CC BY
66
УДК 579.67
УСКОРЕННЫЙ МЕТОД ИНДИКАЦИИ САЛЬМОНЕЛЛ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
Е.О. Чугунова, канд. ветеринар. наук, доцент; Н.А. Татарникова, д-р ветеринар. наук, профессор, ФГБОУ ВО Пермская ГСХА, ул. Петропавловская, 23, г. Пермь, Россия, 614990 E-mail: [email protected]
Аннотация. На базе Пермского ветеринарного диагностического центра Пермского края в 2014 - 2015 гг. проводилась разработка ускоренного метода индикации бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах. Работали как со штаммами сальмонелл (S. Typhimutium, S. Enteritidis, S. Gallinarum-Pullorum, S. Dublin, S. Cholerae-suis, S. Infantis, S. Hamburg, S. Vir-chow), так и с прочими патогенными микроорганизмами (Shigella flexneri, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes). При этом использовали две питательные среды для неселективного обогащения сальмонелл: модифицированную забуференную пептонную воду (МЗПВ), которая служила опытом; стандартную забуференную пептонную воду (ЗПВ) (контроль). В результате исследований подобран индикатор, способный изменять цвет питательной среды с желтого на красный при положительной пробе на сальмонеллез, что фиксируется визуально и с помощью фотоэлектроколориметра. В результате рекомендуем вносить 1,0 мл индикатора Андраде в 225 мл МЗПВ после 18-часовой инкубации с испытуемым образцом пищевого продукта. Данный факт имеет огромное практическое значение, т.к. позволяет на вторые сутки лабораторных испытаний предположить наличие бактерий рода Salmonella в исследуемом продукте, не применяя при этом дорогостоящих реактивов и оборудования.
Ключевые слова: сальмонеллы, пищевые продукты, исследования, модифицированная за-буференная пептонная вода, индикатор Андраде.
Введение. Сальмонеллезы как в этиологическом, так и в клиническом отношении являются самостоятельной группой инфекционных болезней - крайне сложной по типови-довому составу возбудителей [1, 2, 3, 4]. Принимая во внимание полиэтиологичность заболевания и разнообразие клинических форм, бессимптомное носительство, по-прежнему актуальной остается проблема выявления бактерионосителей [5]. При этом туши и органы, полученные от таких животных, выпускают в продажу без ограничений, а контаминирован-ные сальмонеллами продукты и корма не имеют органолептических изменений. Данные микроорганизмы могут присутствовать в изучаемых объектах в незначительных количествах и преимущественно в сочетании с другой микрофлорой, что также затрудняет их выделение методом классического бактериологического анализа [6]. Ряд российских и зарубежных ученых работают над проблемой выделения сальмонелл из патологического материала и разработкой питательных сред [7,
8, 9]. Меньшенин В.В. и др. (2010) предлагают использовать питательную среду, в основу которой заложен гидролизат форменных элементов крови с содержанием аминного азота 700...900 мг%. Панасовец О.П. (2007) в качестве источника питательных веществ для сальмонелл рекомендует использовать экстракт кормовых дрожжей. Галиакберова Н.И. (2001) указывает на значение аминокислот в качестве фактора роста сальмонелл. Проведя сравнительную оценку эффективности разных питательных сред для экспресс-индикации сальмонелл, Пашкова А.П. (2006) пришла к выводу, что все известные среды являются эффективными, но укороченная инкубация возможна только в случае высокой степени обсеменения продукта. Таким образом, проблема ускоренного выделения сальмонелл из пищевых продуктов остается открытой, и задача наших исследований - разработка доступного и дешевого метода индикации Salmonella spp.- весьма актуальна. Только новый подход к проблеме диагностики сальмонел-
леза позволит существенно снизить риск возникновения пищевых токсикоинфекций среди людей, что определило выбор темы исследований.
Целью научных исследований является разработка ускоренного метода индикации бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах.
Для достижения данной цели поставлены следующие задачи:
- подобрать индикатор, показывающий кислую реакцию среды;
- усовершенствовать этап обогащения сальмонелл, определяемых в пищевой продукции.
Методика. Работа выполнена в бактериологическом отделе ГБУВК «Пермский ветеринарный диагностический центр» в период с 2014 по 2015 год. Материалом для исследования служили штаммы S. Typhimutium, S. En-teritidis, S. Gallinarum-Pullorum, S. Dublin, S. Cholerae-suis, S. Infantis, S. Hamburg, S. Vir-chow, Shigella flexneri, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, полученные из ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России и выделенные из мясной и яичной продукции (всего 39 штаммов). Метод исследования - бактериологический. В работе использовали две питательные среды для неселективного обогащения сальмонелл:
- модифицированную забуференную пеп-тонную воду (МЗПВ), которая служила опытом (патент № 2570386);
- забуференную пептонную воду (ЗПВ), приготовленную по ГОСТ 31659-2012 (контроль).
После инкубации при 37 °С в течение 18±2 ч в опытные и контрольные образцы вносили индикатор Андраде и определяли изменение цвета питательной среды.
Результаты. Известно, что сдвиг реакции МЗПВ в кислую сторону позволяет предположить наличие бактерий рода Salmonella в исследуемой пробе продукта [16]. Однако, учитывая массовый характер исследований и загруженность специалистов ветеринарных лабораторий, мы поставили под сомнение эффективность использования рН-метра для оценки кислотности МЗПВ после этапа несе-
лективного обогащения сальмонелл. Поэтому параллельно с ионометрическим измерением кислотности среды использовали индикатор Андраде. Известно, что в щелочной, нейтральной и слабокислой среде индикатор не изменяет цвет испытуемой жидкости, а при рН 6,5 и ниже происходит переход в красный цвет [17].
Опытным путем определили количество индикатора, требуемое для изменения окраски МЗПВ с желтой на красную при условии кислой реакции среды. Для этого в опытные образцы вводили от 0,1 до 2,0 см3 индикатора Андраде с шагом 0,1 см3. Визуально видимое изменение окраски произошло при введении индикатора в объеме 0,5 см3 и более, при этом интенсивность окрашивания усиливалась прямо пропорционально количеству добавленного индикатора.
Также определили время, в течение которого необходимо учитывать результат. В итоге оказалось, что для 225 см3 МЗПВ с сальмонеллами оптимальное количество индикатора Андраде составляет 1,0 см3, а изменение окраски происходит в течение 10-15 секунд.
Аналогичные испытания были проведены нами с Proteus vulgaris, E. coli, S. aureus, Listeria monocytogenes и Shigella flexneri. После внесения вышеперечисленных культур в МЗПВ и инкубирования при 37°С, во флаконы вводили по 1,0 см3 индикатора Андра-де, при этом среда как контрольных, так и опытных образцов сохраняла исходное желтое окрашивание.
Кроме визуальной оценки изменения окрашивания контрольных и опытных образцов неселективной питательной среды мы использовали фотоэлектроколориметр (ФЭК) КФК-3. Исходя из цвета испытуемых растворов, были выбраны синий и зеленый светофильтры, длина волны 420 и 500 нм, соответственно. Кювету подбирали так, чтобы оптическая плотность испытуемых растворов находилась в интервале от 0,1 до 1,0, чему соответствовала кювета с длиной прохождения света 10 мм. Раствор сравнения выбирали согласно закону аддитивности (Аизмерения = Учитывали, что в качестве раствора сравнения можно использовать аликвотную часть исследуемого раствора, содержащего все добавлен-
ные компоненты, кроме реагента, образующего с определяемым веществом окрашенное соединение. Если добавляемый реагент и все остальные компоненты раствора сравнения бесцветны и, следовательно, не поглощают лучей в видимой области спектра, то в качестве раствора сравнения можно использовать
дистиллированную воду [18, 19]. На основании вышесказанного, контрольные и опытные образцы фотоэлектроколометрировали как против дистиллированной воды, так и против МЗПВ. Результаты измерений отражены на рисунке.
•»•» контроль — опыт
E
1,245
D.614
0.399
0.366
0277
а - длина волны 420 нм, раствор сравнения -дистиллированная вода
0.431 0.419 0,461
И i
I a f
s -
б - длина волны 500 нм, раствор сравнения -дистиллированная вода
1,4 -| 1,2 -1 -0,8 -0,6 -0,4 -
0.281 0 ^ 0.284
—контроль
в - длина волны 420 нм, раствор сравнения -модифицированная забуференная пептонная вода
г - длина волны 500 нм, раствор сравнения -модифицированная забуференная пептонная вода
Рис. (а, б, в, г) Результат фотоэлектроколометрирования контрольных и опытных образцов неселективной питательной среды, Е - оптическая плотность
E
E
1,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0.274
0
На рисунке видна разница показаний ФЭК при измерении оптической плотности опытных и контрольных образцов питательной среды. Опытные образцы имели большую оптическую плотность по сравнению с контрольными. Исключением являются пробы, обсемененные Choleraesшs, штаммы данного серотипа, как показали наши исследования, не способны ферментировать пропи-ленгликоль и продуцировать из него кислоту.
Выводы. Подобран индикатор, способный изменять цвет питательной среды при положительной пробе на сальмонеллез, что фиксируется визуально и с помощью ФЭК. Дан-
ный факт имеет огромное практическое значение, т.к. позволяет на вторые сутки исследований предположить наличие бактерий рода Salmonella в исследуемом продукте, не применяя при этом дорогостоящих реактивов и оборудования.
В заключение необходимо отметить:
- в присутствии сальмонелл 1,0 см индикатора Андраде меняет цвет МЗПВ с желтого на красный в течение 10-15 секунд;
- использование модифицированной за-буференной пептонной воды существенно сокращает срок определения сальмонелл в пищевой продукции.
Литература
1. Зверев Е. И. Дизентерия, пищевые токсикоинфекции и кишечные инвазии М.: изд-во медицинской литературы, 1962. 263 с.
2. Joseph A. Odumeru and Carlos G. Leôn-Velarde. Salmonella Detection Methods for Food and Food Ingredients. January. 2012 Р. 373-392. [Электронный ресурс]. Систем. требования: Adobe Acrobat Reader. URL: http://www.intechopen.com/books/salmonella-a-dangerous-foodborne-pathogen/salmonella-detection-methods-for-food-and-food-ingredients (дата обращения: 07.05.2013).
3. Reeves M., Evins G., Heiba A., Plikaytis B. and Farmer J. Clonal nature of Salmonella typhi and its genetic relat-edness to other salmonellae as shown by multilocus enzyme electrophoresis, and proposal of Salmonella bongori comb. J Clin Microbiol, 1989, No 11(27), рр. 313-320.
4. Sébastien C. Sabbagh, Chantal G. Forest, Christine Lepage, Jean-Mathieu Leclerc and France Daigle. So similar, yet so different: uncovering distinctive features in the genomes of Salmonella enterica serovars Typhimurium and Typhi. [Электронный ресурс]. Систем. требования: Adobe Acrobat Reader. URL: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1574-6968.2010.01904.x/full (дата обращения: 15.01.2012).
5. Руководство по ветеринарно-санитарной экспертизе и гигиене производства мяса и мясных продуктов / Ю. Г. Костенко [и др.] / под ред. д-ра ветеринар. наук, проф. М. П. Бутко; д-ра вет. наук, проф. Ю. Г. Костенко. 2-е изд., испр. и доп. М. : РИФ «Антиква», 1994. 607 с.
6. Стрелков А. А. Влияние иммуно-магнитосорбции на морфологию популяции сальмонелл // Ветеринария. 2010. № 9. С. 40-42.
7. Юнусова Р. Ю. Разработка хромогенных питательных сред для выделения и ускоренной идентификации условно патогенных энтеробактерий : дис ...канд. биол. наук. Махачкала, 2011. 135 с.
8. Соколов Д. М., Соколов М.С. Ускоренные методы выявления бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах и сырье // Вопросы питания. 2013. № 1 (82). С. 33-40.
9. Султанов З.З. Разработка и усовершенствование технологий получения микробиологических питательных основ и сред : дис. ... д-ра. биол. наук, Махачкала, 2008. 271 с.
10. Меньшенин В. В., Школьников Е. Э., Раевский А. А. Культивирование вакцинных штаммов сальмонелл с использованием питательных сред из нетрадиционных источников сырья // Достижения науки техники АПК. 2010. № 8. С. 65-66.
11. Панасовец О. П. Разработка жидкой питательной среды накопления для выделения сальмонелл из водных объектов : дис. ... канд. биол. наук. Москва, 2007. С. 47-49.
12. Галиакберова Н. И. Изыскание питательной среды и оптимальных условий культивирования сальмонелл: дис. ... канд. биол. наук. Казань, 2001. С. 49.
13. Пашкова А. П. Совершенствование элективных питательных сред и биологические свойства свежевыде-ленных эшерихий и сальмонелл : дис. ... канд. биол. наук. Курск, 2006. С. 50-54.
14. Приемопередающее устройство : пат. 2570386 Рос. Федерация. № 2014136524/15; заявл. 08.09.14; опубл. 10.12.15, Бюл. № 34. 5 с.
15. ГОСТ 31659-2012. Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella. Москва. : Стандар-тинформ, 2014. 24 с.
16. Чугунова Е. О., Татарникова Н. А., Мауль О. Г. Сравнительный анализ питательных сред для неселективного обогащения сальмонелл // Вестник ветеринарии. 2015. № 75. С. 51-54.
17. Словарь терминов микробиологии [Электронный ресурс]. Систем. требования: Adobe Acrobat Reader. URL: http://dic.academic.ru/dic.nsf/dic_microbiology (дата обращения: 12.12.2014).
18. Волькенштейн М. В. Биофизика. М. : Наука, 1981. 592 с.
19. Рубин А.Б. Биофизика. Кн. 1, 2. М.: Высшая школа, 1987. 319 с.
RAPID METHOD OF SALMONELLA SPP. INDICATION IN FOODSTUFF
E.O. Chugunova, Cand. Vet. Sci., Associate Professor N.A. Tatarnikova, Dr. Vet. Sci., Professor Perm State Agricultural Academy 23, Petropavlovskaya St., Perm 614990 Russia E-mail: [email protected]
ABSTRACT
The article shows a problem of Salmonella spp. allocation from foodstuff by classical bacteriological method and proposes the simple and practical solution of the matter. The purpose of scientific research was development of the accelerated method of Salmonella spp. indication in foodstuff. Laboratory research was carried out in Permskii Krai in 2014 - 2015. We used strains of salmonellas (S.
Typhimutium, S. Enteritidis, S. Gallinarum-Pullorum, S. Dublin, S. Cholerae-suis, S. Infantis, S. Hamburg, S. Virchow), and other pathogenic microorganisms (Shigella flexneri, Escherichia coli,
Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes). Thus, two nutrient mediums were used for not selective enrichment of Salmonella spp. : 1. Modified buffering pepton water (MBPW) which served as experiment; 2. Standard buffering pepton water (BPW) (control). Investigation resulted in selecting an indicator capable of changing color of a nutrient medium from yellow to red in positive salmonella's test. That fact is fixed visually and by photoelectric colorimeter. As a result, we recommend introducing of 1.0 ml of the Andrade's indicator in 225 ml of MBPW after 18-hour incubation with a foodstuff sample. This fact has huge practical value since it allows assuming presence of Salmonella spp. in the test product on the second day of laboratory research, without applying expensive reactants and equipment.
Key words: Salmonella spp., foodstuff, research, modified buffering pepton water, Andrade's indicator.
References
1. Zverev E.I. Dizenteriya, pishchevye toksikoinfektsii i kishechnye invazii (Dysentery, food toxicoinfections and intestinal invasions), Moscow: publishing house of medical literature, 1962, 263 p.
2. Joseph A. Odumeru and Carlos G. Leon-Velarde. Salmonella Detection Methods for Food and Food Ingredients. January, 2012 p. 373-392. URL: http://www.intechopen.com/books/salmonella-a-dangerous-foodborne-pathogen/salmonella-detection-methods-for-food-and-food-ingredients
3. Reeves M., Evins G., Heiba A., Plikaytis B. and Farmer J. Clonal nature of Salmonella typhi and its genetic relat-edness to other salmonellae as shown by multilocus enzyme electrophoresis, and proposal of Salmonella bongori comb. J Clin Microbiol, 1989, No 11(27), pp. 313-320.
4. Sébastien C. Sabbagh, Chantal G. Forest, Christine Lepage, Jean-Mathieu Leclerc and France Daigle. So similar, yet so different: uncovering distinctive features in the genomes of Salmonella enterica serovars Typhimurium and Typhi. URL: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1574-6968.2010.01904.x/full
5. Rukovodstvo po veterinarno-sanitarnoi ekspertize i gigiene proizvodstva myasa i myasnykh produktov (Guide to veterinary and sanitary expertise and hygiene of production of meat and meat products) / ed. by Yu.G. Kostenko and others , 2nd revised edition, Moscow: REEF "Antikva", 1994, 607 p.
6. Strelkov A.A. Vliyanie immuno-magnitosorbtsii na morfologiyu populyatsii sal'monell (Influence of immuno-magnitosorbtion on morphology populations of salmonellas), Veterinariya (Veterinary science), 2010, No. 9, pp. 40 - 42.
7. Yunusova R. Yu. Razrabotka khromogennykh pitatel'nykh sred dlya vydeleniya i uskorennoi identifikatsii uslovno patogennykh enterobakterii (Development the chromogenic nutrient mediums for allocation and the accelerated identification of opportunistic pathogenic enterobacteria), thesis ... cand. biol. sci., Makhachkala, 2011, 135 p.
8. Sokolov D. M., Sokolov M.S. Uskorennye metody vyyavleniya bakterii roda Salmonella v pishchevykh produktakh i syr'e (Rapid methods for the genus Salmonella bacteria detection in food and raw materials), Voprosy pitaniya (Questions of food), 2013, Issue 82, No. 1, pp. 33 - 40.
9. Sultanov Z.Z. Razrabotka i usovershenstvovanie tekhnologii polucheniya mikrobiologicheskikh pitatel'nykh osnov i sred (Development and improvement of receiving technologies for microbiological nutritious bases and mediums), thesis. d. biol. sci., Makhachkala, 2008, 271 p.
10. Men'shenin V. V., Shkolnikov E. E., Raevskii A. A. Kul'tivirovanie vaktsinnykh shtammov sal'monell s ispol'zovaniem pitatel'nykh sred iz netraditsionnykh istochnikov syr'ya (Cultivation of vaccine's strains of Salmonella spp. on the nutrient mediums from nonconventional sources of raw materials), Dostizhenija nauki tehniki APK (Achievements of science of equipment of agrarian and industrial complex), 2010, No. 8, pp. 65 - 66.
11. Panasovets O. P. Razrabotka zhidkoi pitatel'noi sredy nakopleniya dlya vydeleniya sal'monell iz vodnykh ob"ektov (Development of a liquid nutrient medium of accumulation for allocation of Salmonella spp. from water objects), thesis ... cand. biol. sci., Moscow, 2007, pp. 47 - 49.
12. Galiakberova N. I. Izyskanie pitatel'noi sredy i optimal'nykh uslovii kul'tivirovaniya sal'monell (Research of a nutrient medium and optimum conditions for Salmonella's cultivation), thesis ... cand. biol. sci., Kazan, 2001, p. 49.
13. Pashkova A.P. Sovershenstvovanie elektivnykh pitatel'nykh sred i biologicheskie svoistva svezhevydelennykh esherikhii i sal'monell (Improvement of elective nutrient mediums and study biological properties of isolated Escherichia spp. and Salmonella spp), thesis ... cand. biol. sci., Kursk, 2006, pp. 50 - 54.
14. Patent No 2570386 Russian Federation. No. 2014136524/15; notice 08.09.2014; publication 10.12.2015, Bulletin No. 34, 5 p.
15. GOST 31659-2012 Produkty pishchevye (Food products). Metod vyyavleniya bakterii roda Salmonella (Method for the detection Salmonella). Moscow: Standartinform, 2014, 24 p.
16. Chugunova E.O., Tatarnikova N. A., Maul' O. G. Sravnitel'nyi analiz pitatel'nykh sred dlya neselektivnogo obo-gashcheniya sal'monell (The comparative analysis of nutrient mediums for non-selective enrichment of Salmonella), Vestnik veterinarii (Veterinary herald) 2015, No. 75, pp. 51-54.
17. Slovar' terminov mikrobiologii [Elektronnyi resurs] (Glossary of microbiology terminology), URL: http://dic.academic.ru/dic.nsf/dic_microbiology.
18. Vol'kenshtein M. V. Biofizika (Biophisics), Moscow: Science, 1981, 592 p.
19. Rubin A.B. Biofizika (Biophisics), Vol. 1, 2, Moscow: The higher school, 1987, 319 p.
