CC BY
58_МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ И КЛЕТО ЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ_
УДК. 57.083.13:579.62:615.371 DOI: 10.25687/1996-6733.prodanimbiol.2020.1.34-43
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПОЛИВАЛЕНТНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КЛОСТРИДИОЗОВ ЖИВОТНЫХ
1Пулотов Ф.Х., 1Девришов Д.А., 2Исматов И.А.
1 Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии -
МВА имени К.И. Скрябина, Москва, Российская Федерация; 2Институт проблем биологической безопасности (ТАСХН), Душанбе, Республика Таджикистан
Широкое применение в борьбе с клостридиозами нашли поливалентные вакцины, для изготовления которых необходимы достаточное количество бактериальной массы и токсина клостридий. Для получения значительного количества токсина и бактериальной массы целесообразно использовать питательные среды, адаптированные для глубинного культивирования в промышленных условиях. Целью данной работы было разработать рецептурный состав питательных сред и усовершенствовать промышленную технологию производства поливалентной вакцины против клостридиозов животных. Исследование включало в себя изготовление экспериментальной серии вакцины, подбор оптимального соотношения компонентов и эффективной дозы штаммов. Проводили цепочечное культивирование вакцинных штаммов клостридий во флаконах, бутылях и биореакторах на новой питательной среде на основе ливерного экстракта и казеин-пептона (г/л): ливерный экстракт - 10; казеин-пептона - 22,5; К2НРО4 - 2,3; КН2РО4 - 1,7; MgSO4 - 0,6. Метод культивирования на новой питательной среде позволил получить наиболее высокий выход бактериальной массы и токсинообразования с концентрацией микробных культур в среднем 9,8-11,0^10 кл. /см3. В опытах на лабораторных животных установлено, что экспериментальная серия поливалентной вакцины против клостридизов животных является безвредной, ареактогенной, обеспечивает выработку гуморального иммунитета с выраженным антитоксическим действием против всех штаммов клостридий, входящих в состав препарата. Предложенное усовершенствование внесено в регламент производства поливалентной вакцины против клостридиозов животных в ООО «Агровет».
Ключевые слова: клостридиозы животных, поливалентная вакцина, культуральная среда, иммуногенность, безвредность
Проблемы биологии продуктивных животных, 2020, 1: 34-43
Введение
Клостридии широко распространены в окружающей среде и являются возбудителями различных инфекционных заболеваний человека и животных. В данный момент известно более 200 видов клостридий, но лишь некоторые из них обладают токсигенностью и патогенностью. Причем отдельные виды самостоятельно не могут вызывать заболевания, но в ассоциации с другими анаэробными бактериями осложняют инфекцию. К патогенным видам относится C. botulinum, C. perfringens, C. chauvoei, C. septicum, C. fallax, C. haemolyticum, C. sordelli, C. sporogenes, C. tetani, C. histolyticum, C. novyi, которые вызывают такие заболевания как ботулизм, брадзот, эмфизематозный карбункул, анаэробная энтеротоксемия, столбняк, газовая гангрена, некротический гепатит и другие (Uzal, 2009; Songer, 2010; Sunita et al., 2013; Капустин, 2019).
Клостридиозами болеют все виды животных, что является одной из причин снижения рентабельности производства (Rood, 1991; Manteca, 2004; Berghaus, 2005; Редкозубова, 2016). В зависимости от патогенного действия клостридий, они могут оказывать механическое повреждение и токсический эффект. Некоторые возбудители продуцируют высокоактивные токсины, которые приводят к поражению нервной системы, а также к некрозу тканей. Механическое действие оказывает небольшое число возбудителей, редко и незначительно.
Возбудители клостридиозов вызывает болезнь, с острым или сверхострым течением, при этом лечение животных не всегда эффективно. Вакцинопрофилактика является основным способом предотвращения клостридиозов животных (Скляров, 2016).
Эффективность вакцин зависит от многих факторов, включая количество и качества антигена, иммуностимуляторов, адъюванта, консервантов, технологию изготовления и схему применения. Также важную роль играет иммунный статус организма животного.
Изготовление бактерийных препаратов для специфической профилактики клостридиозов животных основываются на культивировании микроорганизмов. На стадии культивирования микроорганизмов, накапливаются антигены, от которых зависит иммуногенность и эффективность препаратов. Глубинное культивирование осуществляют, как правило, в реакторах большой ёмкости.
Для культивирования микроорганизмов в промышленных условиях применяют реакторы усовершенствованных конструкций, которые снабжены термостатирующими приспособлениями, воздушными фильтрами, механическими мешалками, сифонами, системой трубопроводов которые обеспечивают стерильность, подачу воды и пара (Гринь, 2008).
Качество питательных сред также относится к числу основных факторов при культивировании бактерий, которые обуславливают эффективность производства биопрепарата (Панова, 2006). В производственных условиях при промышленном культивировании вакцинных штаммов клостридий часто специалисты сталкиваются с проблемами накопления бактериальной массы и токсинообразования микробных культур. Одним из основных факторов повышения концентрации бактериальной массы при глубинном культивировании является состав и соотношение компонентов в питательной среде (Горелов,1994).
При вакцинации против клостридиозов животных, необходимым условием является обоснование дозы компонентов, уровня интенсивности иммунитета и его длительности после проведения вакцинации и ревакцинации (Махмудов, 2016; Капустин, 2019). Поскольку разные виды клостридий являются возбудителями принципиально различных болезней, наилучший профилактический эффект даёт использование ассоциированных и поливалентных вакцин (David, 2013; Скляров и др., 2017).
Несмотря на проведенные исследования и определённые успехи в изучении природы данных заболеваний, разработке специфической профилактики и ветеринарно-санитарных мероприятий, клостридиозы животных продолжают наносить значительный ущерб животноводству и имеют большое социальное значение (Горелов, 1994; Грязнова, 1999; Kapustin et al., 2017). Проблема клостридиозов сельскохозяйственных животных до настоящего времени остается актуальной и имеет научную и практическую значимость.
Целью данного исследования было совершенствование технологии изготовления поливалентной вакцины против клостридиозов животных на основе разработки питательной среды, изготовления экспериментальной серии вакцины, подбора оптимального соотношения компонентов и эффективной дозы штаммов.
Материал и методы
Исследование было проведено на базе биотехнологического комплекса ООО «АГРОВЕТ» и на кафедре иммунологии и биотехнологии Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина». В работе использовали производственные и контрольные штаммы из коллекции ООО «АГРОВЕТ», C. perfringens тип А - №28, C. perfringens тип В - №1, C. perfringens тип С - №3, C. perfringens тип D - №91, C. novyi тип В (oedematiens) - №34, C. septicum - №1098, C. tetani - Kolle - №8 и C. chauvoei R15. Разработана питательной среды на основе ливерного экстракта (Венгрия) и казеин-пептона (Италия), (г/л): ливерный экстракт - 10; казеин-пептона - 22,5; К2НРО4 - 2,3; КН2РО4 - 1,7; MgSO4 - 0,6.
Для получения культур клостридий первой генерации с соблюдением асептики вскрывали ампулу и отсевали в пробирки на МППБ под вазелиновым маслом и культивировали в течение 24-48 ч, в зависимости от роста культуры, при температуре 370С.
Осуществляя вторую генерацию, штаммы пересевали во флаконы в объеме 0,5 дм3 на МППБ под вазелиновым маслом и культивировали при 370С в течение 24 ч в термальной комнате, затем проводили
третью генерацию - посев в бутылях. Взвесь микроорганизмов во флаконах, тщательно перемешивали и при помощи слабого разрежения перекачивали в бутыли объемом 12 дм3 с питательной средой объёмом 8,5 дм3 под вазелиновым маслом, кроме того в каждую бутыль вносили 300 см3 раствора глюкозы. Бутыли с внесённой в них культурой переносили в термальную комнату и культивировали в течение 24 ч. По окончании культивирования отбирали пробы для определения концентрации микробных клеток по оптическому стандарту мутности, чистоты роста на питательной среде и типичной морфологии в мазках, окрашенных по Граму. Концентрация анаэробных бактерий должна составлять не менее 6*109 кл./см3 по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Микробные культуры, выращенные в бутылях, после получении положительных результатов контроля использовали в дальнейшем в качестве посевного материала для масштабного культивирования в биореакторе.
Промышленное культивирование осуществляли в биореакторе, оснащённом системой контроля и регулирования основных параметров (температура, рН, обороты мешалки) глубинным способом при температуре 37±10С, подаче химически чистого азота в количестве 0,2-0,3 дм3 на 1 дм3 среды в реакторе. Культивирование прекращали в стационарной фазе роста, когда концентрация микробных культур перестаёт увеличиваться. В процессе культивирования анаэробов проводили корректировку рН среды в пределах 6,8-7,2 ед. рН с помощью 22-25%-го раствора аммиака.
Морфологию клеток и бактериологическую чистоту контролировали микроскопически. С целью определения чистоты культуры, из суспензии бактериальных клеток на предметном стекле готовили мазок, который фиксировали над пламенем горелки, а затем окрашивали по Граму и тщательно просматривали под микроскопом с использованием иммерсионного масла. Наличие посторонней микрофлоры в культурах не допускается.
Количество микробных клеток в 1 см3 взвеси устанавливали по оптическому бактериальному стандарту ГИСК. Для определения концентрации микробных культур с помощью оптического стандарта мутности, в пробирку вносили 1 см3 испытуемой культуры и небольшими порциями добавляли стерильный физиологический раствор (рН 7,2-7,4). Содержимое пробирок тщательно перемешивали и сравнивали со стандартом мутности № 10 ГИСК в потоке проходящего света.
После окончания процесса культивирования определяли общую токсичность и степень токсичности микробных культур. Смесь микробных культур вводили в дозе 0,5 см3 в разведении 1:10 двум белым мышам массой 16-18 г. Мыши должны погибнут в течение 3-20 мин.
Для определения степени токсичности культуру разводили на 1:100, 1:500, 1:1000, 1:2000 и далее до титра. Для определения токсичности C. perfringens, С. septicum и С. поуу1 тип В (oedematiens) каждое разведение вводили внутривенно по 0,5 см3 двум белым мышам, а C. tetani вводили внутримышечно в области бедра. Через 18-24 ч проводили учёт. Минимальной смертельной дозой считали то разведение, которое при введении вызывает гибель хотя бы одной мыши. Для изготовления вакцины использовали токсино-жидкость, содержащую в 1 см3 для C. perfringens тип А не менее 100 Dlm/см3, C. perfringens тип В - 600 Dlm/см3, C. perfringens типов С и D - 2000 Dlm/см3, С novyi тип В (oedematiens) - 6000 Dlm/см3, C. tetani - 5000 Dlm/см3 токсина для белых мышей массой 16-18 г.
Инактивацию бактериальной массы проводили с формалином. В суспензию анаэробов при включённой мешалке добавляли формалин до получения конечной концентрации формальдегида в смеси 0,3-0,4%. Температуру бактериальной суспензии при инактивации поддерживали на уровне 37-380С. Во время инактивации культуру перемешивали 3 раза в сутки по 10-20 мин. Длительность инактивации анаэробов составила от 3 до 7 суток.
Концентрирование токсинов проводили путем фильтрация в ультрафильтрационной установке АСФ - 020. Опытные серии моновакцины и поливалентных препаратов изготавливали из токсинов и бактерий штаммов клостридий, инактивированных формалином, и адсорбировали на геле гидрата окиси алюминия.
Компоновку поливалентных вакцин осуществляли путём объединения всех компонентов в определённом соотношении, добавляли 4%-й раствор ГОА в качестве адъюванта, физиологический раствор и тиомерсал до конечной концентрации не более 0,01%, затем тщательно перемешивали. Препарат после оценки внешнего вида проверяли на стерильность путём посева на питательных средах,
определяли безвредность на лабораторных животных, расфасовали, этикетировали, затем использовали для проведения доклинических и клинических испытаний.
Безвредность, реактогенность и иммуногенность экспериментальной серии вакцины изучали на лабораторных животных: белых мышах живой массой 16-18 г, морских свинках - 350-400 г и кроликах - 2,5-3,2 кг.
Результаты и обсуждение
Посевной материал для промышленного культивирования представлял собой чистую не контаминированную культуру производственных штаммов клостридий в вегетативной и споровой форме в соотношении 10:1 с оптической концентрацией не менее 9,0*109 кл./см3. Засев производили в стерильную питательную среду из расчёта 1 см3 посевной культуры на 1 л питательной среды с температурой 270С. Результаты культивирования производственных штаммов клостридий в бутылях представлены в табл. 1.
Таблица 1. Результаты культивирования производственных штаммов клостридий в бутылях
№ Объём Концентрация
Штаммы питательной микробных
среды, л. культур
1 С. perfrmgens тип А 9 6,2±0,1
2 С. perfrmgens тип В С. perfrmgens тип С С. perfringens тип Б 9 4,4±0,05
3 9 8,1±0,2
4 9 11,6±0,1
5 С. novyi, тип В 9 4,50,1
6 С. septicum 9 3,8±0,07
7 С. chauvoei 9 4,5±0,2
8 С. tetani 9 6,0±0,3
Примечание: продолжительность культивирования - 18-24 ч, температура - 37-380С.
Перед культивированием в биореактор вносили питательную среду на основе ливерного экстракта и казеин-пептона, стерилизовали при 120-1220С в течение 45-60 мин. После стерилизации среду охлаждали путём подачи холодной воды в рубашку биореактора и оставляли для равномерного снижения температуры по всему объёму до 37±10С.
Химические показатели готовой питательной среды:
- содержание общего азота - 500±100 мг/100 мл,
- содержание амминого азота - 200±10 мг/100 мл,
- триптофана - 70-100 мг/100 мл,
- полипептиды - 2,5-3,5 мг/100 мл,
- углеводы - 1,0-2,0%;
- рН 7,4-7,6.
При засеве в реактор вносили не менее 10 л активно растущей культуры на каждые 100 л среды. Плотность посева клостридий в биореакторах поддерживали в пределах от 500 до 800*106 кл./см3 питательной среды по оптическому стандарту мутности.
Через 2-4 ч культивирования в реактор дробно дополнительно вводили раствор глюкозы до конечной концентрации 1,0% в пересчете на сухую массу. Добавление глюкозы осуществляли в течение 3-4 ч порциями по 0,5% в час. Порции глюкозы вносили, учитывая активную реакцию среды, которая должна быть в пределах 6,8-7,2 ед. рН. Продолжительность культивирования анаэробов в биореакторе по интенсификации процесса накопления микробных клеток и пик токсинообразования составляли от 12 до 26 ч (табл. 2). По окончании процесса культивирования концентрация микробных тел по оптическому стандарту мутности была не ниже 6,0*109 кл./см3 .
Таблица 2. Результаты культивирования и концентрация микробных культур вакцинных штаммов клостридий в биореакторах
№ Концентрация, х109 кл./см3 Время рН после
Штаммы В начале После окончания культивиро- окончания
культиви- культивиро- вания, ч культивиро-
рования вания вания
1 С. perfringens тип А 0,8 6,7±0,2 16 6,81
2 С. perfringens тип В 0,8 11,1±0,3 18 6,86
3 С. perfringens тип С 0,8 8,0±0,05 16 6,82
4 C. perfringens тип D 0,8 14,6±0,1 22 7,04
5 C. novyi, тип В 0,7 7,5±0,08 24 7,01
6 C. septicum 0,5 6,1±0,09 24 6,89
7 C. chauvoei 0,8 15,1±0.1 28 7,11
8 C. tetani 0,7 9,3±0,8 24 7,09
Бактериальная масса C. perfringens тип А, на 16-й час культивирования достигла 6,7х109 кл./см3, токсичность составлала 150± 10 Dlm/см3. У C. perfringens тип В на 18-й час культивирования бактериальная масса - 11,1 х109 кл./см3, токсичность - 3400±150 Dlm/см3 и у C. perfringens тип С на 16-й час культивирования бактериальная масса - 8,3 х109 кл./см3, токсичность - 6500±200 Dlm/см3.
Рост и токсинообразование C. perfringens тип D длился 22 ч в условиях биореактора, при этом бактериальная масса составляла 14,6х109 кл./см3. Активацию протоксина проводили без удаления микробных культур. Для получения токсина C. perfringens тип D процесс активирования проводили с раствором трипсина с активностью 200 ед. из расчета 1:10. После перемешивания выдерживали в течение 3-4 ч при 380С. Токсичность C. perfringens тип D составляла 4700±100 Dlm/см3. Бактериальная масса производственных штамма C. novyi тип В к 24 ч культивирования составляла 7,5х109 кл./см3, токсичность - 5400±10 Dlm/см3.
Продолжительность культивирования штамма C. septicum составляла 24 ч, при этом выход бактериальной массы достигал 6,1х109 кл./см3. Бактериальная масса у вакцинных штаммов C. chauvoei R15 составляла 9,3 х109 кл./см3 и время культивирования - 28 ч. При культивировании штамма C. tetani в биореакторе количество вносимого посевного материала выросло от 0,8 до 15,1х109 кл./см3 в течение 24 ч, при этом токсичность составляла 8450±200 Dlm/см3.
Таким образом, проведенное культивирование вакцинных штаммов клостридий на питательной среде на основе ливерного экстракта и казеин-пептона, при глубинно-суспензионном способе в реакторе из расчета 0,5-0,8х109 кл./см3, способствовало повышению роста и увеличению бактериальной массы от 6,1 до 15,1х109 кл./см3.
По окончании культивирования бактериальные суспензии, выращенные на всех питательных средах, имели типичную морфологию, чистый рост на МППБ (газообразование, помутнение), при отсутствии роста на МПБ, МПА, агаре и бульоне Сабуро.
Инактивацию бактериальной суспензии проводили путём добавления 0,3-0,5% формалина с содержанием формальдегида не ниже 36%. Длительность инактивации связана с количеством токсинов и микробных культур в жидкости.
После проверки на полноту инактивации и стерильность, бактериальную массу и анатоксины адсорбировали на гель гидроокиси алюминия до концентрации 15-20%.
Изготовление экспериментальной серии вакцины, подбор оптимального соотношения компонентов и эффективной дозы штаммов проводили согласно действующему в настоящее время регламенту производства и инструкции по контролю поливалентной вакцины против клостридиозов животных, ООО «Агровет».
Для изготовления анатоксина, использовали токсины, полученные из культуральной жидкости с токсичностью от 3000 до 6000 Dlm/см3, только у C. perfringens тип А токсичность составляла 150 Dlm/см3. Из каждого штамма изготавливали моно-препарат в виде анатоксина и проверяли путем иммунизации кроликов, затем получили сыворотки и использовали для постановки реакции
нейтрализации на белых мышах. Все анатоксины показали иммуногенную активность у животных в объёме 0,2-0,3 см3.
Для компоновки штаммов С. septicum, С. chauvoei Я15 использовали анакультуры в концентрации не менее 6*109 кл./см3. Для оценки иммуногенности анакультур С. septicum, С. chauvoei использовали морских свинок и белых мышей, которых после двукратной иммунизации заражали вирулентными дозами возбудителей. В результате анакультуры в объёме 0,3-0,4 см3 обеспечивали 100%-ную защиту вакцинированных животных.
При конструировании поливалентной вакцины подобрали оптимальные и сбалансированные соотношения антигенов и антитоксинов, входящих в её состав: анатоксин С. perfringens тип А - 10 МЕ/мл, С. perfringens тип В - 15 МЕ/мл, С. perfringens тип С - 20 МЕ/мл, С. perfringens тип D - 30 МЕ/мл , С. тип В - 20 МЕ/мл, С. tetani - 10 МЕ/мл, а также инактивированные культуры С.
septicum - 2,0*109 кл./мл, С. chauvoei R15 - 2,5><109 кл./мл., обеспечивающие 100%-ную защиту вакцинированных животных.
Расфасовку поливалентной вакцины осуществляли при постоянно работающей мешалки в стерильные флаконы по 100 см3 с погрешностью ±3%. Флаконы с вакциной закрывали резиновыми пробками и металлическими колпачками в фасовочном аппарате.
Каждый флакон с вакциной взбалтывали и просматривали в проходящем свете. Также определяли цвет вакцины, наличие посторонней примеси и микрофлоры, не разбивающихся хлопьев, внешний вид и трещины флаконов.
На каждой флакон с вакциной наклеивали этикетку, на которой указывали: наименование вакцины, количество вакцины во флаконе в см3, номер серии, дату изготовления, срок годности, условия хранения, дозу и способ применения. Поливалентная вакцина против клостридиозов животных представляет собой суспензию серовато-желтого цвета с быстро выпадающим осадком, и легко суспендирующуюся при взбалтывании.
Для определения стерильности использовали по 5 флаконов вакцин из каждой серии. Из каждого флакона вакцины взяли пробы и подсевали по 0,2-0,3 см3 в МПБ, МПА, агар и бульон Сабуро по две пробирки с каждой средой. Также сделали посев по 0,5-1,0 см3 на МППБ.
За посевами вели наблюдение в течение 10 суток. В течение срока наблюдения все образцы высевов вакцины остались стерильными.
Для определения безвредности экспериментальной серии вакцины использовали смесь пяти флаконов (по 10 см3 из каждого). Вакцину вводили подкожно, белым мышам в объеме 0,5 см3, морским свинкам в области холки в объёме 2,0 см3. В течение 10 суток устанавливали наблюдение за вакцинированными животными. Все животные оставались живыми и клинически здоровыми. В течение всего срока наблюдения не отмечали отклонений общеклинических показателей от физиологической нормы, что свидетельствует о безвредности испытуемых вакцин и отсутствии поствакцинальных реакций на месте введения.
Для определения иммуногенной активности в отношению штаммов: С. perfringens типов А, В, С, Б, С. novyi тип В, С. tetani, вакцину вводили 6 кроликам живой массой 2,5-3,0 кг, внутримышечно в дозе 1,5 см3 с интервалом 20-25 дней.
Через 14-15 суток после повторной вакцинации у кроликов брали кровь для получения сыворотки. Сыворотку объединяли в равных объемах от каждого животного и перемешивали. Полученную пробу использовали для оценки напряженности антитоксического иммунитета в реакции нейтрализации токсинов на белых мышах.
Для постановки реакции нейтрализации использовали токсины С. perfringens типов А, В, С, Б, С. novyi тип В с установленной активностью 20 Dlm/см3 и токсин С. tetani с установленной активностью 100 Dlm/см3 для белых мышей массой 16-18 г.
Общую пробу сыворотки разливали в 6 пробирок по 1,5 см3, после чего в них вносили рабочие растворы токсинов клостридий в объеме 1,5 см3:
- в 1 -ю - С. Шani^;
- во 2 -ю - С. novyi тип В;
- в 3 -ю - С. perfringens тип С;
- в 4 -ю - С. perfringens тип Б;
- в 5 -ю - C. perfringens тип В;
- в 6 -ю - C. perfringens тип А.
Смесь токсинов с сывороткой перемешивали и помешали в термостат на 45 мин при температуре 370С для нейтрализации токсинов клостридий имеющимся антителами в сыворотке крови. Затем каждую пробу смеси токсин+сыворотка вводили 5 белым мышам внутривенно в объёме 0,5 см3 по 5 мышей на каждую пробу. Пробу с C. tetani вводили внутримышечно в области корня хвоста.
После проведения инъекций за животными наблюдали в течение 72 ч. Вакцину считали иммуногенно активной, если после введения белым мышам смеси токсина с сывороткой живыми оставались не менее 4 из 5 использованных животных при гибели не менее 4 контрольных белых мышей
Для определения активности вакцина по отношению C. septicum белых мышей заражали контрольным штаммом C. septicum № 1098, после ревакцинации. Вакцинировали 10 мышей массой 1618 г двукратно подкожно с интервалом 15 дней в области холки в дозе 0,5 см3. После ревакцинации 10 иммунизированных и 10 контрольных мышей заражали в объёме 0,5 см3 внутрибрюшинно контрольный споровой культуры штамма C. septicum №1098 в дозе 3 LD50. Учёт результатов проводили через 72 ч.
Определение имуногенной активности вакцина по отношению штамма C. chauvoei проводили на морских свинках массой 400-450 г. Вакцины вводили 5 свинкам подкожно двукратно в области холки с интервалом 20 суток в дозе 0,5 см3. Через 20 суток после вакцинации всех животных заражали внутримышечно сухой споровой культурой в дозе 20 LD50 для морских свинок (споровую культуру вводили в смеси с 0,2 см3 10%-ного раствора хлористого кальция, предназначенного для внутривенных введений). Учёт результатов проводили через 10 суток после заражения.
Таблица 3. Результаты контроля иммуногенной активности компонентов вакцины
№ Контролируемый Доза вакцина, Количество Количество % выживших
компонент см3, заражённых выживших животных
двукратное животных животных
введение
1 С perfringens тип А 0,5-0,5 5 4 80
2 C. perfringens тип В 0,5-0,5 5 5 100
3 C. perfringens тип С 0,5-0,5 5 5 100
4 C. perfringens тип D 0,5-0,5 5 5 100
5 C. тип В 0,5-0,5 5 5 100
6 С septicum 0,5-0,5 10 10 100
7 C. chauvoei 0,5-0,5 5 5 100
8 ^ tetani 0,5-0,5 5 5 100
9 Контрольные физраствор 20 0 0
животные 0,5-0,5
Результаты исследований показывают, что все штаммы, кроме C. perfringens тип А, вызывают 100%-ной иммунитет у иммунизированных лабораторных животных (табл. 3). Только C. perfringens тип А вырабатывал иммунитет в 80% случаев. В результате проведенного исследования было установлено, что экспериментальные серии поливалентной вакцины против клостридиозов животных являются стерильными, безвредными и иммуногенными в отношении всех компонентов, входящих в её состав.
Заключение
Исследования, проведенные для усовершенствования технологии изготовления поливалентной вакцины против клостридиозов животных, показали, что культивирование вакцинных штаммов клостридий на питательной среде на основе ливерного экстракта и казеин-пептона (г/л): ливерный экстракт - 10; казеин-пептона - 22,5; К2НРО4 - 2,3; КН2РО4 - 1,7; MgSO4 - 0,6, позволяет получить наиболее высокий выход бактериальной массы и токсинообразования с концентрацией микробных культур в среднем 9,8-11,0x10 кл. /см3. В опытах на лабораторных животных установлено, что
разработанная поливалентная вакцина против клостридизов животных является безвредной, ареактогенной, обеспечивает выработку гуморального иммунитета с выраженным антитоксическим действием против всех штаммов клостридий, входящих в состав препарата. Предложенное усовершенствование внесено в регламент производства поливалентной вакцины против клостридиозов животных в ООО «Агровет».
ЛИТЕРАТУРА
1. Горелов Ю.М. Биологическое и технологическое основы совершенствования средств и методов специфической профилактики сибирской язвы и клостридиозов животных: автореф. дисс... д.б.н. - Алматы, 1994 - 54 с.
2. Гринь С.А. Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов: автореф. дисс. д.б.н. - Щелково, 2008 - 51 с.
3. Грязнова Д.В. Разработка комплексных препаратов для профилактики и диагностики газовой гангрены: автореф. дисс. к.б.н. - Пермь, 1999. - 19 с.
4. Капустин А.В. Этиологическая структура и специфическая профилактика клостридиозов крупного рогатого скота и овец: автореф. дисс. д.б.н. - Москва, 2019. - 49 с.
5. Махмудов К.Б. Изучение комплексного способа иммунизации против сальмонеллёза и пастереллёза, брадзота и инфекционной энтеротоксемии на лабораторных животных // Доклады ТАСХН. - №2(12), 2016. - С 26-29.
6. Панова Н.В. Разработка нового стимулятора роста микроорганизмов и изучение его влияния на их биологические свойства на примере некоторых вакцинных штаммов бактерий: автореф. дисс. к.б.н. -Ставрополь, 2006. - 20 с.
7. Редкозубова Л.И. Контроль клостридий - систематическая вакцинация // Ветеринария. - 2016. - № 1. - С. 9-12.
8. Скляров О.Д. Изучение иммуногенной активности столбнячного компонента в составе ассоциированной вакцины против клостридиозов крупного рогатого скота // Ветеринария Кубани. - 2016. - № 4. - С. 15-17.
9. Скляров О.Д., Капустин А.В., Лаишевцев А.И., Гулюкин А.М. Интерференция компонентов в поливалентной вакцине против клостридиозов крупного и мелкого рогатого скота // Российский ветеринарный журнал. - 2017. -№ 1. - С. 20-23.
10. Berghaus R.D., Mccluskey B.J., Callan R.J. Risk factors associated with hemorrhagic bowel syndrome in dairy cattle // J. Amer. Vet. Med. Assoc. - 2005. - Vol. 226. - P. 1700-1706.
11. David M. Clostridium novyi, sordellii, and tetani: Mechanisms of disease // Anaerobe. - 2013. - Vol. 24. - P. 98-101.
12. Kapustin A.V., Laishevtsev A.I., Sklyarov O.D., Abrosimova N.S. Development of a method for monitoring the immunogenic activity of an associated vaccine against clostridiosis in cattle [Разработка метода контроля иммуногенной активности ассоциированной вакцины против клостридиозов крупного рогатого скота]. // Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences (RJOAS). - 2017. - Vol. 63. - No. 3. - P.170-175.
13. Lewis C. J. Control of important dostridial diseases of sheep // Veterinary Clinics of North America. - 2011. - Vol. 27.
- Issue 1. - P. 121-126.
14. Manteca C. Etude de l'enterotoxemie bovine en Belgique. III. Comparaison de differents protocoles d'immunisation contre la toxine ade Clostridium perfringens // Ann. Med. Veter. - 2004. - Vol. 148. - P. 147-152.
15. Rood J.I., Cole T. Molecular genetics and pathogenesis of Clostridium perfringens // Microb. Rev. - 1991. - Vol. 55. -P. 621-648.
16. Sunita S.C., Chaturvedi V.K., Gupta P.K., Sumithra T. G. Improved humoral immune response in sheep against epsilon toxoid following co-adjuvantation with gel and water in oil formulation // Small Ruminant Research, - 2013. - Vol. 114.
- Р. 188-194.
17. Songer J.G. Clostridiа as agents of zoonotic disease // Veterinary Microbiology. - 2010. - Vol. 140. - P. 399-404.
18. Uzal, F.A. Development and application of new mouse models to study the pathogenesis of Clostridium perfringens type C enterotoxemias // Infection and Immunity. - 2009. - 77(12). - Р. 5291-5299.
REFERENCES
1. Berghaus R.D., Mccluskey B.J., Callan R.J. Risk factors associated with hemorrhagic bowel syndrome in dairy cattle. J. Amer. Vet. Med. Assoc. 2005, 226 : 1700-1706.
2. David M. Clostridium novyi, sordellii, and tetani: Mechanisms of disease. Anaerobe. 2013, 24: 98-101.
3. Gorelov Yu. M. Biologicheskoe i tekhnologicheskoe osnovy sovershenstvovaniya sredstv i metodov spetsificheskoi profilaktiki sibirskoi yazvy i klostridiozov zhivotnykh (Biological and technological basis for improving the means and methods of specific prophylaxis of anthrax and animal clostridia). Extended Abstract of Diss. Dr. Sci. Biol., Almaty, 1994, 54 p.
4. Grin S.A. Sovremennyye biotekhnologicheskiye protsessy i immunologicheskiye metody pri promyshlennom proizvodstve veterinarnykh preparatov (Modern biotechnological processes and immunological methods in the industrial production of veterinary drugs) Extended Abstract of Diss. Dr. Sci. Biol., Schelkovo, 2008, 51 p.
5. Gryaznova D.V. Razrabotka kompleksnykh preparatov dlya profilaktiki i diagnostiki gazovoi gangreny (Development of complex preparations for the prevention and diagnosis of gas gangrene). Extended Abstract of Diss. Cand. Sci. Biol., 1999, Perm', 19 p. (In Russian)
6. Kapustin A.V. Etiologicheskaya struktura i spetsificheskaya profilaktika klostridiozov krupnogo rogatogo skota i ovets (Etiological structure and specific prophylaxis of clostridiosis in cattle and sheep). Extended Abstract of Diss. Dr. Sci. Biol. Moskov, 2019, 49 p. (In Russian)
7. Kapustin A.V. , Laishevtsev A.I., Sklyarov O.D., Abrosimova N.S. Development of a method for monitoring the immunogenic activity of an associated vaccine against clostridiosis in cattle [Разработка метода контроля иммуногенной активности ассоциированной вакцины против клостридиозов крупного рогатого скота]. Russian Journal of Agricultural andSocio-Economic Sciences (RJOAS), 2017, 63(3): 170-175.
8. Lewis C. J. Control of important dostridial diseases of sheep. Veterinary Clinics of North America. 2011, 27(1): 121126.
9. Manteca C. Etude de l'enterotoxemie bovine en Belgique. III. Comparaison de differents protocoles d'immunisation contre la toxine ade Clostridium perfringens. Ann. Med. Veter. 2004, 148 : 147-152.
10. Makhmudov K. B. Izucheniye kompleksnogo sposoba immunizatsii protiv sal'monelloza i pasterelloza, bradzota i infektsionnoy enterotoksemii na laboratornykh zhivotnykh (The study of a complex method of immunization against salmonellosis and pasteurellosis, bradzot and infectious enterotoxemia in laboratory animals). Dokl. TSKhA - Reports of Timiryazev Agricultural Academy. 2016, 12(2): 26-29. (In Russian)
11. Panova N.V. Razrabotka novogo stimulyatora rosta mikroorganizmov i izuchenie ego vliyaniya na ikh biologicheskie svoistva na primere nekotorykh vaktsinnykh shtammov bakterii (Development of a new stimulator of the growth of microorganisms and the study of its effect on their biological properties by the example of some vaccine strains of bacteria). Extended Abstract of Diss. Cand. Sci. Biol., Stavropol', 2006, 20 p. (In Russian)
12. Redkozubova L.I. [Clostridium control - systematic vaccination]. Veterinariya - Veterinary Medicine. 2016, 1: 9-12. (In Russian)
13. Rood J.I., Cole T. Molecular genetics and pathogenesis of Clostridium perfringens. Microb. Rev. 1991, 55: 621-648.
14. Sklyarov O.D., Kapustin A.V., Laishevtsev A.I., Gulyukin A.M. [Component interference in a multivalent vaccine against clostridiosis in cattle and small cattle]. Rossiiskii veterinarnyi zhurnal - Russian Veterinary Journal. 2017, 1: 2023. (In Russian)
15. Sklyarov O.D. Izucheniye immunogennoy aktivnosti stolbnyachnogo komponenta v sostave assotsiirovannoy vaktsiny protiv klostridiozov krupnogo rogatogo skota (The study of the immunogenic activity of the tetanus component in the composition of the associated vaccine against clostridiosis in cattle). Veterinary Medicine of the Kuban. 2016, 4: 15-17.
16. Songer J. G. Clostridiа as agents of zoonotic disease. Veterinary Microbiology. 2010, 140: 399-404.
17. Sunita S.C., Chaturvedi V.K., Gupta P.K., Sumithra T. G. Improved humoral immune response in sheep against epsilon toxoid following co-adjuvantation with gel and water in oil formulation // Small Ruminant Research, - 2013. - Vol. 114. - Р. 188-194.
18. Uzal, F.A. Development and application of new mouse models to study the pathogenesis of Clostridium perfringens type C enterotoxemias. Infection and Immunity. 2009, 77(12): 5291-5299.
Improving production technology of polyvalent vaccine against clostridiosis of animals
'Pulotov F.Kh., 'Devrishov D.A. 2Ismatov I.A.
Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology -MVA named after K.I. Scriabin, Moscow, Russian Federation; 2Institute for Biological Safety, Dushanbe, Republic of Tajikistan
ABSTRACT. Polyvalent vaccines are widely used in the fight against clostridiosis, for the manufacture of which a sufficient amount of bacterial mass and toxins of clostridia are necessary. To obtain a significant amount of toxin and bacterial mass, it is advisable to use nutrient media adapted for deep cultivation in an industrial environment. The aim of this work was to develop a prescription composition of nutrient media and improve the industrial technology for the production of polyvalent vaccine against animal clostridiosis. The study included the manufacture of an experimental vaccine series, the selection of the optimal ratio of components and the effective dose of the strains. Conducted chain cultivation of vaccine strains of clostridia in bottles, bottles and bioreactors on a developed nutrient medium based on liver extract and casein peptone (g/l): liver extract - 10; casein peptone - 22.5; K2OTO4 - 2.3; КН2Р04 - 1.7; MgSO4 - 0.6. The method of cultivation on a new nutrient medium allowed to obtain the highest yield of bacterial mass and toxin formation with a concentration of microbial cultures of an average of 9.8-11.0 * 109 cells/cm3. In experiments on laboratory animals, it was found that the experimental series of a multivalent vaccine against animal clostrid^is is harmless, areactogenic, provides the production of humoral immunity with a pronounced antitoxic effect against all strains of clostridia that are part of the drug. The proposed improvement is included in the regulation for the production of a multivalent vaccine against animal clostridiosis at Agrovet LLC.
Keywords: animal clostridiosis, polyvalent vaccine, cultivation medium, immunogenicity, harmlessness Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology, 2020, 1: 34-43
Поступило в редакцию: 30.12.2019 Получено после доработки: 13.01.2020
Пулотов Фаридун Хайталиевич - асп., тел. 8(926)738-86-894; [email protected]; Девришов Давуд Абдулсемедович - д.б.н., член-корр. РАН; Исматов Илхом Асадуллоевич - асп.
