CC BY
109
ВОЗМОЖНА ЛИ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ У РАСТЕНИЙ?
Е. Б. Гугля1 А. А. Котлобай2, Е. К Секретова3, П. В. Волкова3, И. В. Ямпольский1,2
1 Лаборатория химии природных соединений, НИИ трансляционной медицины,
Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, Москва
2 Группа синтеза природных соединений,
Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва
3 Московская гимназия на Юго-Западе № 1543, Москва
На основе открытого недавно механизма биолюминесценции высших грибов и сходства структуры люциферина грибов и некоторых метаболитов растений поставлена задача поиска растений, содержащих субстрат(ы) реакции грибной люминесценции. В результате скрининга коллекции растений европейской части России обнаружено 10 видов, экстракты листьев которых проявляют биолюминесцентную активность. Установлено, что изученные виды растений синтезируют не одно, а множество активных соединений. Все люминесцентные субстраты, содержащиеся в растениях, не идентичны грибному люциферину (3-гидроксигиспидину) и химически нестабильны, что препятствует выделению индивидуальных соединений. Данное исследование можно считать первым шагом в создании автономно люминесцентного растения на базе фермент-субстратной системы высших грибов.
Ключевые слова: биолюминесценция грибов, люминесцентные биоинженерные растения, люциферины, метаболиты растений
Финансирование: работа выполнена при поддержке Российского научного фонда, грант № 14-50-00131.
Благодарности: авторы благодарят Людмилу Абрамову и Никиту Тихомирова за помощь при сборе и определении образцов растений. Работа выполнена с использованием оборудования центра коллективного пользования ИБХ РАН (ЦКП ИБХ).
[>^1 Для корреспонденции: Гугля Елена Борисовна
ул. Островитянова, д. 1, г Москва, 117997; [email protected]
Статья получена: 19.02.2017 Статья принята к печати: 10.04.2017
BIOLUMINESCENCE: IS IT POSSIBLE FOR A PLANT?
Guglya EB1 Kotlobay AA2, Sekretova E3, Volkova PV3, Yampolsky IV1,2
1 Laboratory of Chemistry of Natural Compounds,
Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia
2 Total Synthesis Laboratory,
Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
3 Moscow South-West High School No. 1543, Moscow, Russia
An extensive collection of plants gathered in the European part of Russia was screened for a substrate of fungal luciferase. This work was inspired by the recently discovered mechanism of bioluminescence in higher fungi and the structural similarity of fungal luciferin with some plant metabolites. Of all studied leaf extracts obtained from 200 different plants, bioluminescent activity was discovered in 10 species. Each of these species contained a plurality of active compounds. All the luminescent substrates were not identical to fungal luciferin (3-hydroxyhispidin) and were chemically unstable, rendering the attempt to isolate individual compounds for further structural characterization yet unsuccessful. This study is the first step towards engineering a self-luminescent plant based on a fungal enzyme-substrate bioluminescent system.
Keywords: fungal bioluminescence, engineered luminescent plants, luciferins, plant methabolites
Funding: this work was supported by the Russian Science Foundation (Grant No. 14-50-00131).
Acknowledgements: the authors thank Lyudmila Abramova and Nikita Tikhomirov for their assistance in collecting and sorting plant samples. The present research was carried out at the facilities of the Shared Resource Center of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry.
gg Correspondence should be addressed: Elena Guglya
ul. Ostrovltyanova, 1, Moscow, Russia, 117997; [email protected]
Recieved: 19.02.2017 Accepted: 10.04.2017
Биолюминесценция (БЛ) — это видимое свечение живых организмов. Этот феномен был впервые продемонстрирован in vitro более ста лет назад Dubois [1]. Исследователь смешивал полученные холодным и горячим способами вытяжки из тканей светящихся органов жуков Pyrophorus noctilucus. Экстракт, приготовленный в холодной воде, содержал термолабильный фермент люциферазу, а полученный в горячей воде экстракт содержал термостабильный люциферин. Таким образом, испускание света смесью двух экстрактов было результатом фермент-субстратной
реакции. Термин «биолюминесценция» впервые использовал Harvey [2]. Во всех известных биолюминесцентных системах в реакции участвует кислород, в результате происходит образование продукта реакции — оксилюци-ферина. Переход молекулы оксилюциферина из возбужденного состояния в основное сопровождается световым излучением.
Биолюминесценция широко распространена в царствах животных и грибов, но люминесцентного растения в природе не известно ни одного [3]. Более 30 лет назад
была предпринята первая попытка создания искусственного светящегося растения [4]. На основе хорошо изученной БЛ системы светляка было получено биоинженерное растение Nicotiana tabacum путем внедерения в него гена люциферазы. При смешении экстракта такого растения и раствора люциферина и АТФ или же при погружении ин-тактного растения в указанный раствор обнаруживалось БЛ свечение. Изображение светящегося растения было продемонстрировано при его экспозиции на рентгеновской пленке. Позже было выполнено еще несколько работ [5, 6], а недавно даже открыт проект по созданию светящегося растения [7], но принципиально новых результатов не было получено. Результаты наших последних исследований БЛ высших грибов дали основание полагать, что можно достичь большего, используя особенности этой фермент-субстратной системы.
Если у животных биолюминесцентные системы специфичны для каждого таксона, то механизм люминесценции высших грибов, напротив, единообразен [8]. В 1961 г. в БЛ грибов было выделено два этапа [9]. Сначала предшественник люциферина восстанавливается НАД(Ф)Н-зависимым ферментом в истинный люциферин, который затем окисляется кислородом воздуха в результате катализируемой люциферазой реакции и производит видимое световое излучение с длиной волны 520-530 нм [10]. После многочисленных безуспешных попыток [11, 12] предшественник люциферина все же был выделен из плодового тела нелюминесцентного гриба Pholiota squarrosa; им оказался гис-пидин (6-(3,4-дигидроксистирил)-4-гидрокси-2-пира-нон) [13] — хорошо известный вторичный метаболит растений и грибов [14] (табл. 1). В этой же работе гиспидин удалось энзиматически преобразовать в люциферин, который оказался 3-гидроксилированным производным гис-пидина [13] (рис. 1).
Из литературных источников известны работы по выделению гиспидина и его производных из таких растений, как Alpinia zerumbet [15-17], Pistacia atlantica [18], Peganum harmala [19], Pteris ensiformis Burm [20], Cassia alata [21], Rheum tataricum [22] и прочих (табл. 1). Широкая распространенность гиспидина среди растений и грибов, а также существование похожих соединений среди метаболитов растений натолкнуло нас на мысль о возможности создания автономно люминесцентного биоинженерного растения путем внедрения гена люциферазы в растение, способное синтезировать субстрат этого фермента. Как и другие метаболиты растений, производные гиспидина сейчас являются объектом пристального внимания ис-
следователей, работающих в области фармацевтики. Гиспидин и его производные проявляют биологическую активность, имеют антиоксидантные и противоопухолевые свойства, а также способны предотвращать ожирение, и они рассматриваются в качестве возможной основы для разработки лекарственных средств [16-19].
Таблица 1. Растения, содержащие гиспидин и его производные
Наименование соединения Структура Растение Ссылка
Гиспидин OH Ц Г о Alpinia zerumbet [15-17]
Pistacia atlantica [18]
Peganum harmala [19]
5,6-Дегидрока-ваин ц Г о Alpinia zerumbet [15-17]
Дигидро-5,6-де-гидрокаваин Г о Alpinia zerumbet [15-17]
Гиспидин 4-0-р-й-глюкопи- ранозид он но^^и сн2он ^ но'-Ло Ло но^Ао^^о он Pteris ensiformis Burm [20]
Бис-норянгонин он ц го Cassia alata [21]
Rheum tataricum [22]
Свет
Предшественник люциферина грибов гиспидин
OH
Люциферин грибов
Рис. 1. Механизм люминесценции грибов
Целью нашей работы был поиск субстрата(ов) реакции грибной биолюминесценции в растениях, произрастающих в европейской части России, и выделение соответствующих активных соединений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Экстракты растений
Все образцы растений были собраны в июне 2015 г. на биостанции «Озеро Молдино» Московской гимназии на Юго-Западе № 1543 (Тверская область) (табл. 1S, представлена в электронной версии статьи на сайте журнала). Собирали только листья. Все образцы были заморожены и хранились при температуре -70 °C; некоторые были высушены под вакуумом.
При первоначальном скрининге растений в качестве растворителя был использован ацетон. Извлечение целевых компонентов из растительного сырья — хорошо разработанная группа методов [23]. Для получения экстракта часть листа весом 30-500 мг помещали в пробирку объемом 2 мл, содержавшую 0,3-1,5 мл растворителя, и смешивали в течение 20 мин в шейкере BioShake XP (Analytik Jena AG, Германия) при скорости 1800 об/мин при комнатной температуре. Затем экстракт переносили в другую пробирку и центрифугировали при температуре 5 °C и ускорении 10 000 g на центрифуге Centrifuge 5424 R (Eppendorf, Германия). После чего полученный раствор мог быть использован для твердофазной экстракции (ТФЭ) или разделения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или же высушен в вакууме на центрифуге miVac Duo (SP Scientific, США). Перед проведением дальнейших операций высушенный остаток повторно растворяли в соответствующем растворителе и центрифугировали. Состав экстрагирующего растворителя для высушенного остатка мог быть отличен от растворителя при первой экстракции, в частности, к органическому растворителю добавляли буферный раствор.
Для выполнения ТФЭ использовали картриджи С18 (500 мг; РИепотепех, США). На картридж наносили исходный экстракт объемом 0,5-1 мл, затем производили смыв образца с сорбента, последовательно меняя состав растворителей (каждая ступень объемом 1-2 мл): вначале смесью ацетонитрила и воды в соотношении 1 : 1, затем ацетонитрилом и ацетоном.
Ферментные экстракты грибов были приготовлены, как описано в работе [13].
Биолюминесцентный анализ
Для анализа смешивали два компонента: экстракт грибного фермента и органический растительный экстракт. Разбавленный экстракт ферментов гриба в объеме 3 мкл и органический растительный экстракт в объеме 3, 10 или 15 мкл добавляли в пробирку, содержащую 100 мкл буфера (при концентрации ЫаН2Р04 0,2 М и Ыа2В04 0,5 М и рН 8,0) с 0,1 % \1-додецил-р^-мальтозида, смесь взбалтывали и немедленно помещали в кювету люминометра ЭЬтах 20/20 (Рготеда, США). Люминесценцию измеряли в течение 10 с; время интегрирования сигнала составляло 1 с (табл. 2). В качестве органических экстрактов, содержащих потенциальный субстрат, тестировались экстракты из листьев, экстракты из сушеных остатков первых экстрактов, фракции после ТФЭ или же фракции после ВЭЖХ.
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Разделение методом ВЭЖХ проводили на хроматографе Ыехега Х2 (ВИтаСги, Япония), оснащенном автодозатором Б11_-30АС, диодно-матричным детектором SPD-M20A и коллектором фракций РЯС-10А. Были использованы разные хроматографические колонки (табл. 3). Колонки и детектор не термостатировались (находились при комнатной температуре), температура автодозатора составляла 5 °С. Состав подвижной фазы: компонент А — водный раствор ацетата аммония в концентрации 0,02 М
Таблица 2. Образцы для измерения биолюминесценции
Рисунок/таблица Приготовление образца Растворитель/общий объем, мкл Объем для измерения, мкл
Табл.4 Экстракт замороженных листьев, из 100 мг Ацетон/300 3
Рис. 2 Экстракт мороженых листьев P. natans в ацетоне, из 100 мг, объем экстракта 300 мкл, высушен и растворен повторно Растворитель АВ*/100 3
Рис. 3; 4, А, Б (синий) Экстракты сухих листьев R. nigrum (A) и B. pendula (Б), из 100 мг ЕЮН/1000 МеОН/1000 3 3
Рис. 3; 4, А, Б (красный) ТФЭ фракции тех же экстрактов Ацетон/1000 3
Рис. 3; 4, В Экстракт листьев B. pendula, из 100 мг свежих и мороженых, из 50 мг сушеных МеОН/1000 10
Рис. 4 ВЭЖХ фракции экстракта B. pendula, 500 мкл, высушены и растворены повторно Ме0Н/50 10
Рис. 5 ВЭЖХ фракции экстракта P. natans, 1000 мкл, высушены и растворены повторно Растворитель АВ/100 10
Рис. 6 ВЭЖХ фракции экстракта B. pendula, 1000 мкл, высушены и растворены повторно Ме0Н/50 10
Рис. 7 ВЭЖХ фракции экстракта P. natans, 300 мкл, высушены и растворены повторно Растворитель АВ/50 15
Рис. 8, А ВЭЖХ фракции экстракта P. natans, 500 мкл Элюент для ВЭЖХ/500 10
Рис. 8, Б ВЭЖХ фракции экстракта P. natans, 500 мкл Элюент для ВЭЖХ/500 10
Примечание. * — АВ, бинарный растворитель (A — ацетон, B — 0,1 M NH4Ac, pH 6,5).
при pH 5,5, компонент B — ацетонитрил, метанол или ацетон (состав и градиент подвижной фазы представлены в табл. 3). Ацетонитрил и метанол были со степенью чистоты «для ВЭЖХ», ацетон — «х. ч.».
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для обнаружения люцифериноподобных субстратов в так-сономически различных растениях был проведен скрининг собранной коллекции 200 образцов. Каждый приготовленный растительный органический экстракт смешивали с раствором грибного фермента и сразу же измеряли его люминесценцию. В итоге было обнаружено 10 люминесци-рующих образцов растений (табл. 4).
Если для первоначального скрининга мы использовали один растворитель — ацетон, то для достижения максимальной люминесценции образца с обнаруженным активным субстратом состав растворителей варьировали. Это приводило к некоторой количественной разнице в наблюдаемых значениях БЛ. Высушивание экстракта и повторное растворение в меньшем объеме растворителя позволяло сконцентрировать образец в несколько раз. Для повторного растворения сухого остатка к органическому растворителю мог быть добавлен буфер с тем или иным значением рН, причем значение рН могло быть критичным для сохранности активности экстракта. Так, для работы с замороженными листьями P. natans наилучшими
оказались следующие условия: экстракция ацетоном из растения (первый экстракт) и использование смеси ацетона с водно-ацетатным буфером (pH 6,5) в соотношении 7 : 3 для повторного растворения сухого остатка (рис. 2).
Все экстракты люминесцентно активных растений были проверены на стабильность. Они были высушены и растворены повторно, затем выдержаны в течение нескольких часов при температуре 0 °C и при комнатной температуре. Измерение БЛ активности после каждой операции показало, что все субстраты нестабильны (табл. 4). В результате сушки люминесцентная активность снижалась более чем на 50 %. Самая большая величина интенсивности биолюминесценции была установлена для экстракта P. natans, и она уменьшилась на порядок после того, как экстракт выдержали некоторое время при комнатной температуре.
При выдержке экстрактов на льду обнаружено заметное увеличение во времени БЛ активности экстрактов, по крайней мере в течение нескольких часов. Его наблюдали для многих образцов растений (табл. 4, рис. 3, A, Б). В частности, для R. nigrum зафиксировано 10-кратное увеличение. Временные зависимости биолюминесцентной активности различались не только для разных видов растений, но и для экстрактов одного вида, полученных из растительного материала, обработанного по-разному (свежих, сушеных и замороженных листьев), а также экстрактов и полученных методом ТФЭ фракций тех же экстрактов. Экстракты сухих листьев B. pendula проявили
Таблица 3. Параметры ВЭЖХ
Рисунок Колонка Подвижная фаза*, компонент В Образец
5 Discovery C18, 5 мкм, 4,6 х 150 мм МеСМ, градиент 30-90 % при 0-5 мин, 90 % при 5-10 мин, скорость потока 1 мл/мин Замороженные листья P. natans, 300 мг в 1 мл ацетона, 500 мкл экстракта высушено и растворено в 130 мкл бинарного растворителя, объем на колонку 100 мкл
6 ZORBAX SB-C18, 5 мкм, 9,4 х 150 мм МеОН, градиент 60-100 % при 0-6 мин, 100 % при 6-45 мин, скорость потока 2 мл/мин Свежие листья B. pendula, 400 мг в 1500 мкл MeOH; фракция после ТФЭ, ввод на колонку 800 мкл активной фракции в MeCN
7 TSK ODS-120T, 5 мкм, 4,6 х 250 мм Ацетон, градиент 40-90 % при 0-7 мин, 90 % при 7-30 мин, скорость потока 1 мл/мин Высушенные листья P. natans, 50 мг в 500 мкл бинарного растворителя, объем на колонку 200 мкл
8, A Lichrosorb Diol, 10 мкм, 4,6 х 250 мм МеСМ, градиент 90-80 % при 0-7 мин, скорость потока 1 мл/мин Замороженные листья P. natans, 70 мг на 200 мкл ацетона, объем на колонку 100 мкл
8, Б Synergi Polar RP 80A, 4 мкм, 2 х 150 мм МеСМ, градиент 70-95 % при 0-5 мин, 95 % при 5-14 мин, скорость потока 0,7 мл/мин Фракция между 3 и 3,5 мин первой хроматографии, сконцентрированная до 100 мкл
Растение Интенсивность люминесценции экстракта замороженных листьев, отн. ед. Интенсивность люминесценции перерастворенного экстракта, %
в сравнении с исходным экстрактом после выдержки в течение 2 ч при 20 °С в сравнении с люминесценцией до этой процедуры после выдержки в течение 2 ч при 0 °С в сравнении с люминесценцией до этой процедуры
Andromeda polifolia 6 600 30 35 нет данных
Betula pendula 11 500 25 40 90
Chamardaphne calyculata 7 900 35 40 120
Potamugeton natans 290 000 25 6 150
Pyrola rotundifolia 1 500 55 70 130
Ribes nigrum 11 000 40 30 330
Ribes rubrum 8 500 35 20 140
Salix aurita 11 000 20 15 нет данных
Salix pentandra 10 000 30 15 60
Stachys sylvatica 11 000 20 25 нет данных
Примечание. * — компонент A — 0,02 M NH4Ac, pH 5,5. Таблица 4. Биолюминесцентная активность экстрактов растений
80 000
60 000 -
40 000 -
20 000
-1---1---1---1---1---1
0 10 20 30 40 50
Компонент В, об. %
Рис. 2. Зависимость биолюминесценции от содержания компонента B в бинарном растворителе АВ (A — ацетон, B — 0,1 M NH4Ac, pH 6,5) для высушенного и повторно растворенного экстракта P. natans
стабильность, зато уровень биолюминесценции экстрактов замороженных и свежих листьев значительно увеличился (рис. 3, В). Кроме того, часто (но не всегда) 10-се-кундные кинетические кривые при измерении БЛ экстрактов B. pendula были восходящими, хотя обычно они являются нисходящими (рис. 4).
Основываясь на том, что самое большое значение люминесценции исходного экстракта было зафиксировано у образцов P. natans, этот вид был выбран в качестве кандидата для продолжения эксперимента, а именно выделения биолюминесцентного субстрата методом ВЭЖХ. Оптимизированный состав подвижной фазы для ВЭЖХ на колонке типа С18 отличался по сравнению с условиями для выделения 3-гидроксигиспидина: как компонент A использовали водно-ацетатный буфер в концентрации 0,02 M при pH 5,5 (в отличие от 0,1 % муравьиной кислоты для 3-гидроксигиспидина). Содержание органического компонента В было увеличено и при градиентном элюиро-вании достигало 95 %.
Фракции после ВЭЖХ были высушены вакуумно, заново растворены с 20-кратным концентрированием, после чего была измерена их БЛ активность (рис. 5). В полученном хроматографическом профиле образца были отмечены две области, содержащие люминесцентно активные компоненты, что указывало на содержание более чем одного субстрата. Контур ультрафиолетового/видимого излучения в диапазоне 200-800 нм свидетельствовал о наличии многих неразделенных компонентов в областях люминесцентной активности.
Для получения большего количества нестабильного субстрата при хроматографировании мы вносили различные модификации в используемый нами метод, а также выбирали для тестирования другие виды растений. На рис. 6 показан результат одного из разделений. В качестве материала использованы свежие листья B. pendula. Исходный экстракт из 400 мг листьев экстрагировали в 1500 мкл метанола и 1000 мкл этого экстракта фракционировали на картриджах C18. Была измерена активность фракций, и самая активная из них в объеме 800 мкл без предварительного высушивания была внесена на полупрепаративную колонку C18. После измерения БЛ активности фракций на 45-минутной хроматограмме было выявлено много активных зон. В самых активных фракциях в начале хроматограммы обнаружились многочисленные
300 000
250 000
200 000
^ 150 000 -
100 000
50 000
(А)
0
240
60 120 180 Время, мин
Исходный экстракт | Фракция после ТФЭ
30 000
20 000
<2 10 000
(Б)
0 60 120 180 240
Время, мин
Исходный экстракт Щ Фракция после ТФЭ
100 000
е 80 000
и 60 000
40 000
5 20 000 -
(В)
0 30 75 120 165 210 Время, мин
I Свежие листья И Замороженные И Высушенные
Рис. 3. Зависимость биолюминесценции от времени для экстрактов листьев и ТФЭ фракций, выдержка при 0 °C: (A) — R. nigrum; (Б) — B. pendula; (В) — экстракты из свежих, мороженых и сушеных листьев B. pendula
0
0
0
6000 -1
4000
2000
"1-г
3
"1-г
5
п—г
7
Время, с | Нормальная кривая ■
"1—Г
9
Нетипичная кривая
Рис. 4. Кривые измерения биолюминесцентной активности двух фракций B. pendula, после ВЭЖХ
неразделенные пики, несколько активных фракций присутствовали в конце хроматограммы. Никакой корреляции между основными хроматографическими пиками и люминесцентной активностью установить было невозможно. Следует отметить, что биолюминесцентная активность, как правило, сопровождалась наличием зеленой окраски фракций (поглощение около 650 нм). Была проведена попытка разделения отдельных фракций на той же колонке, но из-за химической нестабильности биолюминесцентная активность после повторной хроматографии не выявилась.
В следующем опыте была сделана попытка использовать ацетон в качестве компонента подвижной фазы для ВЭЖХ. Ацетон не вполне подходит при спектрофотоме-трическом детектировании, так как поглощает в нижней области спектра (300 нм и менее). Учитывая имеющиеся данные, мы предположили, что биолюминесцентные субстраты должны поглощать в области более 300 нм, и это позволяет использовать ацетон. Полученная хрома-
тограмма и профиль активности показаны на рис. 7. Результаты измерений указывают на присутствие нескольких активных компонентов. Однако величина активности и соответствующая масса активных компонентов были недостаточно высокими, чтобы перейти к второй ступени хроматографии.
И наконец, кроме вышеперечисленного, для экстракта P. natans мы применили двумерную хроматографию с быстрым разделением на полярной колонке и последующим разделением самой активной фракции на колонке с обращенной фазой (рис. 8). Чтобы минимизировать потери вещества и сохранить максимальное количество субстрата, исходные экстракты и фракции перед измерением активности не высушивались. Самая активная фракция, отмеченная между 3 и 3,5 мин хроматограммы на первой колонке, была сконцентрирована до 100 мкл и нанесена на вторую колонку. На хроматограмме второго разделения было выделено два пика в районе 11,5 и 12 мин, но разделение было неполным, а интенсивность люминесценции оказалась низкой.
Была проведена оценка потерь активных соединений в P natans на каждом шаге разделения путем соответствующего измерения БЛ (табл. 5). Рассчитывали общую активность растворов исходных экстрактов и фракций с учетом изменения их объемов. Оказалось, что потери происходили после каждой операции и к концу эксперимента сохранялось лишь 0,2 % исходной величины активности.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Изучение образцов листьев растений, содержащих соединения с БЛ активностью, показало, что наша первоначальная гипотеза о присутствии в них гиспидина или 3-гидроксигиспидина не подтвердилась. Во всех случаях для реакции люминесценции не требовалось присутствия НАД(Ф)Н, что указывало на большее сходство активных растительных компонентов, необходимых для люминесценции, с грибным люциферином, но не с гипидином. Однако при выборе условий хроматографии, аналогичных тем, что были использованы при выделении грибного
Рис. 5. Разделение экстракта P. natans методом ВЭЖХ (УФ-детектор при 430 нм; синяя линия), люминесценция фракций (красная линяя) и состав подвижной фазы (голубая линия). Остальное в табл. 2 и 3
0
Рис. 6. Разделение методом ВЭЖХ и люминесценция экстракта B. pendula: (A) — профиль ультрафиолетового/видимого излучения; (Б) — хроматограмма (синяя линия) и биолюминесцентная активность (красная линия). Остальные условия в табл. 2 и 3
люциферина [13], никаких активных компонентов во фракциях ВЭЖХ выявить не удавалось.
Наличие многих активных фракций при хроматогра-фическом разделении экстрактов свидетельствует о том, что каждое растение синтезирует не одно, а несколько соединений, являющихся субстратами для люцифера-
зы гриба. Кроме того, различие хроматографических условий для разделения компонентов экстрактов разных растений показывает, что наборы таких соединений весьма разнообразны.
Обнаруженное при выдержке экстрактов на льду аномальное увеличение во времени биолюминесцентной
(А)
(Б)
Рис. 7. Разделение экстракта Р. natans методом ВЭЖХ с использованием ацетона в качестве компонента подвижной фазы: ДО — хроматограмма (УФ-де-тектор при 430 нм; синяя линия), (Б) — часть хроматограммы между 10 и 17 мин (синяя линия), люминесценция фракций (красная линия) и состав подвижной фазы (голубая линия). Остальное в табл. 2 и 3
активности органических экстрактов позволяет предполагать, что в них могут протекать реакции, приводящие к снижению концентрации одних активных соединений и повышению концентрации других соединений. Однако ни одного стабильного субстрата обнаружить не удалось, так как люминесценция экстрактов всех 10 растений быстро снижалась при комнатной температуре.
Нами были применены различные модификации методов подготовки экстрактов и их сепарации, чтобы определить, какой вариант позволит удовлетворить противоречивым требованиям максимального извлечения, максимальной сохранности и селективного выделения индивидуального нестабильного соединения из сложной смеси растительного экстракта. В одних случаях экстракты предварительно фракционировали с помощью ТФЭ перед проведением ВЭЖХ, а в других — сразу вводились на хроматографическую колонку. Для дополнительного концентрирования мы пробовали сушить экстракты и повтор-
но растворять в меньшем объеме растворителя, это же касалось растворов хроматографических фракций перед измерением люминесценции; использовали разные органические растворители как компоненты подвижной фазы для ВЭЖХ; применили последовательную хроматографию на колонках разной полярности (двумерную хроматографию).
К сожалению, стабильность всех обнаруженных активных соединений оказалась недостаточной для достижения поставленной цели — выделения какого-либо субстрата в количестве, достаточном для установления его структуры и свойств.
ВЫВОДЫ
В природе не существует биолюминесцентных растений, поэтому их создание методами синтетической биологии
Рис. 8. Разделение экстракта Р. natans методом двумерной ВЭЖХ: хроматограммы (УФ-детектор при 430 нм; синяя линия), люминесценция (красная линия) и состав подвижной фазы (голубая линия). (А) — колонка с диольной фазой, (Б) — колонка с обращенной фазой. Остальное в табл. 2 и 3
Таблица 5. Потери активности в процессе разделения (к рис. 8)
Фаза Активность а, отн. ед. Общая активность А**, отн. ед. Общая активность по сравнению с предыдущей, % Общая активность по сравнению с исходной, %
Экстракция 280 000 100/1 28 000 000 100 100
Хроматография, этап 1 52 000 500/10 260 000 9 9
Фракционирование 45 000 500/10 230 000 87 8
Сушка 27 000 100/3 890 000 39 3
Хроматография, этап 2 6 500 500/10 33 000 37 1
Фракционирование 1 200 500/10 59 000 18 0,2
Примечание. * — У1 — общий объем раствора, У2 — объем раствора для измерения; ** — А = а ■ У1/У2.
представляет собой интересную задачу. В результате проведенного исследования мы выяснили, что некоторые компоненты растений могут реагировать с люциферазой гриба и реакция сопровождается люминесценцией. Все потенциальные субстраты, содержащиеся в изученных в данной работе растениях, оказались химически нестабильными, что не позволило провести их выделение и охарактеризовать химическую структуру. Тем не менее настоящая работа позволяет сделать следующие выводы, полезные для дальнейших попыток создания автономно люминесцентных растений: люминесцентные субстраты
люциферазы, имеющиеся в экстрактах растительного сырья, не идентичны грибному люциферину (3-гидрокси-гиспидину); изученные виды растений синтезируют множество различных активных соединений. Таким образом, наше исследование можно считать первым шагом в создании люминесцентного растения. По-видимому, наиболее перспективным направлением дальнейшей работы по созданию люминесцентных растений представляется поиск генов, ответственных за синтез 3-гидроксигиспидина, а также гена люциферазы грибов, и экспрессия этих генов в трансгенных растениях.
Литература
1. Dubois R. Fonction photogenique des pyrophores. C R Seances Soc Biol Fil. 1885; 37: 559-62. French.
2. Harvey EN. A History of Luminescence from the Earliest Times Until 1900. Philadelphia, USA: American Philosophical Society; 1957.
3. Shimomura O. Bioluminescence: Chemical Principles and Methods. Singapore: World Scientific Publishing; 2006.
4. Ow DW, DE Wet JR, Helinski DR, Howell SH, Wood KV, Deluca M. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants. Science. 1986 Nov 14; 234 (4778): 856-9.
5. Koncz C, Olsson O, Langridge WHR, Schell J, Szalay AA. Expression and assembly of functional bacterial luciferase in plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 Jan; 84 (1): 131-5.
6. Barnes WM. Variable patterns of expression of luciferase in transgenic tobacco leaves. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Dec; 87 (23): 9183-7.
7. Evans A. Glowing Plants: Natural Lighting with no Electricity. Kickstarter campaign [Internet]. [cited 2017 Apr 3]; [about 20 screens]. Available from: https://www.kickstarter.com/projects/ antonyevans/glowing-plants-natural-lighting-with-no-electricit
8. Oliveira AG, Desjardin DE, Perry BA, Stevani CV. Evidence that a single bioluminescent system is shared by all known bioluminescent fungal lineages. Photochem Photobiol Sci. 2012 May; 11 (5): 848-52.
9. Airth RL. Characteristics of cell-free fungal bioluminescence. In: McElroy WD, Glass B, editors. Light and Life. Baltimore, Md.: Johns Hopkins Press; 1961. p. 262-73.
10. Airth RL, Foerster GE. The isolation of catalytic components required for cell-free fungal bioluminescence. Arch Biochem Biophys. 1962 Jun; 97: 567-73.
11. Isobe M, Uyakul D, Goto T. Lampteromyces bioluminescence. II. Lampteroflavin, a light emitter in the luminous mushroom Lampteromyces japonicus. Tetrahedron Lett. 1988; 44: 1169-72.
12. Hayashi S, Fukushima R, Wada N. Extraction and purification of a luminiferous substance from the luminous mushroom Mycena chlorophos. Biophysics (Nagoya-shi). 2012 Jul 6; 8: 111-4.
13. Purtov KV, Petushkov VN, Baranov MS, Mineev KS, Rodiono-va NS, Kaskova ZM, et al. The Chemical Basis of Fungal
Bioluminescence. Angew Chem Int Ed Engl. 2015 Jul 6; 54 (28): 8124-8.
14. Lee IK, Yun BS. Styrylpyrone-class compounds from medicinal fungi Phellinus and Inonotus spp., and their medicinal importance. J Antibiot (Tokyo). 2011 May; 64 (5): 349-59.
15. Tu PTB, Tawata S. Anti-Obesity Effects of Hispidin and Alpinia zerumbet Bioactives in 3T3-L1 Adipocytes. Molecules. 2014 Oct 15; 19 (10): 16656-71.
16. Be Tu PT, Chompoo J, Tawata S. Hispidin and related herbal compounds from Alpinia zerumbet inhibit both PAK1-dependent melanogenesis in melanocytes and reactive oxygen species (ROS) production in adipocytes. Drug Discov Ther. 2015 Jun; 9 (3): 197-204.
17. Nguyen BC, Taira N, Tawata S. Several herbal compounds in Okinawa plants directly inhibit the oncogenic/aging kinase PAK1. Drug Discov Ther. 2014 Dec; 8 (6): 238-44.
18. Yousfi M, Djeridane A, Bombarda I; Chahrazed-Hamia, Duhem B, Gaydou EM. Isolation and characterization of a new hispolone derivative from antioxidant extracts of Pistacia atlantica. Phytother Res. 2009 Sep; 23 (9): 1237-42.
19. Benarous K, Bombarda I, Iriepa I, Moraleda I, Gaetan H, Linani A, et al. Harmaline and hispidin from Peganum harmala and Inonotus hispidus with binding affinity to Candida rugosa lipase: In silico and in vitro studies. Bioorg Chem. 2015 Oct; 62: 1-7.
20. Wei HA, Lian TW, Tu YC, Hong JT, Kou MC, Wu MJ. Inhibition of low-density lipoprotein oxidation and oxidative burst in polymorphonuclear neutrophils by caffeic acid and hispidin derivatives isolated from sword brake fern (Pteris ensiformis Burm.). J Agric Food Chem. 2007 Dec 26; 55 (26): 10579-84.
21. Samappito S, Page J, Schmidt J, De-Eknamkul W, Kutchan TM. Molecular characterization of root-specific chalcone synthases from Cassia alata. Planta. 2002 Nov; 216 (1): 64-71.
22. Samappito S, Page JE, Schmidt J, De-Eknamkul W, Kutchan TM. Aromatic and pyrone polyketides synthesized by a stilbene synthase from Rheum tataricum. Phytochemistry. 2003 Feb; 62 (3): 313-23.
23. Sarker SD, Nahar L, editors. Natural Products Isolation. Methods in Molecular Biology, vol. 864. New York: Springer Science+Business Media; 2012.
References
1. Dubois R. Fonction photogenique des pyrophores. C R Seances Soc Biol Fil. 1885; 37: 559-62. French.
2. Harvey EN. A History of Luminescence from the Earliest Times Until 1900. Philadelphia, USA: American Philosophical Society; 1957.
3. Shimomura O. Bioluminescence: Chemical Principles and Methods. Singapore: World Scientific Publishing; 2006.
4. Ow DW, DE Wet JR, Helinski DR, Howell SH, Wood KV, Deluca M. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants. Science. 1986 Nov 14; 234 (4778): 856-9.
5. Koncz C, Olsson O, Langridge WHR, Schell J, Szalay AA. Expression and assembly of functional bacterial luciferase in plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 Jan; 84 (1): 131-5.
6. Barnes WM. Variable patterns of expression of luciferase in transgenic tobacco leaves. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Dec; 87 (23): 9183-7.
7. Evans A. Glowing Plants: Natural Lighting with no Electricity. Kickstarter campaign [Internet]. [cited 2017 Apr 3]; [about 20 screens]. Available from: https://www.kickstarter.com/projects/ antonyevans/glowing-plants-natural-lighting-with-no-electricit
8. Oliveira AG, Desjardin DE, Perry BA, Stevani CV. Evidence
that a single bioluminescent system is shared by all known blolumlnescent fungal lineages. Photochem Photobiol Sci. 2012 May; 11 (5): 848-52.
9. Airth RL. Characteristics of cell-free fungal bioluminescence. In: McElroy WD, Glass B, editors. Light and Life. Baltimore, Md.: Johns Hopkins Press; 1961. p. 262-73.
10. Airth RL, Foerster GE. The isolation of catalytic components required for cell-free fungal bioluminescence. Arch Biochem Biophys. 1962 Jun; 97: 567-73.
11. Isobe M, Uyakul D, Goto T. Lampteromyces bioluminescence. II. Lampteroflavin, a light emitter in the luminous mushroom Lampteromyces japonicus. Tetrahedron Lett. 1988; 44: 1169-72.
12. Hayashi S, Fukushima R, Wada N. Extraction and purification of a luminiferous substance from the luminous mushroom Mycena chlorophos. Biophysics (Nagoya-shi). 2012 Jul 6; 8: 111-4.
13. Purtov KV, Petushkov VN, Baranov MS, Mineev KS, Rodionova NS, Kaskova ZM, et al. The Chemical Basis of Fungal Bioluminescence. Angew Chem Int Ed Engl. 2015 Jul 6; 54 (28): 8124-8.
14. Lee IK, Yun BS. Styrylpyrone-class compounds from medicinal fungi Phellinus and Inonotus spp., and their medicinal importance. J Antibiot (Tokyo). 2011 May; 64 (5): 349-59.
15. Tu PTB, Tawata S. Anti-Obesity Effects of Hispidin and Alpinia zerumbet Bioactives in 3T3-L1 Adipocytes. Molecules. 2014 Oct 15; 19 (10): 16656-71.
16. Be Tu PT, Chompoo J, Tawata S. Hispidin and related herbal compounds from Alpinia zerumbet inhibit both PAK1-dependent melanogenesis in melanocytes and reactive oxygen species
(ROS) production In adipocytes. Drug Discov Ther. 2015 Jun; 9 (3): 197-204.
17. Nguyen BC, Taira N, Tawata S. Several herbal compounds in Okinawa plants directly inhibit the oncogenic/aging kinase PAK1. Drug Discov Ther. 2014 Dec; 8 (6): 238-44.
18. Yousfi M, Djeridane A, Bombarda I; Chahrazed-Hamia, Duhem B, Gaydou EM. Isolation and characterization of a new hispolone derivative from antioxidant extracts of Pistacia atlantica. Phytother Res. 2009 Sep; 23 (9): 1237-42.
19. Benarous K, Bombarda I, Iriepa I, Moraleda I, Gaetan H, Linani A, et al. Harmaline and hispidin from Peganum harmala and Inonotus hispidus with binding affinity to Candida rugosa lipase: In silico and in vitro studies. Bioorg Chem. 2015 Oct; 62: 1-7.
20. Wei HA, Lian TW, Tu YC, Hong JT, Kou MC, Wu MJ. Inhibition of low-density lipoprotein oxidation and oxidative burst in polymorphonuclear neutrophils by caffeic acid and hispidin derivatives isolated from sword brake fern (Pteris ensiformis Burm.). J Agric Food Chem. 2007 Dec 26; 55 (26): 10579-84.
21. Samappito S, Page J, Schmidt J, De-Eknamkul W, Kutchan TM. Molecular characterization of root-specific chalcone synthases from Cassia alata. Planta. 2002 Nov; 216 (1): 64-71.
22. Samappito S, Page JE, Schmidt J, De-Eknamkul W, Kutchan TM. Aromatic and pyrone polyketides synthesized by a stilbene synthase from Rheum tataricum. Phytochemistry. 2003 Feb; 62 (3): 313-23.
23. Sarker SD, Nahar L, editors. Natural Products Isolation. Methods in Molecular Biology, vol. 864. New York: Springer Science+Business Media; 2012.
