцентный метод был использован в работе [13] для изучения влияния изотопов магния на образование АТФ в реакции, катализируемой креатин фосфоки-назой. Реакционную смесь, содержащую АТФ
и изотопы магния, перед измерением биолюминесценции разбавляли более чем в 200 раз. Важно отметить, что после разбавления концентрации изотопных форм магния становились пренебрежимо малы по сравнению с концентрацией природного магния, содержащегося в люциферин-люциферазном реагенте (5 мМ), а потому не могли повлиять на детектируемый сигнал. Поскольку люцифераза является АТФ -зависимым ферментом и активируется ионами магния, то для использования данного метода без большого разбавления реакционной смеси (например, при анализе более низких концентраций АТФ), необходимо выяснить, насколько сама люциферазная реакция чувствительна к ядерному спину магнитного изотопа магния. В настоящей работе представлены результаты
25
изучения влияния магнитного ( Mg) и немагнитных (24Mg и 26Mg) изотопов на спектры биолюминесценции и ферментативную активность люциферазы светляков.
Материалы и методы
Использованные вещества. В работе были использованы оксиды магния 24MgO, 25MgO и 26MgO с изотопным обогащением 99,8; 98,2 и 99,7 атом.% соответственно («Электрохимпри-бор», Россия); хлорид магния (MgCl2) природного изотопного состава («Merck», Германия); ди-натриевая соль аденозин-5'-трифосфата (АТФ); бычий сывороточный альбумин (БСА); этилен-диаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и трега-лоза («Sigma Aldrich», США); D-люциферин (LH2) и термостабильная мутантная люцифераза светляков Lucióla mingrelica («Люмтек», Россия). Остальные реагенты имели аналитическую чистоту. Для приготовления растворов использовали деионизированную воду, очищенную системой «Milli-Q». Биолюминесцентный анализ проводили в полистирольных 96-луноч-ных планшетах с поверхностью средней сорб-ционной емкости («Greiner», Германия).
Изотопный состав магния и элементный состав образцов. Базовые растворы хлоридов магния 24MgCl2, 25MgCl2 и 26MgCl2 были приготовлены по стандартной методике [14] из соответствующих оксидов магния (24MgO, 25MgO и 26MgO) с использованием концентрированной HCl аналитической чистоты. Концентрацию магния в базовых растворах измеряли методом атомной эмиссионной спектроскопии (ICP-AES), после чего все растворы выравнивали по концентрации магния. Изотопный со-
став магния в растворах определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-MS) на спектрометре «X-Series II ICP-MS» («Thermo Scientific», США), как описано в работе [15]. Содержание Li, Na, Mg, Al, P, S, K, Ca, V, Mn, Fe, Cu, Zn, Sr и Ba определяли, используя спектрометр для атомной эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (ICP-AES) «iCAP-6500 Dual» («Thermo Scientific», США). Содержание B, Be, Al, Sc, Ti, V, Cr, Mn, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Ge, As, Se, Br, Rb, Sr, Y, Zr, Nb, Mo, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, In, Sn, Sb, Te, Cs, Ba, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Hf, Ta, W, Re, Os, Ir, Pt, Au, Hg, Tl, Pb, Bi, Th и U определяли методом ICP-MS [15].
Измерения биолюминесценции. Для измерения биолюминесценции в отсутствие стабилизаторов все растворы были приготовлены в Трис-ацетатном буфере (50 мМ, pH 7,8), содержащем 2 мМ ЭДТА. В люминометрическую кювету вносили 100 мкл раствора MgCl2 (50 мМ), 200 мкл раствора АТФ (2,5 мМ), 50 мкл раствора люциферазы (0,01 мг/мл), содержащего 1% БСА, и перемешивали. Далее инжектировали 150 мкл 0,5 мМ раствора люциферина (LH2) в том же буфере и регистрировали интенсивность биолюминесценции в режиме реального времени на люминометре FB 12 Femtomaster «Zylux Corp» («Bertold», Германия). Для измерения интенсивности биолюминесценции и получения спектров в присутствии стабилизаторов был приготовлен раствор LLTA, содержащий LH2 (0,5 мМ) и люциферазу (50 нМ) в Трис-ацетатном буфере (150 мМ, pH 7,8) с БСА (1,5%), трегалозой (270 мг/мл), ЭДТА (2 мМ), Na4P2O7 (75 мкМ). Для измерения биолюминесцентного сигнала при разной концентрации магния к 30 мкл раствора LLTA добавляли 20 мкл водного раствора MgCl2 с концентрацией
0,5-50 мМ. Затем вносили 50 мкл 2 мМ водного раствора АТФ, интенсивно перемешивали и регистрировали биолюминесцентный сигнал на люминометре FB 12 Femtomaster «Zylux Corp». Для измерения биолюминесцентного сигнала и регистрации спектров биолюминесценции при разных концентрациях АТФ к 30 мкл LLTA добавляли 20 мкл 25 мМ водного раствора 24MgCl2 или 25MgCl2. Затем вносили 50 мкл водного раствора АТФ, концентрация которого варьировала от 2Т0-3 до 2Т0-7 M, и регистрировали биолюминесцентный сигнал на спектрометре «Spectramax M5» («Molecular Devices», США).
Обработка результатов измерений. Для проведения анализа экспериментальных данных использовали стандартные методы дисперсионного анализа (ANOVA), а также программы MS Office, OriginPro 8.6 и Statistica 4.5.
Результаты
Изотопный состав магния в базовых растворах. Изотопный состав препаратов магния в реакционных растворах, использованных для измерений биолюминесценции, представлен в табл. 1. Эти данные однозначно свидетельствуют о вьюокой степени обогащения этих раство-
24Л л- 25Л » 26, .
ров изотопами Mg, Mg и Mg.
Кинетика биолюминесценции в присутствии различных изотопов магния. Ранее было показано, что при высоких концентрациях субстратов кинетика биолюминесценции описывается кривой с максимумом [16]. Исследование таких кривых представляет интерес для выяснения закономерностей влияния различных условий и факторов (в том числе, различных изотопов магния) на ферментативную активность. Однако для практического применения люцифераз-ной реакции, в частности для количественного определения АТФ в пробе, необходим высокий, стабильный во времени биолюминесцентный
Т а б л и ц а 1
Изотопный состав базовых растворов хлорида магния. Представлены средние значения ± среднее квадратичное отклонение (т ± 8Б); число независимых измерений в каждом растворе п = 5
Изотоп Изотопное обогащение, %
природный Mg 24MgCl2 25MgCl2 26MgCl2
24Mg 79,2+0,4 99,7+0,1 0,17+0,02 0,16+0,03
25Mg 10,1+0,1 1,3+0,1 98,2+0,2 0,46+0,1
26Mg 10,7+0,2 1,1+0,1 0,22+0,1 98,7+0,3
Время, с Время, с
Рис. 1. Зависимость от времени интенсивности сигнала биолюминесценции растворов с разными изотопами магния. Состав реакционной смеси: Трис-ацетат (50 мМ, pH 7,8), ЭДТА (2 мМ), БСА (0,1%), люцифераза (1 мкг/мл), растворы АТФ и люциферин насыщающих концентраций (1 мМ АТФ и 0,15 мМ люциферин), MgCl2 (5 мМ). В отсутствие стабилизаторов (А); в присутствии 25 мкМ Na4P2O7, 0,5 % БСА и 80 мг/мл трега-
лозы в качестве стабилизаторов (Б)
Рис. 2. Зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации ионов магния, полученные для разных изотопов магния: в абсолютных единицах интенсивности, RLU (А); в относительных единицах (Б). Для каждой концентрации изотопов магния за 1 принимали биолюминесцентный сигнал, полученный для 24Mg. Состав реакционной смеси: Трис-ацетат (50 мМ, pH 7,8), ЭДТА (2 мМ), люцифераза (1 мкг/мл), АТФ (1 мМ), люциферин (0,15 мМ), Na4P2O7 (25 мкМ), БСА (0,5%) и трегалоза (80 мг/мл). Представлены средние значения ± среднее квадратичное отклонение (m ± SD); число независимых измерений в каждом растворе n = 5
сигнал. Для решения этой задачи в нашей лаборатории был разработан специальный состав АТФ-реагента [17]. На рис. 1 представлены кинетические кривые зависимости интенсивности биолюминесцентного сигнала от времени в экспериментах с разными изотопами магния. Были проведены две серии экспериментов: в присут-
ствии (А) и в отсутствие (Б) стабилизирующих добавок (пирофосфата натрия и трегалозы).
Как следует из данных рис. 1, форма кинетической кривой и величина интенсивности биолюминесценции не зависят от природы изотопа магния. Использование стабилизирующих добавок обеспечивает высокое стабильное значе-
ние сигнала биолюминесценции. Поэтому все дальнейшие эксперименты были проведены с помощью буферных растворов, содержащих стабилизирующие добавки. На рис. 2 представлены зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации ионов магния разных изотопов (24Мg, 25Мg, 26Мg или прMg) в присутствии насыщающих концентраций люциферина и АТФ.
Согласно полученным данным, интенсивность биолюминесценции с увеличением кон -центрации ионов магния растет с выходом на плато при концентрации более 2 мМ. Статистически значимые изотопные эффекты не обнаружены. Чтобы исключить возможную ошибку измерения, обусловленную зависимостью интенсивности биолюминесценции от концентрации ионов магния, и обеспечить более высокую точность измерений концентрации АТФ, дальнейшие эксперименты выполняли в присутствии MgCl2 (5 мМ) в реакционной смеси. Для магнитного (25Mg) и немагнитного (24Mg) изотопов магния были получены зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации АТФ в широком диапазоне концентраций (10-7-10-4 М АТФ) (рис. 3, а). Для каждого из использованных растворов были зарегистрированы спектры биолюминесценции (рис. 3, б). В данном случае анализ спектров был не-
обходим, поскольку фотоэлектронный умножитель люминометра имеет в «зеленой» области спектра более высокую чувствительность, чем в «красной», что может вызвать изменения интегрального сигнала биолюминесценции [16]. Однако полученные результаты свидетельствуют о том, что изотопный состав ионов магния не влияет ни на зависимость интенсивности биолюминесценции от концентрации АТФ, ни на форму спектров биолюминесценции. Все полученные спектры имели форму спектра биолюминесценции раствора с 0,1 мМ АТФ (рис. 3, б). Магнитно-изотопных эффектов обнаружено не было.
Элементный состав реакционных сред для измерений биолюминесцентного сигнала. Известно, что в присутствии больших концентраций многоэлектронных парамагнитных ионов, таких как ионы железа, наблюдение МИЭ становится невозможным. Это обусловлено тем, что локальные магнитные поля, создаваемые электронными спин-орбитальными моментами в этих ионах, существенно превосходят магнитное поле ядерного спина [18]. Поэтому можно было бы предположить, что отсутствие МИЭ в люциферин-люциферазной системе объясняется наличием в реакционной среде высоких концентраций парамагнитных ионов. Однако это предположение опровергают результаты элементного анализа реакционных растворов,
Рис. 3. Зависимость биолюминесцентного сигнала от концентрации АТФ (а); нормированные спектры биолюминесценции в экспериментах с двумя различными изотопами магния при концентрации АТФ 0,1 мМ (б). Состав реакционной смеси: Трис-ацетат (50 мМ, рН 7,8), ЭДТА (2 мМ), люцифераза (1 мкг/мл), люциферин (0,15 мМ),
№4Р207 (25 мкМ), БСА (0,5 %) и трегалоза (80 мг/мл)
Т а б л и ц а 2
Элементный анализ состав реакционной смеси: 0,15 мМ ЬН2, 1 мМ АТР, 1 мкг/мл люцифераза, Трис-ацетат (0,05 М, рН 7,8), ЭДТА (2 мМ), Ка4Р207 (25 мкМ), БСА (0,5%), трегалоза (80 мг/мл), 2^С12, 25М^С12 или 26М^С12 (5 мМ); показаны средние величины пяти измерений
Элемент Предел обнаружения, мг/л Содержание в реакционной смеси, мг/л
2<^
№ 0,4 64,0 64,7 65,8
Mg 0,4 116,8 120,3 131,1
Р 1 92,8 92,4 96
8 1 57,7 59,4 60,3
К 1 4,6 4,8 5,2
Си 0,09 0,28 0,28 0,31
использованных для измерения интенсивности биолюминесценции. Было показано, что содержание большинства примесных элементов, включая парамагнитные ионы V, Сг, Мп и Бе, ниже порога определения. Хотя содержание меди и превышает порог определения, но его концентрация (0,004-0,005 мМ) в 1000 раз меньше концентрации ионов магния в реакционной смеси, т.е. слишком мала, чтобы элиминировать магнитно-изотопный эффект [18], если бы таковой имел место в изучаемой реакции (табл. 2). Таким образом, с точностью в пределах экспериментальной ошибки можно сделать вывод о том, что тип изотопа (магнитный или немагнитный) не влияет на сигнал биолюминесценции и форму кинетической кривой.
Обсуждение результатов
В химической физике магнитно-изотопные эффекты давно и хорошо известны. В частности, скорость и выход продуктов химической реакции с участием свободных радикалов и/или ион-радикальных пар существенно изменяются в зависимости от того, содержат ли исходные реагенты магнитный или немагнитный изотоп одного и того же элемента, например углерода (магнитный 13С / немагнитный 12С), кислорода ( О / О) и ряда других элементов, в том числе урана (235и / 238И) [6]. Этот эффект является прямым следствием закона сохранения электронного углового момента - спина, т.е. для прохождения реакции необходимо, чтобы суммарный электронный спин (8) продуктов был равен суммарному спину исходных реагентов. Чтобы снять спиновый запрет, наложенный законом сохранения спина, необходимо изменить спиновое состояние реагентов. Если спин-
орбитальное взаимодействие слабое, как это имеет место в органических радикалах, и нет парамагнитных ионов, то единственный способ обеспечения спиновой конверсии - это внешнее магнитное поле или поле ядерного спина атомного ядра [6]. Аналогичный спиновый запрет возникает при синглет-триплетных переходах в молекулах, и единственный способ устранить его (изменить спиновое состояние и тем самым ускорить синглет-триплетный переход) заключается в наложении магнитного поля [5, 6].
В целях обнаружения МИЭ в АТФ - и Mg-зависимых реакциях были поставлены эксперименты с изолированной креатинфосфокина-зой [19]. Данный фермент катализирует перенос фосфатной группы с креатинфосфата на АДФ и обратный ему процесс гидролиза АТФ. С использованием метода радиоактивной метки 32Р авторами работы [19] было установлено, что в реакции фосфорилирования АДФ (синтез АТФ) выход АТФ выше в два-три раза с магнитным изотопом магния (25Mg), чем в аналогичной реакции с немагнитными изотопами (24Mg и 26Mg). В обратной реакции гидролиза АТФ, катализируемой тем же ферментом, МИЭ не наблюдался [19]. Влияние различных изотопов магния на катализируемую креатинфос-фокиназой реакцию фосфорилирования АДФ было изучено позднее британской группой биохимиков в двух независимых сериях экспериментов, где концентрации АТФ определяли люциферин-люциферазным методом или методом спектрофотометрии в режиме реального времени. МИЭ не был обнаружен: скорости образования АТФ по реакциям с немагнитным (24Mg) и магнитным (25Mg) изотопами магния не отличались [13].
Рис. 4. Схема реакции окисления люциферина в присутствии люциферазы светляков и АТФ
Недавно МИЭ был обнаружен в реакции гидролиза АТФ, катализируемой миозином [20]. АТФ-гидролазная активность фермента была измерена с помощью метода Фиске-Суббароу. Скорость реакции гидролиза АТФ, катализируемой этим ферментом, в присутствии 25Mg оказалась в 2-2,5 раза выше, чем скорость той же реакции в присутствии немагнитных изотопов (24Mg или 2бMg). Полученные результаты можно объяснить следующим образом. Миозин катализирует реакцию гидролиза АТФ до АДФ и неорганического фосфата (Рг). Энергия, высвобождаемая при гидролизе АТФ, запасается в виде энергии конформационного возбуждения макромолекулы миозина с последующим использованием ее для выполнения механической работы. Энергия гидролиза АТФ (~0,54 эВ) недостаточно велика для электронно-конфор-мационного возбуждения макромолекулы миозина в синглетное состояние. Этой энергии достаточно для получения низколежащего триплетного состояния, но переход из основного состояния (Я = 0) в триплетное (Я = 1) запрещен законом сохранения спина. Ядерный спин 25Mg устраняет проблему спинового запрета, обеспечивая таким образом необходимую спиновую конверсию в триплетное состояние и ускоряя тем самым гидролиз АТФ миозином [5, 20].
В случае окисления люциферина, катализируемого люциферазой светляков, реакция проходит в две стадии [11]. На первой стадии лю-цифераза, в отличие от миозина, гидролизует АТФ не до АДФ и фосфата, а до монофосфата и пирофосфата. При этом за счет энергии гидролиза происходит аденилирование люциферина с образованием люцифериладенилата (рис. 4).
На второй стадии люцифериладенилат через ряд промежуточных стадий окисляется кислородом воздуха, превращаясь в циклический пероксид - диокситанон [11]. Трансформация диокситанона приводит к образованию биради-кала, в результате декарбоксилирования которого образуется продукт реакции - оксилюцифе-рин (3) в форме кетона или енола, в синглетном электронно-возбужденном состоянии. Переход этих эмиттеров в основное состояние сопровождается излучением красного (кетон) или желто-зеленого (енол) света (4). В зависимости от структуры и свойств микроокружения оксилю-циферина в активном центре люциферазы соотношение концентраций двух эмиттеров может изменяться, что определяет параметры спектров биолюминесценции конкретной формы люциферазы в тех или иных условиях [21, 22]. В работе [16] было показано, что стадией, лимитирующей скорость реакции является окисле-
ние люцифериладенилата. Можно предположить, что влияние магнитного спина на «суммарный процесс» окисления люциферина можно было бы наблюдать на стадии окисления люциферила-денилата в оксилюциферин с последующим его переходом в основное состояние с испусканием кванта света. Однако полученные данные свидетельствуют об отсутствии влияния ядерного спи-
25ц ц
на магния Mg как на переход продукта реакции (электронно-возбужденного оксилюциферина) в основное состояние (независимость интенсивности биолюминесценции), так и на стабилизацию одной из форм эмиттера (отсутствие изменения спектров биолюминесценции). Более того, полученные результаты хорошо согласуются с выводами, представленными ранее в работе [23], о том, что регуляция каталитической активности люци-феразы светляков ионами магния осуществляется на стадии аденилирования, где происходит двухцентровое связывание комплекса [Mg-АТФ ] с молекулой люциферазы и, следовательно, влияние изотопов магния вряд ли будет проявляться на стадии окисления промежуточного продукта реакции - люцифериладенилата.
Таким образом, кинетика люциферин-люци-феразной реакции и форма спектров биолюминесценции не зависят от типа изотопов магния: магнитного (25Mg) или немагнитных (24Mg и 26Mg). Магнитно-изотопные эффекты в реакции окисления люциферина, катализируемой люциферазой светляков, не обнаружены. Следовательно, метод количественного определения АТФ на основе люциферин-люциферазной реакции высокочувствителен по сравнению с другими методами, в том числе с методом Фи-ске-Субарроу или методом радиоактивного фосфора. Этот метод, надеженый и простой в исполнении, можно успешно применять для поиска и изучения магнитно-изотопных эффектов в АТФ-зависимых ферментативных реакциях в биосистемах разной степени сложности.
Авторы выражают благодарность В.К. Ка-рандашеву - руководителю Аналитического центра Института проблем технологии микроэлектроники и особо чистых материалов РАН (г. Черноголовка) за помощь в проведении изотопного и элементного анализа, а также за плодотворные дискуссии.
Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агенства научных исследований (проект № 0120-1361-868) и Российского фонда фундаментальных исследований (проект
№ 14-04-00593).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Grant D.M., Harris R.K. // Encyclopedia of nuclear magnetic resonance. Chichester, 1996. Р. 826.
2. Авдеева Л.В., Кольтовер В.К. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2016. Т. 57. № 3. С. 145.
3. Кольтовер В.К., Шевченко У.Г., Авдеева Л.В., Ройба Е.А., Бердинский В.Л., Кудряшова Е.А. // Докл. АН. 2012. Т. 442. № 2. С. 272.
4. Кольтовер В.К. // Изв. АН. Сер. хим. 2014. № 5. C. 1029.
5. Koltover V.K. // J. Mol. Liq. 2017. Vol. 235. P. 44.
6. Buchachenko A.L. // Magneto-biology and medicine. N.Y., 2015. P. 247.
7. Post R.L., Estabrook A.K.S.R.W., Pullman M.E. // Meth. Enzymol. 1967. Vol. 10. P. 773.
8. Chen P.S., Toribara T.Y., Warner H. // Anal. Chem. 1956. Vol. 28. P. 1756.
9. Deluca M., McElroy W.D. // Meth. Enzymol. 1978. Vol. 57. P. 3.
10. Lundin A. // Meth. Enzymol. 2000. Vol. 305. P. 346.
11. Ugarova N.N. // J. Biolum. Chemilum. 1989. Vol. 4. P. 406.
12. Ломакина Г.Ю., Модестова Ю.А., Угарова Н.Н. // Биохимия 2015. Т. 80. № 6. С. 829.
13. Crotty D., Silkstone G., Poddar S., Ranson R., Prina-Mello A., Wilson M.T., Coey J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. Vol. 109. P. 1437.
14. Карякин Ю.В., Ангелов И.И. // Чистые химические вещества. М., 1974. С. 408
15. Карандашев В.К., Туранов А.Н., Орлова Т.А., Лежнев А.Е., Носенко С.В., Золоторева Н.И., Москвина И.Р. // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2007. Т. 73. № 1. С. 12.
16. Бровко Л.Ю., Гандельман О.А., Поленова Т.Е., Угарова Н.Н. // Биохимия. 1994. Т. 59. № 2. С. 273.
17. Угарова Н.Н., КокшаровМ.И., Ломакина Г. Ю. // Пат. РФ 2420594. 2009.
18. Buchachenko A. // Bioelectromagnetics 2016. Vol. 37. P. 1.
19. Buchachenko A.L., Kouznetsov D.A., Breslavskaya N.N., OrlovaM.A. // J. Phys. Chem. B 2008. Vol. 112. P. 2548.
20. Кольтовер В.К., Лабынцева Р.Д., Карандашев В.К., Костерин С.О. // Биофизика. 2016. Т. 61. № 2. С. 239.
21. Ugarova N.N. // Photochem. Photobiol. Sci. 2008. Т. 7. P. 218.
22. Snellenburg J.J., Laptenok S.P., DeSa R.J., Naumov P., Solntsev K.M. // J. Am. Chem. Soc. 2016. Vol. 138. P. 16252.
23. Духович А. Ф., Угарова Н.Н., Березин И. В., Филиппова Н.Ю. // ДАН СССР. Биохимия. 1986. Т. 288. № 6. С. 1500.
Поступила в редакцию 09.01.18
FIREFLY LUCIFERASE BIOLUMINESCENCE AS A TOOL FOR SEARCHING MAGNETIC ISOTOPIC EFFECTS IN ATP-DEPENDENT ENZYME REACTIONS
D.V. Smirnova 1, V.K. Koltover 2, S.V. Nosenko 3, I.A. Strizhova 12, N.N. Ugarova1*
(1 M.V. Lomonosov State University; 2 Institute of Problems of Chemical Physics, RAS; 3 Institute of Microelectronics Technology and High Purity Materials; *e-mail: nugarova@gmail.com)
Cells and tissues are composed from atoms of chemical elements, some of which have two kinds of stable isotopes, magnetic and nonmagnetic ones. Not long ago, magnetic isotope effects (MIEs) have been discovered in experiments with the cells enriched with magnetic or nonmagnetic isotopes of magnesium. These MIEs can stem from higher efficiency of the enzymes in the cells enriched with magnetic magnesium isotope. In the studies of MIEs in biological systems, it is needed to monitor the ATP concentrations as the major energy currency in cells. The most sensitive and rapid method of the ATP assay is based on the use of the firefly luciferase-luciferin system. Since luciferase is the ATP-dependent enzyme and activated by Mg-ions, it is necessary to elucidate whether this enzyme is sensitive to magnetic field of the magnesium isotope's nuclear spin. Herein we present the results of studying the effects of different isotopes of magnesium, magnetic 25Mg and nonmagnetic 24Mg and 26Mg, on bioluminescence spectra and enzymatic activity of firefly luciferase. It was shown, that neither kinetics of the bioluminescence nor the bioluminescence spectra have manifested any statistically significant dependence on the type of magnesium isotope. So, no MIEs have been revealed in the luciferase-catalyzed oxidation of luciferin. It means that firefly luciferase bioluminescence can serve as the tool for search and studies of magnetic isotope effects in ATP-dependent enzyme reactions in biological systems, including the enzymatic synthesis and hydrolysis of ATP.
Key words: firefly luciferase, luciferin, ATP-Mg, magnetic isotope effect, magnesium
Cведения об авторах: Смирнова Дарья Васильевна - науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (S_mir_nova@mail.ru); Кольтовер Виталий Кимович - глав. науч. сотр. отдела кинетики и катализа Института проблем химической физики РАН, докт. биол. наук, (koltover@icp.ac.ru); Носенко Сергей Всеволодович - ст. науч. сотр. Института проблем технологии микроэлектроники и особо чистых материалов РАН, канд. физ.-матем. наук (nosenko@iptm.ru); Стрижова Ирина Александровна - студентка физико-химического факультета МГУ (strizh184@mail.ru); Угарова Наталья Николаевна - глав. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, докт. хим. наук (nugarova@gmail.com).
