CC BY
35
22. Pimlott, D. Predation and productivity of game population in North America / D. Pimlott// Тр. IX Межд. конгр. биол.- охот. - М., 1970. - С. 63-73.
23. Stenlund, M.A. Field study of the timber wolf (Canis lupus) on the superior national forest, Minnesota / M.A. Stenlund // Techn. Bull. Dep. Conserv. - 1955. - № 4. - P. 55.
24. Zimen, E. Verhalten-modell im okosjstem Wolfe / E. Zimen // Bild. Wis. - 1976. - Vol. 13. - № 1. - S. 36-45.
-----------♦'-------------
УДК 633.11:577.4 Е.Н. Конышева
СРАВНЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ЛИНИЙ РЕГЕНЕРАНТОВ ЯРОВОГО ЯЧМЕНЯ И ИХ РОДИТЕЛЬСКИХ ФОРМ К СТРЕССОВЫМ ЭДАФИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
В статье приводятся результаты сравнения стрессоустойчивости к эдафиче-ским факторам линий регенерантов ярового ячменя и их родительских форм в культуре тканей. По итогам проведенных исследований установлена перспективность использования линий регенерантов ярового ячменя в качестве исходного и селекционного материала для получения форм с потенциальной комплексной устойчивостью к засолению и кислотности почв.
Яровой ячмень - одна из наиболее распространенных зерновых культур, возделываемых в Средней Сибири. Это обусловливается ценными биологическими качествами: высокой потенциальной продуктивностью, кормовыми достоинствами зерна [1]. Ячменное зерно имеет и пищевое значение: из него вырабатываются крупы, солодовые и лечебные экстракты [2]. Яровой ячмень характеризуется самым коротким вегетационным периодом и наивысшей засухоустойчивостью среди яровых хлебов первой группы [3], а также высокой пластичностью и способностью формировать урожай за пределами распространения других зерновых культур, часто возделывается на экстремальных почвенных фонах, в том числе на засоленных и закис-ленных почвах [4]. В отличие от других сельскохозяйственных культур, ячмень обладает толерантностью к засоленным почвам [5], но негативно реагирует на кислые.
Неприхотливость к условиям возделывания и разностороннее использование зерна ячменя определяют уровень его производства и необходимость дальнейшего совершенствования адаптивного потенциала этой культуры к неблагоприятным условиям выращивания.
В последнее время одним из перспективных и экологически безопасных направлений, значительно увеличивающих эффективность совершенствования сельскохозяйственных культур, является использование биотехнологических методов и, в частности, клеточной селекции. Это обусловлено повышенной чувствительностью культуры изолированных тканей к стрессовым факторам и резкому возрастанию у них уровня наследственной изменчивости, что позволяет существенно ускорять темпы селекции по созданию новых сортов с широким диапазоном экологической валентности.
Отбор в культуре in vitro базируется на возникновении генетической гетерогенности изолированных тканей. Сам по себе выбор генотипов, эффективных к образованию морфогенетических структур в культуре in vitro, для дальнейшего их использования в целях селекции представляет собой актуальную задачу [6]. Но использование в культуре in vitro селективных сред осложняет задачу создания регенерантов, поэтому имеет смысл оценить возможное разнообразие донорных форм по влиянию стрессовых условий на уровень реализации ими регенерационных процессов в культуре изолированных тканей.
Кроме того, устойчивость растений к экстремальным факторам в естественных условиях, вероятно, должна положительно коррелировать с уровнем регенерационных процессов in vitro, поскольку механизмы, обеспечивающие эту устойчивость, в значительной степени определяются потенциалом вегетативного размножения растений.
Объектами исследований послужили 11 линий регенерантов селективных сред (7 с засоленных и 4 с кислых сред), полученные и размноженные ранее в лаборатории биотехнологии отдела оценки селекционного материала Красноярского НИИСХ, среди которых находятся не только регенеранты от адаптивных линий, но и от иностранного сорта С-15 (Эквадор) и дигаплоида ГДГ-28h-949. В качестве контроля использовали 6 их родительских форм.
В работе использованы классические методы и условия культивирования тканей in vitro по Р.Г. Бутенко (1989) и В.С. Шевелуха и др. (1998), модифицированные для используемых генотипов и создания селективных условий.
Получение регенерантов включало в себя следующие этапы: отбор подходящих эксплантов, их стерилизация и введение на питательную среду для индукции каллусов; перенос инокулятов на среды, стимулирующие пролиферацию каллуса; регенерацию побегов; образование корней; акклиматизацию регенерантов к внешней среде и высадку в грунт для получения семенного потомства.
Донорные растения для введения в культуру выращивали в зимнее время в условиях светокультуры при
16-часовом фотопериоде, освещенности 1000-1500 Лк, на керамзите, а в летнее в ОПХ «Минино» Красноярского края.
Эксплантами для индукции каллуса служили незрелые зародыши ячменя размером от 0,8 до 3,0 мм, которые высаживали на модифицированную среду Мурасиге и Скуга. Каллусы каждого исследованного генотипа ячменя пересаживали на контрольную и селективные среды с высокой концентрацией хлорида натрия или низкой рН, на которых выживают только устойчивые к данному фактору клетки, и использовали двухступенчатый отбор на этапах пролиферации каллусов и регенерации растений (табл. 1).
Таблица 1
Качественный и количественный состав используемых питательных сред (количество на 1 л раствора)
Состав среды Варианты сред культивирования
Индукция каллуса Пролис эерация каллуса Регенерац ия растений
Контроль NaCl pH Контроль NaCl pH
MS-макро, мл/л 100 100 100 100 100 100 100
MS-микро, мл/л 1 1 1 1 1 1 1
Витамины, мл/л 1 1 1 1 1 1 1
Fe-хелат, г/л 5 5 5 5 5 5 5
Инозит, мг/л 100 100 100 100 200 200 200
Сахароза, г/л 30 30 30 30 30 30 30
2-4Д, мг/л 2 1,5 1,5 1,5 - - -
ИУК, мг/л 1,5 - - - 0,5 0,5 0,5
Кинетин, мг/л - - - - 1 1 1
Агар-агар, г/л 7 7 7 10 7 7 10
NaCl, г/л - - 4,2 - - 4,2 -
рН 5,75 5,75 5,75 4,0 5,75 5,75 4,0
Статистическая обработка результатов проведена с помощью компьютерного пакета «Snedecш> (разработчик Сорокин) с использованием корреляционного, кластерного анализов и рангового критерия.
Всего в культуру введено 1745 незрелых зародышей (табл. 2). В среднем индукция каллусогенеза у линий регенерантов составила 69,3%, что меньше на 10,7%, чем у родительских форм. Однако наблюдается значимое различие (Р<0,01) в индукции каллусогенеза между линиями регенерантов. У линии СР.3.9. (10)-У-96-1051 показатель индукции составил 100%, а у КР.63-Л-6-4246 - всего 29,0%. Таким образом, как между группами образцов, так и внутри них, наблюдается значимое различие по индукции каллусогенеза.
Пролиферация каллусов в среднем проходит одинаково на контрольной и кислой средах у обеих исследуемых групп, причем у линий регенерантов ниже на 8,8 и 10,5%, соответственно. Нарастание каллусной массы на засоленной среде ниже, чем на контрольной, на 19,2% у линий регенерантов и на 14,4% - у родительских форм. Наилучшая пролиферация отмечена: на контроле (100%) у линий регенерантов КР.3.2.-Кедр и КР.63-Л-6-4246, у родительской формы - У-96-1051; чуть ниже на соленой среде у сорта Кедр, у кислых регенерантов от линии Т-136-368 и у линии С-15 достоверно на уровне (Р<0,01); на кислой среде - у У-96-1051 и КР.3.7.(7)-Т-136-368 (Р<0,05). Достоверно ниже (Р<0,01) показатель пролиферации на всех средах у дигаплоида ГДГ-281>949, только на селективных - у линии-регенеранта СР.13-С-15. У линии СР.2-У-95-1041 нарастание каллусной массы отмечено только на кислой среде.
Распределение каллусов каждого образца проводили поровну по вариантам сред, но при возникновении заражения среды с низким значением рН оказывались в выгодном отношении по сравнению с остальными, так как низкое значение рН препятствовало развитию инфекции. Это определило ее некоторые преимущества. Малочисленность выборок линий-регенерантов и их родительских форм не позволяет оценить группы в целом по реакции органогенеза и регенерации на соль и кислоту (о чем свидетельствует и оценка по Брандту-Снедекору), но можно отметить конкретные формы.
113
Таблица 2
Характеристика регенерационных процессов на селективных средах в культуре незрелых зародышей ячменя линий регенерантов и их родительских форм
Сорт, линия Введено, шт. Индукция каллуса, % Пролиферация каллуса, % Органогенез, % Образование регенерантов, %
Контроль NaCl-0,42% рН-4,0 Контроль NaCl-0,42% рН-4,0 Контроль NaCl-0,42% ,0 і Н р
Родительские формы
С-15 64 57,1 50,0 75,0* 60,0 0 50,0 0** 0 25,0 0
У-95-1041 95 63,9 66,7 50,0 50,0 0 0 12,5 16,7 0 12,5
У-96-1051 21 * * Ю~ 9 100** 33,3 85,7* 0 11,1 14,3 0 0 12,5
ГДГ-28І1-949 120 * * О ю~ 8 17,2** 19,4** * * О о~ 2 6,9 13,9 2,9* 5,0 5,56 0
Т-136-368 157 87,2** 67,9 37,1 73,3 17,9 20,0 36,7 7,1 11,4 16,7
Кедр 196 * * 91 81,8 * * °°_ 81 76,9 27,3 29,6 28,2 9,1 6,8 7,7
Среднее 653 80,0±6,4 63,9±11,6 49,5±10,0 61,0±9,7 8,7±4,7 20,8±7,1 15,8±5,8 6,3±2,6 8,1 ±3,8 8,2±2,8
Линии регенерантов
СР.13-С-15 39 73,0 50,0 20,0** 22,2** 50,0 0 0** 75,0** 0 0
СР.14-С-15 91 66,7 60,0 37,5 42,9 0 37,5 14,3 0 0 14,3
СР.1-У-95-1041 145 * * 0~ 8 52,2 23,1* 41,7 8,7 3,9 20,8 0 3,9 4,2
СР.2-У-95-1041 61 * * о со 4 0** 0** 50,0 0 0 25,0 0 0 0
СР.3.9(10)-У-96-1051 39 100** 27,3** 30,8 42,9 18,2 30,8 7,1* 0 0 15,4
СР.3-ГДГ-28І1-949 111 58,6 * * ОО 2 33,3 45,0 5,6 16,7 35,0 0 18,8 20,0
СР.4-ГДГ-28h-949 97 86,6** 26,9** 26,7 57,7 19,2 20,0 26,9 0 0 0
КР.3.7.(1)-Т-136-368 126 72,5 87,0 * * О Ю~ 7 57,6 13,0 24,1 9,1 4,4 3,5 0
КР.3.7.(7)-Т-136-368 191 * * 0~ 8 75,0 77,3** * о~ 8 28,1 11,4 13,0 0 0 4,35
КР.3.2. Кедр 122 66,7 100** 70,4 53,9 60,0* 22,2 38,5 10,0 3,7 15,4
КР.63-Л-6-4246 70 29,0** 100** 0** 50,0 0 0 12,5 0 0 0
Среднее 1092 69,3±5,8 55,1 ±9,9 35,9±8,3 49,5±4,3 18,4±6,1 15,1 ±4,0 18,4±3,6 8,1 ±6,8 2,7±1,7 6,7 ±2,4
X2 для Р<0,01 - ** 142,4 76,3 85,8 52,6 - - 32,0 47,1 - -
X2 для Р<0,05 - * - - 77,5 27,9 30,1 - 27,5 - - -
X2 для Р>0,1 6,9 11,2 12,0 16,4 18,8 22,4 17,6 10,7 18,7 21,1
Установлено, что органогенез на селективных средах пролиферации каллуса не полностью подавлялся ауксинами и в основном превышал этот показатель на контрольной среде. Это происходило в основном за счет линий-регенерантов, которые выделились на соответствующих средах. На засоленной среде лучший органогенез у «соленых» регенерантов СР.14-С-15; СР.3.9.(10)-У-96-1051; на среде с низким значением рН (4,0) у «кислых» регенерантов - КР.3.2. кедр; КР.3.7.(7)-Т-136-368.
Родительские формы выделились также на средах, соответствующих показателям устойчивости: солеустойчивый образец С-15 - на засоленной, а кислотоустойчивая линия Т-136-368 - не только на среде с рН-4,0, но и на соленой среде. КР.3.2.-Кедр по показателю органогенеза достоверно выше (Р<0,05) на контрольной среде пролиферации среди всех опытных линий (табл. 2).
«Соленые» регенеранты СР.3-ГДГ-28І1-949 и СР.2-У-95-1041 имеют регенерацию на всех селективных средах. У высокопластичного сорта Кедр отмечено образование растений-регенерантов на всех средах регенерации, родительская форма адаптивной линии У-95-1041 хорошо образовала регенеранты на кислой и на контрольной среде. СР.13-С-15 показывает хорошие результаты регенерации (Р<0,01) только на контрольной среде, СР.14-С-15 и СР.3.9. (10)-У-96-1051 - на кислой. Линии регенерантов сР.4-ГДГ-281>949 и КР.63-Л-6-4246 не образовали ни одного регенеранта.
Ранжирование биотехнологических показателей линий регенерантов и их родительских форм по устойчивости к стрессовым факторам (табл. 3) позволило сделать следующие выводы. Во-первых, в группу «лучших» по солеустойчивости вошли: солеустойчивый контроль - С-15, Кедр и Т-136-368 с регенерантами; по кислотоустой-чивости - Т-136-368, Кедр и его регенерант, а также «соленый» регенерант дигаплоида СР.3-ГДГ-28І1-949 и адаптивная линия У-96-1051. Вероятно, они обладают комплексной устойчивостью к стрессовым эдафическим факторам. Во-вторых, группу «худших» объектов по соле- и кислотоустойчивости составляют линии регенерантов СР.13-С-15 и КР.63-Л-6-4246, у которых органогенез и регенерация на селективных средах не отмечены.
Таблица 3
Ранжирование биотехнологических показателей линий регенерантов и их родительских форм
по устойчивости к эдафическим факторам
По солеустойчивости По кислотоустойчивости
Линия Сумма рангов Линия Сумма рангов
Группа «лучших» объектов
С-15 48,о Т-136-368 46,о
Кедр 45,о КР.3.2.-Кедр 41,5
КР.3.7.(1 )-Т-136-368 38,о Кедр 39,о
КР.3.2. Кедр 36,о С.Р.3-ГДГ-28h-949 38,о
Т-136-368 35,5 У-96-Ю51 38,о
Группа «худших» объектов
У-96-Ю51 19,5 КР.3.7. (1 )-Т-136-368 2о,о
У-95-Ю41 19,5 КР.63-Л-6-4246 18,5
СР.13-С-15 11,5 С-15 18,5
КР.63-Л-6-4246 9,о ГДГ-28h-949 8,о
СР.2-У-95-Ю41 9,о СР.13-С-15 7,5
Сходство и различие линий регенерантов и их родительских форм по всем показателям регенерации в условиях in vitro с использованием селективных сред оценено и при помощи кластерного анализа. Все формы разделились на четыре кластера (рис. 1). В первом и втором «кислые» регенеранты и большинство родительских форм, а исключением служит СР.13-С-15. В третьем и четвертом - адаптивная линия Т-136-368 и все «соленые» регенеранты. Такое распределение показывает высокую информативность используемого метода сравнения. Наиболее тесная корреляция со всеми формами у сорта Кедр, особенно с регенерантами линии Т-136-368.
Таким образом, происхождение линий определяет их реакцию на изменяющиеся условия в культуре тканей. Установлено, что линии регенерантов и их родительские формы в основном устойчивы только к одному из стрессовых факторов, за исключением адаптивной линии Т-136-368, сорта Кедр и его регенеранта.
1 - С-15
2 - У-95-1041
3 - У-96-1051
4 - ГДГ-28h-949
5 - Т-136-368
6 - Кедр
7 - СР.13-С-15
8 - СР.14-С-15
9 - СР.1-У-95-1041
10- СР.2-У-95-1041
11- СР.3.9(10)-У-96-1051
12- СР.3-ГДГ-28І1-949
13- СР.4-ГДГ-28І1-949
14- КР.3.7.(1)-Т-136-368
15- КР.3.7.(7)-Т-136-368
16- КР.3.2. Кедр
17- КР.63-Л-6-4246
Рис. 1. Кластеризация по максимуму коэффициента корреляций между линиями регенерантов
и их родительскими формами
Рис. 2. Кластеризация по максимуму коэффициента корреляций между признаками
1 - пролиферация на контроле;
2 - пролиферация на соленой среде;
3 - пролиферация на кислой среде;
4 - органогенез на контроле;
5 - органогенез на соленой среде;
6 - органогенез на кислой среде;
7 - регенерация на контроле;
8 - регенерация на соленой среде;
9 - регенерация на кислой среде
Рассматривая корреляции между признаками линий регенерантов и их родительскими формами (рис. 2), выявлено, что наличие конкретного стрессового фактора в среде или его отсутствие определяет изменение процессов в большей степени, чем этап культивирования. То есть исследуемые формы в большинстве своем устойчивы только к одному из стрессовых факторов. Условия взаимосвязаны теснее, чем процессы, протекающие на разных этапах культивирования. Наблюдается четкое разделение всех признаков на два кластера: в первом обособлены тесной связью все процессы, происходящие в присутствии соли; пролиферация при низком значении рН близка к пролиферации на контроле и сходны между собой отдельно стоящие органогенез и регенерация на кислой среде; во втором - органогенез и регенерация в контрольных условиях.
Литература
1. Наволоцкий, В.Д. Пути улучшения генома ячменя. Проблемы и возможности биотехнологического улучшения ячменя / В.Д. Наволоцкий // Геном ячменя и проблемы его улучшения: сб. науч. тр. - Одесса: ВСГИ, 1989. - С. 56-78.
2. Вчерашний, М.Б. Пивоваренный ячмень в Красноярском крае / М.Б. Вчерашний. - М., 1998. - 74 с.
3. Шевелуха, В.С. Периодичность роста сельскохозяйственных растений и пути ее регулирования / В.С. Ше-велуха. - М.: Колос, 1980. - 455 с.
4. Сурин, Н.А. О повышении адаптивности ячменя к экстремальным условиям Восточной Сибири / Н.А. Сурин, Н.Е. Ляхова, Н.В. Зобова // Вестн. Рос. акад. с.-х. наук. - 1999. - № 4. - С. 14-17.
5. Хориков, Н.Л. Образцы ячменя, пригодные для выращивания на солонцовых почвах / Н.Л. Хориков // Селекция и семеноводство. - 1990. - №3. - С. 22-23.
6. Регенерация растений в первичном каллусе, полученном от незрелых зародышей / С.Е. Дунаева, М.В. Лукьянова, О.Н. Ковалева [и др.] // Физиология растений. - 2000. - Т. 47. - № 1. - С. 53-57.
7. Бутенко, Р.Г. Биотехнология растений: культура клеток / Р.Г. Бутенко. - М.: Агропромиздат, 1989. - 290 с.
8. Сельскохозяйственная биотехнология: учеб. пособие / В.С. Шевелуха, С.В. Калашникова, Е.З. Кочиева [и др.]; под ред. В.С. Шевелухи. - М.: Высш. шк., 1998. - 416 с.
