CC BY
48
Мазуркевич А.И.1, Ковпак В.В.2 ©
'Профессор, д. вет. н.; 2к. вет. н., Национальный университет биоресурсов и
природопользования Украины
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДИК СОЗРЕВАННИЯ ООЦИТОВ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭМБРИОНОВ СВИНЕЙ IN VITRO
Аннотация
Исследовать зависимость созревания ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) свиней от их состояния и условий культивирования, а также исследовать влияние эпителиальных клеток яйцевода свиней на процесс дробления эмбрионов вне организма.
Ключевые слова: ооциты, ооцит-кумулюсные комплексы; кумулюсные клетки, созревание ооцитов, культивирование эмбрионов in vitro.
Keywords: swine oocytes, cumulus-oocyte complexes, cumulus cells, oocyte maturatio, embryo production in vitro.
За последние 20 лет генетико-биотехнологические методы предоставили возможность направленно изменять генотип животных. В противоположность спонтанным мутациям эти изменения можно заранее планировать[1].
В последние годы 12 компаний в США поставляют на фармацевтический рынок продукцию, полученную от трансгенных животных-биореакторов на сумму 3 млрд. долларов в год [6]. Такие особи имеют не свойственные им гены и соответственно белки, которые могут быть использованы при лечении многочисленных болезней человека [2]. Основной принцип получения трансгенных животных заключается в том, что генная конструкция, которая состоит из структурного гена и прикреплена к промоутеру вводится в эмбрионы, а дальше после культивирования трансплантируются реципиентам для дальнейшего развития [3]. За последние годы были получены следующие рекомбинантные белки: у коров -лактоферрин, человеческий альфа-лактоглобулин, у коз - антитромбин III, гормон роста, тканевый плазминогенний активатор, у свиней - фактор VIII, у кроликов - кальцитонин, эритропоэтин, интерлейкин-2 [4].
Установлено, что использование в качестве продуцентов трансгенных животных для получения лекарственных биологически активных веществ обходится в 5-10 раз дешевле, чем их химический синтез[5].
Исследования по созревания и оплодотворения ооцитов с-х животных вне организма могут служить базой для разработки и внедрения методов клеточной и генетической инженерии в животноводство.
Развитие и внедрение в практику животноводства методов генной и клеточной инженерии требуют большого количества зрелых яйцеклеток и эмбрионов. Решить эту проблему можно путем усовершенствования способов созревания ооцитов в культуре, их оплодотворения in vitro и развития эмбрионов вне организма.
Ооциты млекопитающих, изъятые из фолликулов яичников, восстанавливают и завершают мейотическое созревание вне организма в определенных условиях даже без гормональной стимуляции. При этом полноценное ядерное и плазматическое созревания ооцитов млекопитающих in vitro происходит только в присутствии гормонов - эстрадиола и гонадотропина. В процессе созревания ооцитов большую роль выполняют фолликулярные клетки, особенно клетки гранулезы. Этот факт объясняется возможностью синтеза клетками гранулезы специфических белков, простагландинов, выделением последними паракринных факторов роста [7].
© Мазуркевич А.И., Ковпак В.В., 2013 г.
Целью работы было усовершенствовать методику получения эмбрионов свиней in vitro. Для ее решения были поставлены следующие задачи:
- Исследовать зависимость созревания ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) от состояния кумулюса клеток и условий культивирования.
- Исследовать влияние эпителиальных клеток яйцевода свиней процесс дробления эмбрионов вне организма.
Результаты исследования.
Для получения ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) отбирали яичники на убойном пункте от клинически здоровых свиней породы крупная белая. Удаление ОКК с антральных фолликулов яичников свиней проводили в стерильных условиях путем рассечения фолликулов лезвием безопасной бритвы в среде 199 Hepes (Sigma). Удаление ОКК, их отбор и постановку на созревание, осуществляли стерильных условиях бокса. Внешний вид кумулюсных клеток и структура ооплазмы могут служить оценкой способности ооцитов к созреванию. Так, отдельные авторы указывают на значительную роль клеток кумулюса в приобретении ооцитами компетенции к оплодотворению in vitro [10].
В первой серии опытов для установления различий полноценного созревания ооцитов вне организма к стадии метафазы II мейоза нами были проанализированы две группы ОКК, изъятых из антральных фолликулов яичников свиней. Первая группа включала ОКК с плотным кумулюсом, неповрежденной прозрачной оболочкой и гомогенной невакуолизированной ооплазмой правильной округлой формы (рис. 1). Вторая группа - с ОКК с разрыхленным кумулюсом, малым количеством кумулюсных клеток, неоднородной ооплазмой (рис. 2).
Рис. 1. Ооцит-кумулюсные комплексы свиней, нативный препарат. 10х12.
Рис. 2. Ооцит-кумулюсные комплексы свиней, нативный препарат. 10х12.
Изъятые ОКК 6-кратно отмывали в среде 199, с содержанием 25мМ буфера Hepes (Sigma), 10% эмбриональной сыворотки (Sigma) и однократно промывали в среде для созревания. Ооциты созревали in vitro в течение 46 час. в чашках Петри (по 25 ОКК в 1 см3) в среде 199 на растворе Эрла (Sigma), дополненном 20% эмбриональной сыворотки (Sigma), 0,068 мг/см3 канамицина сульфата (Sigma), 0,11 мг/см3 натрия пирувата ( Sigma) и 0,1 мг/см3 глутамина (Sigma).
Критерием полноценного созревания служило выявление первого полярного тела, свидетельствующий о пребывании ооцита на стадии метафазы II мейоза (рис. 3, стрелка).
Рис. 3. Ооцит свиньи с идентифицированным полярным тельцем, нативный препарат. 10х20
Результаты исследования представлены в таблице 1.
Таблица 1
Зависимость созревания ОКК свиней in vitro от исходного состояния кумулюсных клеток
Номер группы Количество ОКК на стадии профазы II мейоза , шт. Количество ОКК на стадии метафазы II мейоза, шт./%
1 124 66/53
2 115 37/32
Данные, приведенные в табл. 1. свидетельствуют, о том что созревание ооцитов in vitro зависит от состояния ооцит-кумулюсных комплексов. Так, незрелые ооциты с плотным кумулюсом, неповрежденной прозрачной оболочкой и гомогенной ооплазмой (группа 1) оказались наиболее пригодными для созревания их вне организма, по сравнению ОКК, которые были использованы во второй группе. А именно, 53 процента ОКК первой группы прошли блок мейотического созревания на метафазе II мейоза, в то время как во второй группе 32 процента.
Во второй серии опытов изучали влияние клеток гранулезы на созревание ОКК. Культивирование ОКК осуществляли в присутствии клеток гранулезы в количестве 3-5х106 (рис. 4).
Рис. 4. Сокультивирование ОКК свиней с клетками гранулезы, нативный препарат. 10х12.
Которые выстилают стенки фолликулов, поскольку установлено, что добавление последних положительно влияет на эффективность формирования эмбрионов на доимплантационных стадиях. Доказано, что клетки гранулезы обеспечивают более полноценное ядерное и цитоплазматическое созревания ооцитов млекопитающих in vitro, что связано с их стероидной активностью, синтезом простагландинов. Кроме этого, ими синтезируется ряд белков, влияющих на состояние кумулюса гамет в период их созревания вне организма [9].
Результаты исследования представлены в таблице 2
Таблица 2
Исследование влияния сокультивирования ОКК свиней с клетками гранулезы на созревание
до метафазы II мейоза
Номер группы Количество ОКК на стадии профазы II мейоза, шт. Количество ОКК на стадии метафазы II мейоза, шт. /%
1 118 52/44
2 121 58/48
Данные, приведенные в табл. 2. свидетельствуют, что при сокультивированиии ОКК с клетками гранулезы нам удалось получить несколько выше процент созревания ОКК (группа 2) по сравнению с контрольной группой (классические условия культивирования). Разница составляла 4 процента, кроме того при добавлении клеток гранулезы, наблюдали их влияние на улучшение условий созревания ооцитов свиней при получении in vitro партеногенетических зародышей (рис. 5, стрелка).
Рис. 5. Формирование партеногенетического зародыша при созревании ооцитов in vitro,
нативный препарат. 10х20.
В третьей серии опытов изучали влияние эпителиальных клеток яйцеводов на процесс дробления эмбрионов. В первой группе культивирования эмбрионов осуществляли в стандартных условиях. Во второй группе эмбрионы культивировали на монослое эпителиальных клеток яйцеводов. Результаты представлены в табл. 3.
Таблица 3
Влияние эпителиальных клеток яйцевода на процесс дробления эмбрионов in vitro
Номер группы Количество зигот Количество эмбрионов на стадии 2-4 бластомеров шт. / % Количество эмбрионов на стадии 8-12 бластомеров шт. /%
1 90 44/48 18/20
2 90 46/51 29/32
Результаты представлены в табл. 3 свидетельствуют, что культивирование эмбрионов на монослое эпителиальных клеток имеет положительный эффект на процесс дробления эмбрионов до стадии 8-12 бластомеров (рис. 6.), Разница между группами составила 12 процентов. Таким образом, эпителиальные клетки яйцеводов способствуют прохождению эмбрионами блока дробления (2-4 клеточная стадия). В то же время, существенной разницы результатов между группами на стадии 2-4 бластомеров (рис. 7). Обнаружено не было (разница составляла 3 процента).
Рис. 6. Эмбрион свиньи на стадии 8-12 бластомеров, нативный препарат 10х30.
1
_
Рис. 7. Эмбрион свиньи на стадии 2-4 бластомеров, нативный препарат 10х20.
Выводы.
1. Мейотическое созревание ооцит-кумулюсных комплексов зависит от их морфологического состояния и условий культивирования.
2. Ооцит-кумулюсные комплексы с плотным кумулюсом, неповрежденной прозрачной оболочкой и гомогенной невакуолизированной ооплазмой правильной округлой формы более компетентны в полноценному мейотическому созреванию к стадии метафазы II мейоза по сравнению с ОКК, имеющими взрыхленный кумулюс, небольшое количество кумулюсных клеток, неоднородную ооплазму.
3. Сокультивирование ОКК с клетками гранулезы способствует созреванию ооцитов до метафазы II мейоза и формированию партеногенетических эмбрионов свиней in vitro.
4. Культивирование эмбрионов на монослое эпителиальных клеток яйцеводов имеет положительный эффект на развитие эмбрионов свиней in vitro.
Литература
1. Nicholas F. W. Genetic improvment through reproductive technology / FW Nicholas / / Animal Reproduction Science. - 1996. - № 42. - Р. 205-214.
2. Pursel V.G. Status of research with transgenic farm animal / VG Pursel / / J. Anim. Sci. - 1993. - Vol. 71. - P. 10-19.
3. Прокофьев М.И. Состояние и перспективы использования трансгенных сельскохозяйственных животных для получения биофармацевтической продукции / М.И. Прокофьев / / ДНК -технология в клеточной инженерии и маркирование признаков сельскохозяйственных животных: Междунар. конф. - Дубровицы, 2001. - С. 19-24.
4. Ward K. The genetic engineering of production traits in domestic animal / WH Wang, C.Nancarow / / Experientia.-1991.-Vol. 47.-P.913-922.
5. Эрнст Л.К. Генная инженерия в животноводстве: трансгенные сельскохозяйственные животные, кормовые растения, микроорганизмы рубца / Л.К. Эрнст, И.Л. Гольдман, С. Кадулин / / Биотехнология. - 1993. - № 5. С. 2-14.
6. Костомахин Н. Нам бы такие технологии / Н. Костомахин / / Животноводство России. - 2004. № 8-С. 13-13.
7. Ковтун С.И. Методика получения доимплантационных зародышей крупного рогатого скота и свиней вне организма / С.И. Ковтун, Д. Н. Басовская, Ю.В. Куновский / / Методики научных исследований по селекции, генетики и биотехнологии в животноводстве: наук. Сб. - М.: Аграр. Наука, 2005. -С. 192-200.
8. Кузнецова И.Б.Получение зародышей свиней методом оплодотворения in vitro / И.Б. Кузнецова, С И. Ковтун и. Др. / / Вестн. Аграрн. Науки. -1999. - № 10. С.52-55.
9. Кузнецов В.Е. Влияние клеток гранулезы на созревание, оплодотворение и дальнейшее развитие яйцеклеток коров in vitro / В.Е. Кузнецов / / Вестник проблем биологии и медицины. - 1999. Вып .. 13. - С. 29-32.
10. Ковтун С.И. Научное обоснование и совершенствование генетических методов исследования раннего эмбриогенеза сельскохозяйственных животных: Дис ... доктора с.-х. наук: 03.00.15 / Ковтун Светлана Ивановна.-К., 2008.-302с.
