CC BY
34
УДК 636.2.034:612.02
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ МОНОСЛОЙНЫХ КУЛЬТУР СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК РЕПРОДУКТИВНОГО ТРАКТА В ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ВНЕ ОРГАНИЗМА
И. В. КИРИЛЛОВА, А. И. ГАНДЖА, Л. Л. ЛЕТКЕВИЧ, В. П. СИМОНЕНКО, О. В. БУРАКОВА, О. П. КУРАК, Н. В. ЖУРИНА, М. А. КОВАЛЬЧУК РУП «Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству», г. Жодино, Минская обл., Республика Беларусь, 222160
(Поступила в редакцию 04.01.2015)
Введение. Известно, что в настоящее время в мире не существует единой, высокоэффективной технологии получения потомства крупного рогатого скота вне организма. Каждая группа ученых предлагает свою систему культивирования, в том числе и с использованием в качестве фидера монослойных культур соматических клеток репродуктивного тракта. Так, роль монослоя в культуральных системах не совсем ясна, однако после совместного культивирования оплодотворенных ооцитов с монослойными культурами соматических клеток, повышается степень дробления и развития ранних эмбрионов.
Анализ источников. А. М. Ахмолдаева [1] изучала влияние монослоя соматических клеток на преодоление клеточного блока. Оплодотворенные вне организма ооциты при достижении 6-8 бластомеров переносились на монослой соматических клеток. Первая группа не содержала соматических клеток и служила контролем, вторая группа ооци-тов культивировалась на монослое клеток кумулюса, третья - на монослое эпителиальных клеток яйцевода и четвертая - на монослое клеток гранулезы. Успешное преодоление 8-16-клеточного эмбрионального блока достигалось при сокультивировании ооцитов с монослоем гранулезных клеток (34,8 %), что на 13 % выше контроля. При сокультивировании зародышей с монослойными культурами кумулюсных клеток и эпителиальными клетками яйцевода, различия были незначительными (25,6-27,2 %).
Известно, что у коровы оплодотворение и созревание яйцеклетки происходит в верхней трети яйцевода, затем на стадии 8 бластомеров зародыш перемещается в матку. В связи с этим Н. И. Смыслова и ряд
других ученых [2] провели совместное культивирование оплодотворенных ооцитов с монослоем клеток кумулюса и гранулезы, эпителиальных клеток яйцевода и эндометрия матки. Все используемые соматические клетки оказали положительное влияние на развитие зародышей. Наибольшее их число получено при культивировании ооцитов на клетках эпителия яйцевода и матки. В таких условиях культивирования большинство зародышей достигло стадии 2-16 бластомеров. Однако стадии морулы наибольшее количество зародышей достигло при культивировании их на монослое кумулюсных клеток.
Цель работы - проведение сравнительного анализа эффективности использования соматических клеток фолликула (кумулюса и гранулезы) и репродуктивного тракта (эпителиальных клеток яйцевода и эндометрия матки), а также полученных из них монослойных культур, которые принимают непосредственное участие в созревании яйцеклетки, ее оплодотворении и развитии ранних зародышей крупного рогатого скота.
Материал и методика исследований. Исследования выполнены в лаборатории молекулярной биотехнологии и ДНК-тестирования РУП «Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству» с 2005 по 2014 годы.
Яичники, яйцеводы и рога матки убитых на мясокомбинате коров доставляли в лабораторию в среде Хенкса с добавлением антибиотиков (50 нг/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина или 50 мг/мл гента-мицина) при температуре 28-36 °С. Ооцит-кумулюсные комплексы выделяли методом рассечения ткани яичника лезвием безопасной бритвы в чашке Петри в солевом растворе Хенкса с добавлением 1 % фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 10 ед./мл гентамицина и 1 ед./мл гепарина. Поиск и морфологическую оценку качества полученных оо-цит-кумулюсных комплексов проводили по пятибалльной шкале с использованием микроскопа МБС-10 при 16-56 кратном увеличении.
Кумулюсные клетки получали пипетированием ооцит-кумулюсных комплексов (оцененных не ниже 4-5 баллов) после их инкубации в 0,1 % растворе гиалуронидазы в течение 5-10 мин. при температуре 38,7°С. Затем их переносили в чашки Петри, содержащие питательную среду под слоем минерального масла, и помещали в СО2-инкубатор на 24 часа. В другом опыте клетки кумулюса не отделяли от ооцита, а культивировали в виде комплекса.
Клетки гранулезы получали из фолликулов, отсасывая фолликулярную жидкость шприцом. Затем методом центрифугирования и ресус-пендирования отмывали клетки гранулезы трижды средой для культи-
вирования ооцитов при 3000 об/мин. по 10 мин. и помещали в чашку Петри для образования монослоя.
Получение клеток яйцевода проводили двумя способами: 1) механическим - яйцеводы сдавливали пинцетом в направлении от ампуля-рной части яйцевода к истмусу. Полученное содержимое трижды центрифугировали по 5 мин. при 1000 об/мин., а осадок дезагрегировали в том же растворе многократным пипетированием; 2) химическим -на конец яйцевода, противоположный ампулярному, накладывали лигатуру, в просвет добавляли 0,05 % раствор трипсина и перетягивали второй конец. Затем яйцеводы помещали в СО2-инкубатор при 38,7°С и 5 % СО2 в воздухе на 20 мин., промывали непосредственно в пробирке рабочей средой и дважды центрифугировали при 1000 об/мин. в течение 5 мин. Полученный осадок высевали в чашки Петри.
Клетки эндометрия матки получали двумя способами: 1) на ткани эндометрия делали Т-образный неглубокий надрез и препарировали серозную оболочку. Затем рассекали глублежащие ткани и через образовавшееся отверстие иссекали стерильными ножницами фрагменты тканей, которые помещали в среду с антибиотиками. Ткань несколько раз промывали, измельчали ножницами до размеров кусочков 1-2 мм и дезагрегировали 0,25 % раствором трипсина на магнитной мешалке. Продолжительность каждого цикла составляла 30-35 мин. Суспензию от первых трех циклов сливали, так как она содержала 70-80 % нежизнеспособных клеток. Затем, после добавления сыворотки крупного рогатого скота, проводили центрифугирование при 1000 об/мин. 15 мин. с последующим ресуспендированием осадка; 2) клетки эндометрия механически соскребали с последующим центрифугированием в физиологическом растворе с гентамицином (10 ед./мл гентамицина), а последний раз отмывали в среде для созревания ооцитов ТС-199. Полученные суспензии соматических клеток разливали в планшеты для культивирования ооцитов. Инкубацию осуществляли при 38,7 °С, содержании 5 % СО2 в воздухе и повышенной влажности (98 %). Перед культивированием подсчитывали количество клеток с помощью камеры Горяева. Каждые 48 часов меняли культуральную среду и с помощью микроскопа проводили визуальную оценку степени разрастания слоя.
Качественный состав монослоя определяли визуально, учитывая равномерность слоя, его толщину, поврежденность. После образования монослоя соматических клеток на него помещали ооцит-кумулюсные комплексы для созревания, а также эмбрионы крупного рогатого скота после оплодотворения. Созревание ооцитов проводили в среде ТС-199
(Sigma) с добавлением 100 ед./мл пенициллина и 50 мг/мл стрептомицина и 5 % фетальной сыворотки теленка при температуре 38,7 °С во влажной среде (98 %), содержащей 5 % СО2 под минеральным маслом в течение 24 часов. Эффективность использования монослойных культур фолликулярных клеток и клеток репродуктивного тракта определяли по количеству созревших ооцитов, уровню дробления, выходу морул-бластоцист, а также уровню приживляемости эмбрионов после пересадки коровам-реципиентам и выходу телят.
Созревшие на монослойных культурах ооциты оплодотворяли за-мороженно-оттаянной спермой быка после проведения процедуры ка-пацитации. Пересадку эмбрионов осуществляли нехирургическим методом на 7-8 день естественного или синхронизированного полового цикла реципиентам.
Биометрическую обработку данных проводили общепринятыми методами вариационной статистики. Достоверность разницы определяли по критерию Стьюдента при трех уровнях значимости: P<0,05; P<0,01; P<0,001.
Результаты исследований и их обсуждение. В качестве контроля ооцит-кумулюсные комплексы культивировали в среде ТС-199. В первом опыте-на предварительно полученном монослоекумулюсных клеток, во втором опыте - на предварительно полученном монослое гранулезных клеток, в третьем - на монослое эпителиальных клеток яйцевода, в четвертом - на монослое клеток эндометрия матки (табл. 1).
Т а б л и ц а 1. Эффективность применения монослойных культур соматических клеток в технологии получения ранних зародышей т\Нто
Опыт Кол-во ооцитов, n Уровень дробления, n-% Выход Mo-Bl, n-%
Контроль 52 17-32,7 7-13,5
Опыт I монослойкумулюсных клеток 100 33-33,0 13-13,0
Опыт II монослой клеток гранулезы 490 259-52,8** 75-15,3
Опыт III монослой эпителиальных клеток яйцевода 159 71-44,7 27-17,0
Опыт IV монослой клеток эндометрия матки 286 110-38,5 26-9,1
Примечание: *Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001.
154
Установлена эффективность использования соматических клеток фолликула (кумулюса и гранулезы) и репродуктивного тракта (эпителиальных клеток яйцевода и эндометрия матки), а также полученных из них монослойных культур в технологии получения ранних эмбрионов крупного рогатого скота in vitro. Сравнивая средние показатели эффективности получения эмбрионов, культивируемых на изучаемых монослойных культурах, которые выражаются в уровне дробления и выходе эмбрионов на предимплантационных стадиях, установлено, что при использовании монослоя фолликулярных клеток гранулезы в качестве фидера уровень дробления ооцитов достигал наивысшего значения и составлял 52,8 %, что выше на 20,1 % по сравнению с контролем, а клеток репродуктивного тракта: монослоя эпителиальных клеток яйцевода и эндометрия матки на 8,1 и 14,3 % соответственно. Выход ранних эмбрионов крупного рогатого скота достигал наивысшего значения при получении зародышей на монослое клеток яйцевода и составлял 17,0 %, что превышало контрольные показатели на 3,5 % и аналогичные показатели применения монослоя кумулюса, гранулезы и эндометрия матки на 5,0; 1,7 и 7,9 % соответственно.
Полученные нами данные согласуются с исследованиями ряда авторов [1-6], где установлено, что клетки кумулюса и гранулезы способствуют полному ядерному и цитоплазматическому созреванию оо-цита, соответственно уровень дробления выше на монослое клеток гранулезы. Так как оплодотворение ооцита происходит в яйцеводе, то при приближении условий культивирования вне организма к естественным условиям (использованиемонослоя эпителиальных клеток яйцевода) выход предимплантационных эмбрионов достигал наивысшего уровня-17,0 %. В верхней трети рога матки происходит раннее эмбриональное развитие, поэтому на монослой матки необходимо сажать уже подробившиеся эмбрионы, что было ранее доказано нами и рядом других ученых [7-10].
После получения эмбрионов вне организма на основе использования монослойных культур соматических клеток было проведено 23 пересадки (табл. 2) преимплантационных эмбрионов коровам-реципиентам. При этом стельными оказались 13 коров, что составило 33,3 % от общего числа коров-реципиентов. Было получено 9 телят от числа пересаженных эмбрионов - три телки и шесть бычков, что составило 23,0 % от количества пересаженных эмбрионов.
Следует отметить, что наилучшие результаты были получены при культивировании эмбрионов с использованием монослоя эпителиаль-
ных клеток яйцевода. Так, в данной опытной группе был достигнут наивысший уровень дробления, который составил 67,1 %, что превысило аналогичные данные в контрольной группе на 23,8 %. Выход пре-имплантационных эмбрионов во всех группах в среднем составил 15,5 % от общего количества ооцитов, поставленных на культивирование.
Т а б л и ц а 2. Приживляемость эмбрионов и выход телят в зависимости от способа их получения in vitro
Система культивирования Количество ооцитов, n Уровень дробления, n-% Получено преи-мпланта-ционных эмбрионов, п-% Пересажено эмбрионов, п Количество пересадок, п Стельных реципиентов, n-% Получено телят, п-%
Контроль (культивирование без монослоя) 120 52-43,3 18-15,0 10 6 2-20,0 0
Монослой гранулезы 124 64-51,6 20-16,1 15 7 4-26,6 2-13,3
Монослой эпителиальных клеток яйцевода 70 47-67,1 11-15,7 9 7 5-55,5 5-55,5
Монослой клеток эндометрия матки 40 21-52,5 6-15,0 5 3 2-40,0 2 (двойня) -40,0
ВСЕГО 354 184-52,0 55-15,5 39 23 13-33,3 9-23,0
При пересадке эмбрионов, полученных при культивировании на монослое клеток яйцевода, стельность коров составила 55,5 % от количества пересаженных эмбрионов, при этом было получено 100 % телят, то есть от 5 стельных реципиентов было получено 5 телят (три бычка и две телочки).
При пересадке эмбрионов, выращенных на монослое клеток эндометрия матки, стельность коров-реципиентов составила 40,0 %, то есть из 5 реципиентов стельными оказались 2, в том числе от одной коровы получена двойня. В контрольной группе стельность коров-реципиентов составила лишь 20,0 %, а телят вовсе не было получено.
156
При получении телят с использованием монослойных культур соматических клеток репродуктивного тракта крупного рогатого скота приживляемость эмбрионов после трансплантации коровам реципиентам повышается на 6,6-35,5 % по сравнению с контролем с выходом телят до 55,5 %.
Заключение. Использование монослойных культур соматических клеток репродуктивного тракта крупного рогатого скота в технологии получения ранних зародышей вне организма способствует достижению уровня дробления 33,0-52,8 %, выходу преимплантационных эмбрионов до 17,0 %, приживляемости эмбрионов после трансплантации реципиентам 26,6-55,5 % и обеспечивает выход телят до 55,5 %.
ЛИТЕРАТУРА
1. А х м о л д а е в а, А. М. Влияние биологически активных веществ на созревание и оплодотворение invitro ооцитов крупного рогатого скота: автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.13 / А. М. Ахмолдаева; Рос.ун-т дружбы народов. - Дубровицы, 2000. - 22 с.
2. Культивирование созревших и оплодотворенных invitro ооцитов в средах с клетками воспроизводительного тракта / Н. И. Смыслова [и др.] // Докл. Рос. акад. с.-х. наук -1999. - № 2. - С. 47-49.
3. К у з ь м и н а, Т. И. Использование культуры клеток гранулезы и эстрадиола в системах дозревания ооцитов коров для получения эмбрионов invitro / Т. И. Кузьмина, Т. Э. Позднякова // Бюллетень ВНИИРГЖ. - СПб, 1996. - Вып. 143. - С. 29-32.
4. Культивирование и сокультивированиепреимплантационных эмбрионов на монослоях соматических клеток / Н. И. Парфирьев [и др.] // Молоч. и мясное скотоводство. -2001. - № 2. - С. 18-19.
5 . Развитие незрелых ооцитов до стадии хэтчингабластоцисты после созревания и оплодотворения invitro при использовании систем со-культивирования / Y. M. Hwul [et. al.] // Проблемы репродукции. -Т. 5, № 1. - 1999. - С. 79.
6. С и н г и н а, Т. Н. Исследование скорости формирования монослоя эпителиальными клетками яйцевода, выделенными различными способами / Т. Н. Сингина // «Новые методы генодиагностики и генотерапии: современное состояние и перспективы использования в сохранении генофонда сельскохозяйственных животных»: междунар. школа-конф.; ВИЖ Россельхозакадемии, 21 декабря 2005 г. - Дубровицы, 2005. - С. 158-160.
7. Эффективность получения эмбрионов в культуре invitro в зависимости от состава питательной среды / А. С. Дешко[и др.]// Сельскоехозяйство - проблемы и перспективы-Том 1. - Гродно, 2011. - С. 27-32.
8. Abilities of cumulus and granulosa cells to enhance the developmental competence of bovine oocytes during in vitro maturation period are promoted by midkine; a possible implication of its apoptosis suppressing effects / S. Ikeda [et. al.] // Reproduction. - 2006. - Oct. -Vol. 132, №4. - P. 549-557.
9. A l l e n, R. L. In vitro development of porcine embryos in coculture with endometrial cell monolayers of culture supernatants / R. L Allen, R. W. Wright // J. Anim. Sci. - 1984. -Vol. 59. - P. 1657-1661.
10. R e x r o a d, C. J. The ovine uterus as a host for in vitro-produced bovine embryos / C. J. Rexroad, A. M. Powell // Theriogenology. - 1999. - Vol. 15, № 52 (2). - P. 351-364.
