CC BY
116
у = ехр С,4692 +1,2774-х, - 0,6481 х2 - 0,5268х3 + 0,7836 х4 + 0,3407х5 .
Коэффициент детерминации составляет 94,73 %, относительная погрешность не превосходит 8,04 %. Функция ух= 4[1,х2,х3,х4,х5^ достигает минимального значения 0,4937 при х1 = 0, х2 =1,
Х3 = 1, х4 = 0, х5 = 0. В этом опыте 1-, 4-, 5-й факторы - внесение калия, двухкратное протравливание
семян, применение минеральных удобрений - действует как стимулятор развития бурой ржавчины при вспашке почвы.
Выводы
1. Установлено, что распространение и развитие бурой ржавчины у растений сортов яровой пшеницы хорошо описывается (с детерминацией больше 95 %) экспоненциальной зависимостью от пяти средств химической защиты при отвальном и безотвальном способах обработки почвы.
2. Предложенная модель с достаточной для практики точностью (относительная ошибка меньше 10 %) объясняет выборочное действие пяти применяемых средств защиты растений на колонию грибов бурой ржавчины как положительное, так и отрицательное, в том числе при повторном применении химикатов, и, следовательно, может быть использована в аналитических и прогнозных целях.
Литература
1. А.с. № 2006611291 Российская Федерация. Прогнозирование поля урожайности зерновых культур (Программа для ЭВМ) / Н.В. Цугленок, А.В. Бастрон, А.А. Беляков [и др.]. - М.: Роспатент, 2006.
2. Формирование качества зерна мягкой яровой пшеницы в условиях Красноярского края / Л.В. Плеханова, А.И. Хохлова, В.В. Матюшев [и др.]; Краснояр. гос. аграр. ун-т. - Красноярск, 2011. - 139 с.
УДК 631.147:633.1 Н.В. Зобова, С.Ю. Луговцова, В.Ю. Ступко
УСЛОВИЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЭФФЕКТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ РЕГЕНЕРАЦИИ В КУЛЬТУРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ ЗАРОДЫШЕЙ ЯЧМЕНЯ, ПШЕНИЦЫ И ОВСА*
В статье рассмотрены условия первого этапа культивирования изолированных зародышей для эффективного использования каллусных тканей при селекции in vitro зерновых культур.
Ключевые слова: культура in vitro, ячмень, пшеница, овес, каллусогенез, ауксины.
N.V. Zobova, S.Yu. Lugovtsova, V.Ju. Stupko
CONDITIONS FOR PROVIDING THE EFFECTIVE REGENERATION PROCESSES IN THE CULTURE OF THE BARLEY, WHEAT AND OAT ISOLATED GERMS
The conditions of the first stage of the isolated germ cultivation for the callus tissue effective use in the process of the grain crops in vitro selection are considered in the article.
Key words: in vitro culture, barley, wheat, oat, callusogenesis, auxins.
Введение. Создание устойчивых к неблагоприятным факторам внешней среды и патогенам высокоурожайных форм сельскохозяйственных растений - задача, которая может быть решена и традиционными методами селекции, но методы in vitro позволяют увеличивать естественное генетическое разнообразие форм, что способствует ускорению и повышению эффективности селекции [1-3]. Отбор стрессоустойчивых форм на селективных средах в культуре in vitro предполагает первоначальное получение каллусной ткани,
* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, осуществленной КГАУ «Красноярский краевой фонд поддержки научной деятельности».
для чего определяются условия ее индукции, которая должна быть сопряжена с дальнейшей регенерацией растений [2, 3].
Цель исследований. Уточнение условий первого этапа культивирования изолированных зародышей зерновых культур для повышения результативности регенерационных процессов.
Объекты и методы исследований. В качестве объектов использованы более 20 форм ярового ячменя, 4 - пшеницы, 4 сорта овса.
В качестве эксплантов использовали изолированные зародыши, выделенные на разных стадиях спелости. Основой служила питательная среда Мурасиге-Скуга (МБ) [4, 5]. В таблице 1 представлен гормональный состав питательных сред, используемый на всех этапах культивирования для ячменя. Состав сред для других культур дан в таблицах результатов. Культивирование на всех этапах проводили 30-40 дней при 16-часовом фотопериоде, освещенности 1000 Лк, температуре 23-25°С. Результаты обработаны статистически с использованием компьютерной программы Снедекор [6].
Таблица 1
Характеристика гормонального состава сред культивирования изолированных зародышей ячменя
Гормональный состав среды Этап культивирования
Индукция каллуса Пролиферация каллуса Регенерация растений
2,4-Д, мг/л 3 1,5 -
ИУК, мг/л 2 - 0,5
Кинетин, мг/л - - 1
Результаты исследований и их обсуждение. На трех группах образцов ячменя продемонстрировано влияние условий выращивания донорных растений на процессы, происходящие в культуре изолированных тканей. Установлено, что при выращивании донорных растений ячменя в поле только у половины эксплантов наблюдается каллусогенез, а выращивание в светокультуре увеличивает индукцию калусогенеза у линий реге-нерантов на 40 %, у других исследованных форм - на 8-25 % (табл. 2). Кроме этого, снижается уровень заражения проб по сравнению с использованием донорных растений, выращенных в поле, что является немаловажным фактом для повышения эффективности регенерационных процессов в культуре in vitro.
Таблица 2
Влияние условий выращивания донорных генотипов на индукцию каллусогенеза в культуре незрелых зародышей ячменя
Группа генотипов Полевые условия Светокультура
Генотипы, шт. Экспланты, шт. Индукция каллуса, % Генотипы, шт. Экспланты, шт. Индукция каллуса, %
Родительские формы регенерантов КНИИСХ 4 290 54,1±4,9 4 267 80,7±7,1*
Регенеранты КНИИСХ 9 552 47,0±5,8 3 267 87,9±1,8**
Сорта 4 254 49,5±2,3 4 188 57,4±14
* Различия между полевыми условиями и светокультурой достоверны при Р < 0,05. ** Р < 0,01.
Не только условия выращивания донорных растений имеют значение в формировании физиологического статуса экспланта, который вводится в культуру, но и его возраст. Нами выяснено, что индукция каллусогенеза в культуре зрелых зародышей (из зерна восковой спелости) значимо ниже, чем у незрелых (10—21-е сутки после опыления) (табл. 3).
Таблица 3
Эффективность процессов на среде индукции каллуса в культуре зрелых и незрелых зародышей
ячменя (% от введенных в культуру эксплантов)
Генотип, Индукция каллуса Стеблегенез Ризогенез
Образец шт. Зрелые Незрелые Зре- лые Незрелые Зре- лые Незрелые
Районированные 5 69,6± 93,3± 14,8±1 3,6± 2,6± 2,4±
сорта 20 4,6* 0 2,1* 2,2 1,5
Адаптивные линии 7 66,9± 4,0 98,9± /| /| *** 17,6±9, 1 1,1± 1,1** 8,0± 2,8 1,9± 1,4
* Различия между зрелыми и незрелыми зародышами достоверны при Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001.
Таким образом, представленные данные подтверждают высокую зависимость процессов, протекающих в культуре изолированных тканей, от генотипа донорного растения, условий его выращивания и возраста вводимого в культуру экспланта, что связано с физиологическим (гормональным) статусом последнего.
Еще одним фактором, влияющим на процессы, происходящие при культивировании изолированных тканей растений, являются условия освещенности [4]. Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как не имеет хлоропластов и питается гетеротрофно [5]. Ряд исследователей сходятся в том, что индукция и пролиферация каллусных тканей, не сопровождающиеся фотосинтезом, с большей эффективностью происходят при отсутствии освещения.
Эти моменты проверены в наших сравнительных экспериментах на 12 линиях, созданных в селекции на иммунитет. При проведении стадии индукции каллусогенеза в культуре незрелых зародышей в параллельных опытах на свету и в темноте не отмечено значимых различий по размерам сформированных на этом этапе каллусов и ростков (табл. 4).
Таблица 4
Характеристика параметров индукции каллуса и побегообразования ячменя на среде индукции каллуса
Генотип Размер каллуса, мм Размер ростка, мм
Свет Темнота Свет Темнота
Средние 4,97 5,23 18,2 17,8
Станд. ошибка ±0,204 ±0,354 ±2,663 ±3,38
Дисперсия 0,498 1,508** 85,08 137,1
со со 14,19% 23,42% 50,61% 65,67%
Критерий Стьюдента 0,6298 факт / 2,074 табл. 0,0920 факт / 2,074 табл.
Критерий Фишера (дисперсии) 3,013 факт / 2,977 табл. 1,611 факт / 2,408 табл.
Однако наблюдается более значительная вариабельность показателей роста каллуса и побегов без света, что выражается в отличие коэффициентов корреляции размеров каллусов на свету и в темноте и в превышении дисперсии по размерам каллусов, сформированным в темноте, по сравнению с условиями освещенности (табл. 4).
Если пролиферация каллусов, сформированных на свету и в темноте, идет на одном уровне, то по уровню каллусо- и стеблегенеза наблюдается пролонгированное действие условий освещенности первого этапа на результаты следующих этапов культивирования. На средах пролиферации каллуса и регенерации растений практически отсутствовал морфогенез у каллусов, индуцированных в темноте (табл. 5), а на свету составлял до 20 %.
Таблица 5
Последействие разного уровня освещенности при индукции каллуса в культуре незрелых зародышей ярового ячменя на регенерационные процессы следующих этапов культивирования
Показатель Этап культивирования
Введение в культуру Пролиферация каллуса Регенерация растений
Индукция каллуса Пролиферация каллуса Стеблегенез Формирование регенерантов
Светх Темно- та1* Светхх Темнота Свет Темнота Свет Темнота
Размер выборки, шт. 108 108 105 106 105 106 66 74
Средние, % 97,4 98,0 62,5 70,0 21,4 6,47** 1,11 0,44
Станд. ошибка, ± 9,91 10,7 5,62 8,04 3,73 4,38 0,58 0,338
Дисперсия 12,53 14,50 4,028 8,250 1,778 2,444 3,111 1,028
К в а р. % 0s 30,63 32,64 26,96 34,47 52,17 201,0 158,7 228,1
t-критерий (t05 = 2,120) 0,0641 факт. 0,7610 факт. 2,595 факт. 0,983факт.
Критерий Фишера 1,1574 факт / 3,177табл. 2,0483 факт / 4,259 табл. 1,375 факт / 3,803табл. 3,027факт / 6,48 табл.
х Свет, темнота - условия проведения стадии индукции каллуса.хх Курсивом (свет, темнота) - последействие условий индукции каллуса.
Это означает, что процессы индукции каллуса должны проходить в условиях освещенности, тогда пролиферация каллусов, а главное развитие регенерантов на последующих этапах, будут стабильными.
В работах по селекции пшеницы in vitro для индукции каллусогенеза используют концентрации 2,4-Д от 0,5 до 2 мг/л [7]. В наших опытах уже при концентрации 2,4-Д 0,5 мг/л наблюдался высокий уровень каллусогенеза (табл. 6). Увеличение концентрации 2,4-Д не приводило к достоверному увеличению этого показателя (табл. 6-7). Гораздо большее влияние на данный параметр оказывали условия произрастания до-норных растений. При выращивании последних в светокультуре, как и у ячменя, частота каллусогенеза росла по сравнению с полевыми условиями (табл. 6-7).
Таблица 6
Характеристика процессов в культуре зародышей пшеницысс на среде индукции каллусогенеза
(% от общего числа образцов)
Возраст экспланта Генотип 2,4-Д, мг/л Каллусогенез Стеблегенез
21-22 сутки Новосибирская 15 0,5 72,5 31,2
Таежная 76,5 40,9
Минуса 40,8 15,4
КС-1607 56,7 17,1
Новосибирская 15 1 72,9 20,2а
Таежная 80,6 17,2*а
Минуса 44,9 26,2
КС-1607 59,5 13,2
27-28 сутки Новосибирская 15 0,5 75,5 63,6
Таежная 80,3 75,0
Новосибирская 15 1 82,5 41,7*а
Таежная 74,4 45,1*а
СС Донорные растения получены в полевых условиях. Cущественные различия: * - между средами с разной концентрацией 2,4-Д в пределах одного генотипа ^<0,05); а - между разными по степени зрелости зародышами в пределах одного генотипа и концентрации 2,4-Д ^<0,05).
Также отмечено, что раннеспелые сорта (Таежная и Новосибирская 15) имели значительно большую долю индуцированных каллусов во всех исследованных условиях, чем позднеспелые (Минуса, КС-1607). Вероятно, это связано с более длинным периодом созревания зародыша у позднеспелых сортов (табл. 6).
Уровень 2,4-Д в среде индукции каллусообразования оказывал влияние на ростовые процессы культуры и на последующих стадиях культивирования. Концентрация 2,4-Д на уровне 3 мг/л на первом этапе, стимулировавшая активный каллусогенез (100 %), почти полностью подавляла органогенез, однако это сказывалось на дальнейших этапах культивирования. На среде пролиферации и в последующем - регенерации - не было получено ни одного полноценного регенеранта (данные не приводятся). Аналогичный результат получен и при концентрации 2,4-Д в среде введения 2 мг/л (табл. 7).
Таблица 7
Влияние уровня 2,4-Д в среде индукции и пролиферации каллуса на регенерационные процессы
пшеницысс (% от общего числа образцов)
Этап культивирования Параметр условий и оценки Результат оценки
Индукция каллусогенеза Концентрация 2,4-Д, мг/л: 1 2
образцов с каллусогенезом 99,3 98,1
морфогенных каллусов 51,0 17,7*
Пролиферация каллуса Концентрация 2,4-Д, мг/л: 0,5 1
пролиферирующих каллусов 64,9 75,0*
морфогенных каллусов 47,0 18,8*
Регенерация растений пролиферирующих каллусов 45,3 34,9*
морфогенных каллусов 22,6 4,5*
Доращивание регенерантов регенерантов, высаженных в грунт 13,7 0,0*
СС Донорные растения получены в условиях светокультуры. * Существенные различия между средами с разной концентрацией 2,4-Д ^<0,05).
Для уточнения возраста эксплантов в культуру вводили зародыши пшеницы, отобранные на 20-21 сутки и более зрелые - на 27-28 сутки с момента начала колошения. Значимых различий по каллусогенезу между зародышами разного возраста не обнаружено. Однако доля образцов с морфогенезом параллельным каллусообразованию возрастала в 2-2,5 раза при использовании более зрелых зародышей (табл. 8).
При использовании трехнедельных зародышей уровень фиторегулятора 0,5 мг/л в среде пролиферации способствовал росту большей доли каллусов по сравнению с аналогичной средой с меньшей концентрацией 2,4-Д (табл. 9). Этот параметр для каллусной культуры, полученной на более зрелых зародышах, не зависел от уровня 2,4-Д. Доля морфогенных каллусов на среде пролиферации в культуре трехнедельных зародышей была выше, чем у более зрелых. В совокупности максимальная доля регенерантов получена в каллусной культуре трехнедельных зародышей пшеницы (табл. 8). Вероятно, зародыши, введенные в культуру на 20-21 сутки с начала колошения, являясь менее дифференцированными, более чувствительны к изменению уровня экзогенных гормонов по сравнению с зародышами на стадии начала восковой спелости. Вследствие этого они почти не образуют точек роста органов параллельно с каллусогенезом.
Таблица 8
Параметры роста и развития каллусной культуры пшеницысс на среде пролиферации
(% от общего числа образцов)
Возраст эксплантов Генотип Уровень 2,4-Д, мг/л Доля каллусов с изменениями Доля полноценных регенерантов
пролиферирующих со стеблеге-незом
1 2 3 4 5 6
21-22 сутки Новосибирская 15 0,25 74,0*а 35,1*а * ю~ 3
Таежная 67,8а 44,8а 38,9*
Минуса 77,5 - -
Окончание табл. 8
1 2 3 4 5 6
КС-1607 59,8* - -
Новосибирская 15 92,5* 24,2* 24,2*
Таежная 0,5 72,7а - 7,7*
Минуса 86,9 4,8 -
КС-1607 76,9* 27,2 27,2
Новосибирская 15 0,25 85,2а 18,5а 14,8
27-28 Таежная 86,8а 28,1*а 17,3
сутки Новосибирская 15 0,5 93,9 26,1а 20,3
Таежная 83,3а 13,3* -
сс Донорные растения получены в полевых условиях. Существенные различия: * - между средами с разной концентрацией 2,4-Д в пределах одного генотипа (Р<0,05);а - между разными по степени зрелости зародышами в пределах одного генотипа и концентрации 2,4-Д (Р<0,05).
При снижении давления фиторегулятора, индуцирующего каллусогенез, их каллусы легче формируют органогенные зоны и полноценные регенеранты. Однако необходимо признать, что малые размеры экс-плантов (0,5-1 мм) и их прозрачность делают работу по их введению в культуру очень трудоемкой.
Работа по получению и использованию в селекции in vitro каллусной культуры овса только начата. В литературе по этому поводу сведения достаточно скудные. В нашей работе в культуру вводили зародыши овса голозерных и пленчатых форм на стадии начала восковой спелости. Более мелкое зерно овса и неравномерность его созревания в метелке обуславливает необходимость использования его зародышей на более поздней стадии спелости по сравнению с другими культурами, а выращивания донорных растений - в поле из-за плохой завязываемости зерновок в условиях светокультуры. Индукцию каллусогенеза у овса осуществляли на среде с разными концентрациями ауксинов. По сравнению с ячменем и пшеницей размеры каллусов овса в соответствующих условиях превосходили размеры каллусов этих культур в среднем в два раза (данные не приводятся), а их масса увеличивалась с повышением уровня фиторегуляторов в среде (табл. 9).
Таблица 9
Влияние уровня гормонов в среде индукции каллусогенеза на массу каллусов и ростков овса, мг
Показатель Концентрация 2,4 Д (мг/л) + ИУК (мг/л)
1+0 2+1 3+2 4+3
Тюменский голозерный 116 257 381 448
Голец 145 283 235 370
Тубинский 176 289 297 362
Саян 98 235 262 349
Средние по массе каллусов 1 3 4 266 294 382
Различия Контроль 130* 160* 250*
Средние по массе ростковсс 251 138 174 95
Различия Контроль -113* -77* -155*
сс Индивидуальные данные по массе ростков не приведены. * Различия средних по уровню фиторегуляторов достоверны на уровне 1 %, по сортам - недостоверны.
Нежелательное побегообразование на среде индукции каллуса у овса идет даже активнее, чем у ячменя, но достоверно уменьшается при увеличении концентрации ауксинов в среде как по массе ростков (табл. 9), так и по частоте их образования. Результативность образования каллуса у овса в исследованных условиях не связана с генотипом, а зависит от уровня фиторегуляторов в среде.
Заключение. Полученные данные позволили сделать вывод о высокой зависимости процессов, протекающих в культуре изолированных тканей, от генотипа донорного растения и условий его выращивания. Основными условиями для более эффективного использования каллусных тканей при селекции зерновых культур являются использование генотипов, отзывчивых на культуру in vitro; условия светокультуры для выращивания донорных растений ячменя и пшеницы и полевых - для овса; незрелые зародыши в качестве эксплантов; индукция каллусогенеза на свету; использование на первом этапе культивирования концентра-
ций ауксинов, способствующих высокому уровню образования каллуса и минимальному стеблегенезу при
полном отсутствии ризогенеза.
Литература
1. Зобова Н.В., Конышева Е.Н. Использование биотехнологических методов в повышении соле- и кисло-тоустойчивости ярового ячменя. - Новосибирск: СО Россельхозакадемии, 2007. - 124 с.
2. Тырышкин Л.Г. Генетическое разнообразие пшеницы и ячменя по эффективной устойчивости к болезням и возможности его расширения: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - СПб., 2007. - 40 с.
3. Investigation of the response of bread wheat cultivars to salinity by using callus culture / T. Dokuyucu, S. Akke-ceci, A. Akkaya [at el] // J. Environ. Biol. - 2005. - Vol. 26. - N 2. - P. 251-255.
4. Бутенко Р.Г. Биотехнология растений: культура клеток. - М.: Агропромиздат, 1989. - 290 с.
5. Шевелуха В.С. Сельскохозяйственная биотехнология. - М.: МСХА, 1995. - 310 с.
6. Сорокин О.Д. Прикладная статистика на компьютере. - Краснообск: ГУП РПО СО РАСХН, 2004. - 162 с.
7. Birsin M.A., Ozgen M.A. Comparison of callus induction and plant regeneration from different embryo explants of triticale // Cellular & Molecular Biology Letters. - 2004. - Vol. 9. - P. 353-361.
---------♦------------
УДК 633.16 (571.51) В.И. Никитина, Д.С. Бахтин
ИЗМЕНЧИВОСТЬ И НАСЛЕДОВАНИЕ ПЛОЩАДИ ЛИСТОВОЙ ПОВЕРХНОСТИ У РОДИТЕЛЬСКИХ СОРТОВ И ГИБРИДОВ ЯРОВОГО ЯЧМЕНЯ В УСЛОВИЯХ КРАСНОЯРСКОЙ ЛЕСОСТЕПИ
В статье приведены результаты исследований, проведенных авторами в течение 2008-2010 гг., по выявлению вклада условий вегетации, генотипа и их взаимодействия в изменчивость площади листовой поверхности ярового ячменя по фазам развития растений. Представлена выявленная генетическая система контроля ассимиляционной поверхности листьев.
Ключевые слова: изменчивость, наследование, гибрид, яровой ячмень, Красноярская лесостепь.
V.I. Nikitina, D.S. Bakhtin
VARIABILITY AND INHERITANCE OF THE LEAF AREA SURFACE OF THE SPRING BARLEY PARENTAL VARIETIES AND HYBRIDS IN THE KRASNOYARSK FOREST-STEPPE CONDITIONS
The research results, which were conducted by the authors in 2008-2010, on revealing the contribution of the vegetation conditions, genotype and their interaction into variability of the spring barley leaf area surface on the plant development phases are given in the article. The revealed genetic monitoring system for the leaf assimilating area is given.
Keywords: variability, inheritance, hybrid, spring barley, Krasnoyarsk forest-steppe.
Известно, что фотосинтез - важный процесс в жизни растений, определяющий интенсивность накопления вегетативной биомассы, урожая, а также качество. Наиболее полное использование фотосинтетиче-ской активной радиации (ФАР) зависит от оптимальной площади листовой поверхности, формирование которой определяется условиями вегетации во время роста и развития растений.
Цель исследований. Изучить особенности формирования ассимиляционной поверхности листьев по основным фазам развития у родительских сортов и гибридов ярового ячменя в условиях Красноярской лесостепи.
Материалы и методы исследований. Исследования проводились в УНПК «Борское» Красноярского ГАУ на опытном поле кафедры растениеводства в 2008-2010 гг. Исходным материалом служили 5 сортов ярового ячменя: Ача, Сигнал, Никита, Омский 90, Омский 91.
Скрещивания делали по реципрокной схеме, в результате было получено 12 гибридных комбинаций поколения р1 и р2.
