CC BY
17Ветеринарный врач. 2022 . № 2 . С. 49-55.
The veterinarian. 2022; (2):49-55.
Научная статья
УДК. 619:579.62:636.2.034
DOI 10.33632/1998-698Х.2022_49_55
Усовершенствование промышленной технологии производства сорбированной инактивированной вакцины против некробактериоза с последующем ее масштабированием
'Роман Николаевич Мельник, 1 Сергей Николаевич Ярцев, 'Николай Васильевич Мельник, 2Евгений Владимирович Сусский, 'Екатерина Андреевна Маклецова, 3Светлана Юрьевна Пигина, 4Владимир Николаевич Боровой, 5Яков Геннадьевич Панков, 1 Екатерина Михайловна Захарова
'Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, пос. Биокомбината, vnitibp@mail.ru
2Армавирская биофабрика, п. Прогресс, arm_bio@mail.kuban.ru
3Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К. И. Скрябина, Москва, rector@mgavm.ru
4Всероссийский Государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, Москва, vgnki@fsvps.gov.ru
5Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности, г. Казань vnivi@vnivi.ru
Автор, ответственный за переписку: Яков Геннадьевич Панков, vnivi@vnivi.ru
Аннотация. В статье представлены научные изыскания по производственному культивированию бактерий некробактериоза животных с использованием отечественного оборудования. Авторы усовершенствовали технологические процессы концентрирования, инактивации, очистки, полученных при культивировании бактерий. Для этого были внедрены в технологический процесс отечественные ультрафильтрационные установки центрифугирования. Оптимальный состав экспериментальной вакцины включал в себя концентрированный экзотоксин в дизентегрированной бактериальной массе и смеси адъюванта. Было изготовлено три серии экспериментальной вакцины против некробактериоза животных, которые были испытаны на крупном рогатом скоте с целью определения продолжительности иммунитета. Авторам удалось сконструировать вакцину с оптимальной дозой вакцинации, применить ее при различных температурно-климатических условиях, увеличить длительность иммунитета с 6 месяцев до 1 года, изменить метод введения с внутримышечного на подкожный. По результатам производственных испытаний было установлено, следующее:
1) опытно-промышленная серия сорбированной инактивированной вакцины против некробактериоза животных специфически активна против Fusobacterium necrophorum;
2) внутрикожное введении с помощью безыгольного инъектора типа БИ-7М в верхнюю пред- лопаточную область индуцировала образование длительного поствакцинального иммунитета сроком не менее 18 месяцев;
3) на протяжении всего периода наблюдения у подопытных животных не отмечали отрицательного влияния вакцины на физиологическое состояние животных.
Ключевые слова: вакцина, культивирование, иммуногенность, биореактор, концентрирование, адъюванты, инактивация, иммунитет
Improvement of industrial technology for the production of sorbed inactivated vaccine against necrobacillosis with its subsequent scaling up
'Roman N. Melnik, 'Sergey N. Yartsev, 1 Nikolai V. Melnik, 2Evgeniy V. Sussky, :Ekaterina A. Makletsova, 3Svetlana Y. Pigina, 4Vladimir N. Borovoy, 5Yakov G. Pankov, 'Ekaterina M. Zakharova
'Federal State Budgetary Institution "All-Russian Scientific Research and Technological Institute of Biological Industry" (141142, Moscow Region, Biocombinat, tel. : +7 (496) 567-32-63, e-mail: vnitibp@mail.ru)
2Federal state enterprise Armavir Biofactory (352212, Krasnodar Territory, Novokubansky district, Progress, 11 Mechnikova St., tel.: 8 (6195) 2-12-11, e-mail: arm_bio@mail.kuban.ru)
3Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology - K. I. Skryabin MBA (109472, Moscow, 23 Akademika Skryabin St., tel.: 8 (495) 377-91-17, e-mail: rector@mgavm.ru)
4 All-Russian State Centre for Quality and Standardisation of Medicine for Animals and Feeds (123022, Moscow, Zvenigorodskoye shosse 5, tel.: +7 (495) 982-50-84, e-mail: vgnki@fsvps.gov.ru)
5Federal Center of Toxicological, Radiation and Biological Safety (420075, Russian Federation, Republic of Tatarstan, Kazan, Nauchny gorodok-2, tel.: +7 843 239 53 20, e-mail: vnivi@vnivi.ru)
Abstract. The article presents scientific research on large-scale cultivation of bacteria of necrobacillosis in animals using domestic equipment. The authors have improved the technological processes of concentration, inactivation and purification of obtained during cultivation bacteria. For this, the authors have introduced into the technological process of domestic ultrafiltration installations centrifugation.
The optimal composition of the experimental vaccine included a concentrated exotoxin in a disintegrated bacterial mass and an adjuvant mixture. Three series of an experimental vaccine against animal necrobacillosis were produced and tested on cattle to determine the duration of immunity.
The author managed to design a vaccine with a minimum dose of vaccination, use it under different temperature and climatic conditions, increase the duration of immunity from 6 months to 1 year, change the method of administration.
According to the results of production tests, it was found that: 1) experimental industrial series of sorbed inactivated vaccine against animal necrobacteriosis is specifically active against Fusobacterium necrophorum; 2) intradermal injection using a BI-7M type needleless injector into the upper pre-scapular region induced the formation of long-term post-vaccination immunity for a period of at least 18 months; 3) throughout the entire period of observation in experimental animals the negative effect of the vaccine on the physiological state of animals was not found.
Keywords: vaccine, cultivation, immunogenicity, bioreactor, concentration, adjuvants, inactivation,
immunity
Введение. В развитии научнотех-нического прогресса ключевую роль играет биотехнология, предусматривающая, в частности, освоение новых промышленных инновационных технологий изготовления биологических препаратов для воспроизводства почв, защиты растений, повышения продуктивности животных [1].
Некробактериоз - инфекционная болезнь, характеризующаяся в основном появлением у крупного рогатого скота гнойно-некротических поражений нижних частей конечностей (межкопытной щели, рога копыт, кожи, суставов и связок), а также кожи, слизистых оболочек и внутренних органов [2]. Болезни пальцев и копытец заразной этиологии являются одними из самых распрост-
ранённых заболеваний во всех странах мира, занимающихся скотоводством [3]. В условиях промышленного животноводства проблема некробактериоза крупного рогатого скота и борьбы с ним имеет большую актуальность, ввиду массового поражения животных.
Наиболее восприимчивы к заболеванию некробактериозом - высокоудойные коровы, первотелки и бычки во второй половине откорма.
Для лечения и профилактики некро-бактериоза используют антисептические средства и дезинфицирующие ванны, однако применение их не всегда даёт желаемый результат. Использование антибиотиков также не решает в полной мере этой задачи из-за различной чувствительности и быстрой выра-
ботки резистентности к препаратам возбудителя некробактериоза и микробов-ассоци-антов. Кроме того, бессистемное использование антибиотиков обуславливает иммунно-депрессивное воздействие на организм животных.
Исходя из этого, изыскание, разработка и усовершенствование препаратов против некробактериоза является актуальной проблемой ветеринарной науки и практики.
Материалы и методы. Объектами исследования служили бактерии Fusobacterium necrophorum, промышленная технология производства инактивированной сорбированной вакцины против некробактериоза животных и особи крупного рогато скота. При проведении исследований использовались методику по диагностике, лечению и профилактике некробактериоза, пальцевого дерматита и болезней копытец крупного рогатого скота незаразной этиологии [4]
На первом этапе исследования нами изучены подходы к конструированию моновакцин ученых, изучающих профилактику нек-робактериоза животных.
Работу проводили на ФКП «Армавирская биофабрика».
Результаты исследований. Проведенный анализ подходов к конструированию вакцин многих учёных и пожелания практических ветеринарных работников позволили определить основные требования к вакцине против некробактериоза животных:
- проведение вакцинации при различных температурно-климатических условиях от плюсовой до минусовой температур окружающей среды;
- минимальная доза вакцины, обеспечивающая оптимальный иммунный статус привитого поголовья;
- длительность иммунитета на срок не менее 12 месяцев;
- способ иммунизации не нарушающий мышцы животных;
- снижение реактогенности вакцины;
- исключение перезаражения животных иными болезнями, исключив игольный метод введения;
- снижение экономических затрат при проведении ветеринарно-профилактических мероприятий.
Наработку культуральной массы проводили в реакторе, для этого в подготовленную стерильную питательную среду, охлажденную до температуры 37 °С добавляли 40 %-ный стерильный раствор глюкозы из расчета конечной концентрации в среде 0,5 %. Перед засевом, биореактор с питательной средой продували 10 - 15 минут чистым азотом, который подавали через стерильный фильтр, из расчета 50 - 60 л/мин по ротаметру при работающем перемешивающем устрой-стве.
Выращенную и проверенную на чистоту матровую культуру засевали в реактор через пробоотборник в количестве 15 % от объема питательной среды. После чего создавали избыточное давление азотом 0,05 МПа. Выращивание культуры в биореакторе проводили при температуре 37 ± 0,50С в течение 36 часов без доступа воздуха и перемешивания. После 15 часов культивирования отобрали пробу для определения рН, концентрации и морфологии микробных клеток, чистоты роста и концентрации водородных ионов.
В результате проведённых исследований установили, что по морфологии микробных клеток, полученных при культивировании, изменений не было выявлено, при посеве в отобранной пробе отмечали чистый рост типичных культивируемых бактерий, концентрация водородных ионов составила 6,2, концентрация микробных клеток по стандарту мутности БАК-10 составляла 10 млрд/см3.
При отработке процесса инактивации культуры установили, что оптимальный рН
составил 6,8 - 7,0 который доводили добавлением 10 % едкого натра и 0,4 % формалина с 37 % содержанием формальдегида.
После добавления формалина содержимое реактора тщательно перемешивали мешалкой и выдерживали при температуре 37 -38 °С в течение 15 суток с ежедневным перемешиванием по 15 минут 3 раза в день.
В результате установили, что выбранный процесс инактивации культуры соот-
ветствует технологическим требованиям, предъявляемым к промышленной технологии инактивированной вакцины против некробак-териоза.
Концентрирование токсина проводили после предварительного удаления бактериальной массы при помощи проточной высокоскоростной центрифуги СЕРА 81Н, посредством предварительной стерилизующей фильтрации, затем используя устройство для проведения тангенциальной фильтрации фирмы Владисарт АСФ-007.
Выполнение работ позволило довести содержание анатоксинов до требуемой их концентрации в антигене.
Приготовление адъюванта проводили по прописи на 100 мл готового: гидроокись алюминия (ГОА) - 6,0 см3; сапонин- 5 мг; глицерин - 94,0 см3; натриевая сукцината хитозана 1,0-5,0.
Смешивание всех ингредиентов проводили в реакторе для приготовления адъюванта. Затем стерилизовали при температуре 120 ± 2 °С в т-ечение 1 часа, охлаждали до минус 35 °С и проводили контроль стерильности путем высева на МПА, МПБ, МППБ.
На всех средах роста не отмечалось, следовательно, приготовленный адъювант был стерильным.
При отработке технологии изготовления сорбированной вакцины был отобран оптимальный состав, который состоял из концентрированного экзотоксина в дизентегри-рованной бактериальной массе и смеси адъю-
ванта.
Объединение компонентов сорбированной вакцины осуществляли в реакторе, смешивание компонентов вакцины проводили путем механического диспергирования инак-тивированной бактерийной суспензии в адъю-ванте.
Составление серии проводили после центрифугирования 60 л бактериальной сус-пезии F. песго^эгит с оптической концентрацией 6,4 млрд/см3. Бактериальную массу ресуспендировали до оптической концентрации 320 млрд/см3, в итоге получили 1200 см3 бактериальной суспензии, где содержится микробных клеток:
320 млрд/см3 х1200 см3 = 384000 млрд мк. кл, что составляет:
384000 млрд. мк. кл.: 4 млрд. мк. кл.= 96000 доз для оленей
Или 48000 доз для крупного рогатого
скота.
В результате было изготовлено три с ерии экспериментальной вакцины против некробактериоза, которые были испытаны на крупном рогатом скоте с целью определения продолжительности иммунитета.
Препарат вводили животным внутримышечно в область средней трети шеи двукратно в дозе 0,4 см3 с интервалом 4 - 6 недели и последующей ревакцинацией каждые 6 месяцев.
Взятие крови у вакцинированных животных проводили через 3, 6, 12, 18 и 24 месяца (таблица1).
№ сер. Активность иммунной сыворотки через месяц после применения
3 6 12 18 24
1 1:512 1:512 1:512 1:512 1:256
2 1:512 1:512 1:512 1:512 1:256
3 1:512 1:512 1:512 1:512 1:256
Таблица 1 - Активность сыворотки крови КРС после применения инактивированной сорбированной вакцины против некробактериоза животных в реакции нетрализации.
Полученные результаты показали, что напряженный иммунитет у крупного рогатого скота сохраняется после применения препарата продолжительностью не менее 18 месяцев.
Далее проводилось изучение специфической активности и эффективности экспериментальной серии №1 сорбированной инак-ЖУРНАЛ ДЛЯ ПРОФЕССИ
тивированной вакцины против некробакте-риоза животных.
Для этой цели были сформированы три группы животных по 30 голов в каждой и проведены предварительные серологические исследования сывороток крови на наличие титров антител к возбудителю некробактери-оза.
Было вакцинировано 90 голов крупного рогатого скота в возрасте от 6 месяцев до 2 лет, 1 группа - телята 6 месячного возраста, всего 30 голов, 2 группа - молодняк в возрасте 12 месяцев - 30 голов и 3 группа - животные возрасте 24 месяцев - 30 голов. Животных иммунизировали двойной дозой-0,4 см3 (в две точки на расстоянии 7-10 см по 0,2 см3) первый раз двукратно с интервалом 4-6 недель. Ревакцинировали через 6 месяцев, однократно двойной дозой - 0,4 см3 (в две точки по 0,2 см2). Вакцину вводили внутрикожно с помощью безыгольного инъектора типа БИ-7М в верхнюю предлопаточную область.
За привитыми животными вели клиническое наблюдение в течение 18 месяцев.
С целью определения динамики нарастания титров специфических антител проводили взятие крови у подопытных животных всех групп: до вакцинации, после первой и второй инъекции. После вакцинации через 21 сутки, 6, 12 и 18 месяцев у животных, с соблюдением правил асептики и антисептики из яремной вены отбирали пробы крови для определения в сыворотке крови специфических к некробактериозу антител. Наличие антител в сыворотке крови определяли реакцией агглютинации (таблице 2).
Таблица 2 - Динамика титров поствакцинальных антител у животных, привитых сорбированной инактивированной вакциной против некробактериоза животных
Возвратная группа Кол-во голов Кратность иммунизации Средний титр после прививки в РА
21 сутки 6 мес 12 мес 18 мес
Телята 6 месяцев 30 После 1 вакцинации 1 256 1:256 1:128 1:64
После 2 вакцинации 1 512 н/и н/и н/и
Молодняк 12 месяцев 30 После 1 вакцинации 1 256 1:256 1:128 1:64
После 2 вакцинации 1 512 н/и н/и н/и
Особи в возрасте 24 месяца 30 После 1 вакцинации 1 256 1:256 1:128 1:64
После 2 вакцинации 1 512 н/и н/и н/и
Примечание: «н/и» - не исследовали.
Как видно из представленных данных, в течение времени наблюдения у животных, вакцинированных сорбированной инакти-вированной вакциной против некробактериоза, титры поствакцинальных антител находились на уровне обеспечивающим надежную защиту от заболевания в пределах от 1:512 до 1:64. На протяжении всего периода наблюдения, не отмечали отрицательного влияния сорбированной инактивированной вакц против некро-бактериоза животных на физиологическое состояние животных.
Заключение. По результатам произ-
водственных испытаний было установлено, что длительность поствакцинального иммунитета опытно-промышленных серий сорбированной инактивированной вакцины против некробактериоза животных, введённой внутри-кожно с помощью безыгольного инъектора типа БИ-7М в верхнюю предлопаточную область, составляет 18 месяцев, вакцина безвредна, специфически активная к Fuso-ЬаСегшт песгор^гит. Случаев заболеваний и гибели от данной инфекции в хозяйствах и группах животных, где применялась разработанная вакцина, не наблюдались.
Список источников
1. Самуйленко А.Я., Беро И.Л., Гринь С.А., Научное обеспечение многопрофильных биологических производств инновационными технологиями // Вестник РАСХН, 2011. - № 1, - С. 3334.
2. А.А. Сидарчук; С.Д. Панасюк; Г.И. Устинова. Некробактериоз: прошлое, настоящее и будущие // Ветеринарная медицина. 2002. - № 16. - С. 3-4.
3. Методические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике некробактериоза, пальцевого дерматита и болезней копытец крупного рогатого скота незаразной этиологии / Д.А. Хузин, Х.Н. Макаев, А.И. Никитин, А.Н. Чернов. - Текст: непосредственный // М.: ФГБНУ «Росинформагротех». - 2017. - 41 с.
4. Изучение влияния иммунокоррегирующих препаратов на организм кроликов, вакцинированных экспериментальной вакциной против болезней копытец крупного рогатого скота / Д.А. Хузин, С.А. Юсупов, К.А. Сергейчева, Д.М. Зиганшина. - Текст: непосредственный // Новости науки в АПК. - 2019. - № 3(12). - С. 267-271.
References
1. Samuilenko A.Ya., Bero I.L., Grin 'S.A., Scientific support of multidisciplinary biological production with innovative technologies // Bulletin of the Russian Academy of Agricultural Sciences, 2011. -№. 1, - pp. 33-34.
2. A.A. Sidarchuk; S. D. Panasyuk; G.I. Ustinov. Necrobacteriosis: past, present and future // Veterinary medicine. 2002. - № 16. - P. 3-4.
3.Methodological recommendations for the diagnosis, treatment and prevention of necrobacteriosis, finger dermatitis and diseases of the hooves of cattle of non-infectious etiology / D.A. Khuzin, H.N. Makaev, A.I. Nikitin, A.N. Chernov // Moscow: FSBI "Rosinformagrotech" - 2017. - 41 p.
4. Study of the effect of immunocorregulating drugs on the body of rabbits vaccinated with an experimental vaccine against diseases of the hooves of cattle / D.A. Khuzin, S.A. Yusupov, K.A. Sergeicheva, D.M. Ziganshina // News of science in the agro-industrial complex. - 2019. - № 3 (12). - P. 267-271.
Вклад авторов:
Мельник Н.В.- научное руководство; концепция исследования; развитие методологии; участие в разработке научно-исследовательских программ и их реализации; написание исходного текста; итоговые выводы.
Сусский Е.В. - участие в разработке научно исследовательских программ и их реализации; доработка текста.
Мельник Р. Н. формирование идеи, формулировка и развитие ключевых целей и задач.
Пигина С.Ю. - проведение исследований, в частности, проведение экспериментов, сбор данных/доказательств, анализ и интерпретация полученных данных.
Боровой В.Н. - проведение исследований, в частности, проведение экспериментов, сбор данных/доказательств, анализ и интерпретация полученных данных.
Панков Я.Г. - составление черновика рукописи и его критический пересмотр с внесением ценного замечания интеллектуального содержания; участие в научном дизайне; подготовка, создание и опубликованной работы
Ярцев С.Н. - получение данных для анализа, анализ полученных данных, обзор публикаций по теме статьи
Захарова Е.М - получение данных для анализа, анализ полученных данных
Маклецова Е.А. - получение данных для анализа, анализ полученных данных
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Contribution of the authors:
Melnik N.V. - scientific management; research concept; development of methodology; participation in the development of research programs and their implementation; writing the original text; final conclusions.
Sussky E.V. - participation in the development of research programs and their implementation; text
revision.
Melnik R. N. Formation of ideas, formulation and development of key goals and objectives. Pigina S.Yu. - conducting research, in particular conducting experiments, collecting data/evidence, analyzing and interpreting the obtained data.
Borovoy V.N. - conducting research, in particular conducting experiments, collecting data/evidence, analyzing and interpreting the obtained data.
Pankov Ya.G. - drawing up a draft of the manuscript and its critical revision with the introduction of a valuable comment of intellectual content; participation in scientific design; preparation, creation and published paper
Yartsev S.N. - obtaining data for analysis, analysis of the obtained data, review of publications on the topic of the article
Zakharova E.M - obtaining data for analysis, analysis of the received data Makletsova E.A. - obtaining data for analysis, analysis of the received data Contribution of the authors: all authors contributed equally to this article. The authors declare no conflicts of interests.
Статья поступила в редакцию 29.11.2021; одобрена после рецензирования 16.03.2022; принята к публикации 30.03.2022.
The article was submitted 29.11.2021; approved after reviewing 16.03.2022; accepted for publication 30.03.2022.
© Мельник Р.Н., Ярцев С.Н., Мельник Н.В., Сусский Е.В., Маклецова Е.А., Пигина С.Ю., Боровой В.Н., Панков Я.Г., Захарова Е.М. 2022
