CC BY
220
УДК 636.22/.28.082:612
РОЛЬ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ФОЛЛИКУЛА В СОЗРЕВАНИИ ООЦИТОВ И ПОЛУЧЕНИИ
ЭМБРИОНОВ КОРОВ IN VITRO ROLE OF SOMATIC CELLS OF FOLLICLES IN OOCYTE MATURATION AND OBTAINING OF BOVINE EMBRYOS IN VITRO
Кириллова И.В. к.с.-х.н., Ганджа А.И. к.с.-х.н., Леткевич Л.Л. к.с.-х.н., Симоненко В.П. к.с.-х.н.
Республиканское унитарное предприятие «Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству», г. Жодино, Республика Беларусь
Kirillova I. V., Ph.D.Agr.; Gandja A. I., Ph.D.Agr.; Letkevich L. L., Ph.D.Agr.; Simonenko V. P., Ph.D.Agr.
Republican unitary enterprise "Scientific and practical center of the National academy of sciences of Belarus on animal husbandry", Zhodino, Belarus.
Аннотация: проведен анализ использования клеток куму-люса, а также полученной из них монослойной культуры в технологии получения эмбрионов крупного рогатого скота вне организма. Установлено, что увеличение количества кумулюсных клеток за счет дополнительного их внесения в культуральную среду способствовало повышению выхода преимплантационных эмбрионов до 17,6-18,5 %.
Ключевые слова: яичник; фолликул; ооцит; эмбрион; соматические клетки; кумулюс; монослой; созревание; дробление; морула; бластоциста.
Summary: the analysis of application of cumulus cells was carried out, as well as analysis of the derived from them monolayer culture in technology of obtaining of bovine embryos in vitro. It was determined that increasing of the number of cumulus cells by additional incorporation in the culture medium contributed to increase of output of preimplantation embryos by 17,6 -18,5 %.
Keywords: ovary; follicle; oocyte; embryo; somatic cells; cumulus; monolayer; maturation; cleavage; morula; blastocyst.
Клетки кумулюса в антральном фолликуле - это группа близко связанных соматических клеток, которые играют значительную роль в течение всего роста и развития ооцитов млекопитающих, а также их созревания и оплодотворения [1, 2].
Клетки кумулюса обеспечивают ооцит питательными веществами и выполняют функцию медиаторов гормональных сигналов при формировании зрелых яйцеклеток в организме млекопитающих. На основании данных, полученных in vivo и in vitro, доказано, что качество ооцитов и их способность к дальнейшему развитию зависит от числа слоев кумулюсных клеток и функционального состояния последних.
Рядом авторов [1, 2, 3] было установлено и описано значение, которое оказывают кумулюсные клетки на созревание ооци-тов млекопитающих и приобретение ими способности к дальнейшему развитию. Ооцит и окружающие его кумулюсные клетки метаболически связаны через щелевые соединения, которые обеспечивают проникновение различных метаболитов в ооплаз-му. Клетки кумулюса поддерживают ядерное созревание ооцитов до стадии метафаза II, а также ускоряют цитоплазматическое созревание. В результате ооциты способны к нормальному оплодотворению и последующему эмбриоразвитию [3]. Удаление куму-люсных клеток до созревания вне организма ооцита, неблагоприятно влияет на созревание, оплодотворение и развитие эмбрионов.
В связи с вышесказанным целью наших исследований явилось определение роли кумулюсных клеток, а также полученных из них монослойных культур в созревании ооцитов до стадии метафаза II и их влияние на уровень дробления и выход преимплантационных эмбрионов.
Методика. Для достижения поставленной цели были разработаны условия получения монослойной культуры соматических клеток фолликула коров, а также разработаны режимы их применения в технологии получения ранних эмбрионов крупного рогатого скота in vitro.
Результаты исследований и их обсуждение. По результатам проведенных исследований установлено, что использование монослоя кумулюса в качестве источника биологически-активных веществ способствовало увеличению количества со-
зревших ооцитов на 5,2-5,7 %, уровня дробления 14,0-14,6 % и выхода эмбрионов 13,8-12,5 % в зависимости от способа получения монослоя кумулюсных клеток. Причем следует отметить, что выход эмбрионов на стадии морула-бластоциста был выше при культивировании не диспергированных ооцит-кумулюсных комплексов по сравнению с использованием монослоя кумулю-са, полученного на сутки раньше на 0,7 %.
В дальнейших исследованиях мы выявили зависимость выхода полноценных эмбрионов от качественных и количественных показателей монослоя кумулюсных клеток. На первом этапе выясняли зависимость выхода преимплантационных эмбрионов от качества поставленных на созревание ооцитов. Использовали две группы ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК): 1 -ооциты с компактным кумулюсом; 2 - ооциты с фрагментированным кумулюсом.
Установлено, что при совместном культивировании ОКК с плотным, компактным кумулюсом, а также при использовании предварительно полученного монослоя кумулюсных клеток выход созревших до стадии метафаза II ооцитов составил 71,8-72,5 %, что на 13,0-13,7 % выше по сравнению с клетками с рыхлым кумулюсом и на 19,7-20,4 % в сравнении с клетками с частично отслоившимся кумулюсом. Аналогичная зависимость наблюдается и по выходу морул-бластоцист - 15,4-15,7 % против 10,97,2 %, соответственно.
При выделении ооцит-кумулюсных комплексов наблюдается значительное разнообразие по морфологическим признакам. Известно, что начало мейоза провоцируется выделением ооцита из ингибиторной среды фолликула, однако для полноценного созревания ооцита и достижения им способности к оплодотворению и дальнейшему развитию, необходимо полноценное протекание метаболических процессов, которое не возможно без наличия кумулюсных клеток. В качестве контроля ооциты сокультивировались вместе с кумулюсными клетками. Отдельно культивировались ооциты с компактным и фрагментированным кумулюсом.
Установлено, что культивирование ооцитов с компактным кумулюсом на монослое как созревших, так и несозревших соматических клеток приводило к увеличению уровня их созрева-
ния на 3,9-1,7 % по сравнению с контролем и выхода преим-плантационных эмбрионов на 6,2-5,3 %, соответственно. Аналогичная зависимость наблюдается и при культивировании ооцит-кумулюсных комплексов с фрагментированным кумулюсом (63,4-58,7 % против 57,4 % выхода созревших ооцитов в юшралз)
Выводы. Увеличение количества кумулюсных клеток за счет дополнительного их внесения в культуральную среду способствовало повышению выхода преимплантационных эмбрионов до 17,6-18,5 %.
Список литературы
1. Developmental capability of denuded bovine oocyte in a co-culture system with intact cumulus-oocyte complexes: role of cumulus cell, cyclic adenosine 3', 5'-monophosphate, and glutathione / A. M. Luciano [et al] // Molecular reproduction and development. -2005. - Vol. 71. - P. 389-397.
2. Minireview: Functions of the cumulus oophorus during oocyte maturation, ovulation, and fertilization / S. Tanghe [et al] // Mol. Reprod. Dev. - 2002. - Vol. 61. - P. 414-424.
3. Suzuki, H. Dynamic changes of cumulus-oocyte cell communication during in vitro maturation of porcine oocytes / H. Suzuki, B. S. Jeong, X. Yang // Biol. Reprod. - 2000. - Vol. 63. - 723-729.
