CC BY
9
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XII, № 2, 2016
13 суток. Однако, если уровень < 0,2 млн. КОЕ-ГСК/кг, то необходимо повторить мобилизацию и лейкоцитаферез. В противном случае трансплантация не гарантирует восстановление кроветворения нейтрофилов в пределах 13 суток, что сопряжено с высоким риском осложнений. Данные критерии количества и качества трансплантата можно рекомендовать для его заготов-
ки только с учетом риска снижения указанных параметров на этапах криоконсервации.
Вывод: Трансплантация ГСК в количестве 4 млн. ГСК/кг и при колониеобразующей активности данных клеток 0,2 млн. КОЕ-ГСК/кг позволяет восстановить кроветворение нейтрофи-лов не позднее 13 суток, что уменьшает риски инфекционных осложнений.
Костюнина В. С., Войтехович А. С., Васина Е. В., Фурман О. Г., Северин И. Н., Петевка Н. В.
Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий, г. Минск, Республика Беларусь
УСЛОВИЯ ЭРИТРОИДНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
ПУПОВИННОЙ КРОВИ IN VITRO
В последнее десятилетие в мире активно разрабатываются подходы к эффективной эритро-идной дифференцировке in vitro. Показано, что гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) периферической крови, костного мозга, фетальной печени и пуповинной крови можно дифференцировать in vitro до стадии утраты клеточного ядра (ретикулоциты, эритроциты). В 2011 году в работе M. Giarratana описано первое переливание пациенту полученных in vitro из гемопоэтических предшественников периферической крови, ауто-логичных эритроцитов и показана их циркуляция в кровотоке в течение 26 дней. Пуповинная кровь является наиболее перспективным источником получения зрелых эритроцитов не только благодаря пролиферативному потенциалу ГСК, но и из-за меньшего риска передачи инфекций при трансфузии, а также благодаря доступности и безопасности получения исходного биоматериала, который в нашей республике, в основном, подвергается утилизации.
Цель. Сравнить эффективность эритроидной дифференцировки ГСК пуповинной крови человека в условиях суспензионной культуры (по методу M. Giarratana) и дополнительного сокульти-вирования со стромальными клетками in vitro.
Материалы и методы. Образцы пуповинной крови, пуповины и плаценты были предоставлены ГУ РНПЦ «Мать и дитя» Минздрава Республики Беларусь после информирования рожениц и получения их письменного согласия. Образцы костного мозга здоровых доноров получали из центра трансплантации органов и тканей на базе УЗ «9-я ГКБ» г. Минска. Фракцию CD34-положительных (CD34+) кроветворных клеток получали с помощью набора EasySep для поло-
жительной иммуномагнитной сепарации согласно протоколу производителя. Первый этап диф-ференцировки проводили в течение 7 суток в суспензионной культуре в присутствии ростовых факторов SCF, 1Ь-3, Еро. На втором этапе диффе-ренцировки часть клеток переносили на подложку мезенхимных стромальных клеток костного мозга (МСК КМ) и параллельно культивировали еще в течение 4 суток в присутствии SCF и Еро. На 11 сутки неприкреплённую к строме (суспензионную) часть гемопоэтических клеток переносили в новый флакон и продолжали дифференцировать клетки параллельно в трёх вариантах культивирования в присутствии Еро в течение еще 6 суток. Оценка фенотипа гемопоэтических клеток пуповинной крови производилась методом проточной цитофлуориметрии на проточном цитофлуориметре FACScan. Проводили цитологический анализ дифференцируемых клеток.
Результаты. Чистота фракции CD34+-клеток пуповинной крови после сепарации в среднем составляла 73 ± 18 %. Культивирование CD34+ клеток в течение первых 7 суток в отсутствие стромального окружения коммитирует их в направлении эритроидной дифференцировки. Клетки практически полностью теряют поверхностные маркеры CD34 и CD45, 77 ± 5 % клеток несут маркеры эритроидных предшественников CD36 и CD235a. Прирост ядросодержащих клеток на первом этапе дифференцировки составлял до 200 раз. На 17-е сутки дифференцировки доля безъядерных клеток, которые могут быть представлены как ретикулоцитами, так и эритроцитами, в варианте без использования стро-мальной подложки была наибольшей и составляла 43 % от всех клеток. В других двух вариан-
«АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ»
Санкт-Петербург 23-24 июня 2016 г.
тах количество безъядерных клеток варьировало от 22 до 29 %. Доля оксифильных нормобластов (стадия созревания, предшествующая ретикуло-цитам) в варианте без подложки составила 56 %, в суспензионной и адгезивной культурах — 72 и 68 %, соответственно. Несмотря на то, что дифференцировка CD34+ клеток в условиях бес-стромального культивирования прошла за тот же период более полно, кратность увеличения клеточной массы в этом случае была в среднем в 5,3 раза ниже в сравнении с вариантами дополнительного сокультивирования с МСК. В результате кратность увеличения общего количества ретикулоцитов в двух последних вариантах культивирования была выше более чем в 3 раза. О накоплении клетками гемоглобина свидетель-
ствовал осадок красного цвета, полученный при седиментации клеток. Содержание гемоглобина в среднем составляло 20 пг/клетку (по литературным данным зрелый эритроцит содержит 27-30 пг/клетку).
Выводы. Разработан метод трёхстадийной эритроидной дифференцировки стволовых клеток пуповинной крови in vitro до стадии окси-фильного нормобласта/эритроцита с кратностью прироста— 19 070 ± 3 740 раз. Проведение этапа сокультивирования эритроидных предшественников с МСК КМ на 7-17 сутки эритродиф-ференцировки приводит к дополнительному увеличению прироста предшественников эритроид-ного ряда.
Костяев А. А., Утемов С. В.
ФГБУН «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства», г. Киров
НОВЫЙ СПОСОБ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Трансплантации криоконсервированных ге-мопоэтических стволовых клеток (ТГСК) остаются в 2016 году одним из эффективных методов коррекции костномозговой недостаточности различной этиологии. Между тем, накопленный за более чем 30-летний опыт многочисленных ТКГСК выявил круг проблем, решение которых требует углублённой научной разработки. Распространённая в настоящее время технология азотного консервирования ГСК несовершенна. Она отличается дороговизной, сложностью подготовительных этапов, требует использования дефицитного жидкого азота, токсичного этилового спирта, содержит элементы опасности инфицирования и повреждения консервированных клеток, несет риск посттрансфузионных осложнений. Поэтому поиск новых медицинских технологий, сочетающих в себе высокую эффективность с наименьшими затратами, является важнейшей проблемой современного здравоохранения в условиях ограниченности экономических ресурсов.
Альтернативой консервации биообъектов в жидком азоте или его парах при температуре -150°^-196°С с постоянной скоростью охлаждения являются методы быстрого двухступенчатого замораживания. Важно, что новые технологии безопасны, эффективны, менее затратны, просты
в осуществлении, надёжны и доступнее жидко-азотных. Для их воспроизведения могут быть использованы сравнительно простые, дешёвые и надёжные криостаты и нетоксичные, стерильные хладагенты.
Цель. Разработать новый высокотехнологичный, нетоксичный, эффективный и доступный для практической медицины способ криоконсер-вирования ГСК.
Материалы и методы. В основу работы положены исследования свойств нового теплоносителя — сухих обеззараженных термогранул Lab Armor (взамен этилового спирта) в качестве хладагента консервируемых ядросодержащих клеток донорской крови (ЯКДК). Первоначально концентраты ЯКДК с ГСК получали методом сепарации на аппарате Amicus в объеме от 38,0 до 81,0 (56,3 ± 7,3) мл, закрытым способом переводили в стандартную эластичную полимерную упаковку и смешивали с 10 % раствором крио-консерванта диметилсульфоксида (ДМСО) при +4 ± 1оС. Далее производили сборку устройства для холодовой адаптации полученной клеточной взвеси. При этом «Термоконтейнер ТМ-20» для временного хранения и транспортирования термонеустойчивых медицинских и других препаратов выкладывали изнутри в виде прямоугольной ячейки хладоэлементами МХД-2 с раствором
