Научная статья на тему 'Эффект пролактина на ооциты коров, культивируемые in vitro'

Эффект пролактина на ооциты коров, культивируемые in vitro Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
172
69
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Новикова Н. О.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Эффект пролактина на ооциты коров, культивируемые in vitro»

диагностики и лечения заболевания. Тем более что в отличие от мутаций, которые принципиально необратимы, модификации ДНК, хотя и весьма стабильны, но принципиально обратимы. На протяжении более 50 лет изучения феномена применялись разные методы как количественной его оценки, так и статуса метилирования специфических участков генома. EpiTYPER обеспечивает анализ метилирования ДНК каждой пары CpG в последовательности-мишени длиной до 600 п.н. Анализ относительного уровня метилирования проводится в диапазоне 10-90 % со стандартным отклонением 5 %.

Кроме генотипирования и анализа метилирования на платформе Sequenom MassARRAY можно проводить количественный анализ экспрессии гена при помощи панели QGE, которая сочетает в себе конкурентной ПЦР с MALDI-TOF, что дает высокую точность, чувствительность, и пропускную способность анализа.

Принципиально важно, что Sequenom MassARRAY воплощает комплексное решение, так как позволяет провести генотипирование, анализ метилирования и определить уровень экспрессии гена на единой платформе. В области терапии это открывает большие возможности для профилактики, торможения и купирования заболеваний. В научном смысле методика масспектрального анализа является значительным прогрессом в развитии медицины и микробиологии в частности.

Н. О. Новикова

Эффект пролактина на ооциты коров, культивируемые in vitro

Использование клеточных технологий репродукции (получение эмбрионов in vitro, клонирование, трансгенез) у млекопитающих основывается, прежде всего, на базовой технологии экстракорпорального дозревания биологически полноценной яйцеклетки, способной к дальнейшему оплодотворению и развитию из нее эмбриона. Множество факторов вовлечено в процесс внефолликулярного культивирования ооцитов, включая состав сред, концентрацию используемых в качестве добавок гормонов, газовый и температурный режимы, уровень профессионализма эмбриотехнолога и т. д.

При отборе ооцитов, аспирированных из фолликулов яичников животных-доноров, в соответствии с общепринятыми морфологическими критериями, эффективность экспериментов по

221

получению из них эмбрионов, как правило, не превышает 30 %. В связи с этим логично предположить, что популяция отобранных по морфологическим признакам ооцитов неоднородна по функциональному статусу. Применение в качестве зонда для прижизненного тестирования ооцитов бриллиантового кристаллического красителя (brillant cresyl blue - BCB) - индикатора активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (G6PDH)

обеспечивает возможность использования отобранных клеток для дальнейшего культивирования ооцитов, их оплодотворения и получения эмбрионов. ВСВ детерминирует интрацеллюлярную активность G6PDH, которая играет важную роль в клеточном росте, являясь ключевым ферментом пентозо-фосфатного цикла. Активность фермента возрастает в растущем ооците, к моменту завершения роста его активность снижается. Не токсичность данного красителя при его использовании в качестве теста при определении уровня G6PDH была показана в ооцитах овец, в зависимости от их размера, а также при определении компетенции к мейотическому дозреванию ооцитов свиней.

Объектом исследования служили ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) из антральных фолликулов яичников коров и половозрелых телок, клетки гранулезы, доимплантационные эмбрионы коров.

Для проведения ВСВ теста ОКК коров или свиней отмывали три раза в растворе Дюльбекко с добавлением 0,4 % бычьего сывороточного альбумина (BSA) (A-7888; mDPBS). Затем ОКК подвергали воздействию раствора 26^М BCB (B-5388), приготовленного на основе Дюльбекко, в течение 90 минут. Выбор концентрации основывался на данных, полученных Rodriguez-Gonzales et al. 2002 при исследовании влияния различных концентраций ВСВ на ооциты коз. Ученые показали, что концентрация 26^М ВСВ наиболее эффективна для оценки качества донорской яйцеклетки без потери её жизнеспособности.

По истечении времени воздействия ВСВ маркера ОКК отмывали в растворе Дюльбекко дважды, после чего ОКК оценивали под бинокулярной лупой и разделяли визуально на две группы: ОКК с различной степенью голубой окраски ВСВ(+) и ОКК без голубой окраски цитоплазмы ВСВ(-).

Отбор ооцит-кумулюсных комплексов для экспериментов проводили с использованием общепринятых критериев. Базовой средой для дозревания ооцитов коров служила среда ТС-199 с 10 % фетальной сыворотки коров. Режим культивирования ооцитов in vitro соответствовал методическим рекомендациям, разработанным в лаборатории биологии развития. В экспериментальных группах использовали систему кокультивирования клеток гранулезы с

222

добавлением 50нг/мл пролактина (Институт химии гормонов, Москва).

Для контроля за состоянием хроматина в ооцитах готовили препараты хромосом по методу Тарковского. С этой целью ооциты и эмбрионы помещали на 5-10 мин в теплый (37 °С) гипотонический раствор трехзамещенного цитрата натрия (0,9 %-ный раствор в дистиллированной воде) и с помощью препаровальной иглы механически очищали от кумулюса. Затем клетки переносили на сухое обезжиренное стекло, фиксировали смесью метанола и уксусной кислоты (3:1). Высохшие препараты окрашивали по Романовскому-Гимза (азур-эозином) в течение 5-10 мин, в зависимости от качества красителя и промывали водой, а затем 70 %-ным этанолом.

Через 6 часов культивирования основная часть ооцитов во всех исследуемых группах находилась на стадии диплотены. После 12 часов культивирования лишь 50 % ВСВ(-) ооцитов продвинулись в своем развитии, в то время, как 98 % ВСВ(+) ооцитов и 94 % ооцитов в контрольной группе реинициировали мейоз. Через 18 часов экспозиции на завершающих этапах мейотического созревания находилось 59 % ооцитов контрольной группы, 72 % ВСВ(+) ооцитов и 38 % ВСВ(-) ооцитов. Основная масса ВСВ(+)ооцитов(81%) и ооцитов контрольной группы (70%) достигла стадии метафазы-II через 24 часа и лишь 52 % ВСВ(-) ооцитов завершили ядерное созревание. После 30 часов экспозиции на стадии метафазы II находился уже 71 % ВСВ(-) ооцитов, не изменился процент выхода зрелых яйцеклеток в контрольной группе и в группе, где культивировали ВСВ(+) ооциты. Таким образом пролонгация времени культивирования ВСВ(-) ооцитов до 30 часов позволяет им завершить мейоз.

Так, на основе использования маркера активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (ВСВ - бриллиантовый кристаллический краситель brillant cresyl blue - BCB) проведен мониторинг исходной выборки ооцитов коров для прогнозирования их способности к дальнейшему созреванию и оплодотворению in vitro. Выявлена гетерогенность исходной выборки ооцитов коров, выделенных из фолликулов разного диаметра по ВСВ тесту (маркеру активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы). Наибольшее число ВСВ(+) ооцитов обнаружено в фолликулах диаметром 3-5 мм и более 5 мм (у коров - 79,3 %, 69,23 % против 57,8 %, Р<0,01). При

культивировании ВСВ(+) ооцитов, прокультивированных совместно с пролактином (50 нг/мл), процент клеток, достигших стадии метафазы II, превысил такой в группе ВСВ(-) ооцитов, (81 % против 52 %, Р<0,001). Выявлен эффект пролактина на снижение уровня дегенераций в ВСВ(+) ооцитах, созревших в присутствии пролактина

223

по сравнению с группой ВСВ(-) ооцитов, прокультивированных без пролактина (9 % против 27 %, Р<0,01). Прослежена динамика ядерного созревания ВСВ(-) ооцитов в течение 30 часов. Показана возможность достижения ооцитами стадии метафазы-М в средах, кондиционированных клетками гранулезы с добавлением 50 нг/мл пролактина (71 %). При этом доля ВСВ (-) ооцитов с дегенерацией хроматина не превышала таковую в группе, где культивировали ВСВ (+) ооциты (22 % против 24 %). Процент ВСВ(-) ооцитов с высокой степенью экспансии клеток кумулюса увеличивается по мере возрастания времени культивирования с 52 % (на 24 часа) до 88 % после 30 часов. Обнаружено, что уровень 8-32 клеточных эмбрионов с признаками апоптоза хроматина, в группе, где ВСВ(+) ооциты созревали в присутствии пролактина, на 27,8 % ниже, чем в группе эмбрионов, полученных из ВСВ(-) ооцитов, созревших без пролактина (23,2 % против 51 %, Р<0,001)

Е. В. Раменская

Создание системы молекулярно-генетической диагностики типов папилломавируса, связанных с высоким риском

рака шейки матки

Human Papilloma virus (HPV) принадлежат к роду Papillomavirus, к семейству Papovaviridae, вызывают развитие папиллом, в частности, генитальных. Human Papilloma virus является ДНК содержащим вирусом, содержит двунитевую кольцевую ДНК, размер которой около 8 тыс. пар оснований.

Жизненный цикл вируса папилломы человека неотъемлемо связан с дифференцировкой клеток: ДНК папилломавируса находится в клетках базального эпителия, а зрелые вирусные частицы диагностируются только в самых верхних слоях эпителия (в керати-ноцитах на стадии терминальной дифференцировки). Вирусная ДНК в зараженных клетках может персистировать как в эписомальной, так и в интегрированной формах. Эписомальная форма папилломавируса (кольцевая двунитевая ДНК) способна встраиваться в клеточный геном. Встраивание вируса в ДНК происходит случайным образом, т. е. локализация встраивания ДНК HPV в клеточную ДНК не специфична. Чаще всего интегрированная форма ДНК вируса папилломы человека диагностируется только на поздних стадиях опухолевой трансформации. В опухолевых клетках чаще всего вирусные частицы не продуцируются.

224

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.