CC BY
28
2. ВЕТЕРИНАРНАЯ МЕДИЦИНА
УДК 619:577.122:616.98:578.825.1:615.371:636.52/.58
УРОВЕНЬ ПОКАЗАТЕЛЕЙ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА В ОРГАНИЗМЕ ЦЫПЛЯТ В ДИНАМИКЕ ВАКЦИНАЦИИ ДНК-ВАКЦИНОЙ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ МАРЕКА
В. С. БОЙКО, Е. П. РУДЕНКО, Ю. Н. КРОТОВСКАЯ
ННЦ «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины» НААНУ,
г. Харьков, Украина, 61023
(Поступила в редакцию 10.03.2016)
Резюме. В статье представлены данные относительно изменений активности трансаминаз, уровня общего белка и продуктов белкового обмена, а именно мочевой кислоты и креатинина в сыворотке крови цыплят при иммунизации ДНК-вакциной против болезни Марека и заражении. В результате проведенных исследований установлен положительный профиль значений ферментов АсАТ и АлАТ (повышение активности ферментов в начале опыта и постепенное восстановление до физиологического уровня в конце), а также повышенную концентрацию мочевой кислоты и креатинина (р<0,05) в течение всего срока наблюдений. Такая динамика изменений может указывать на усиление наработки макроэргических соединений, направленных на синтез антител защитного уровня.
Ключевые слова: вакцинация, ДНК-вакцина, креатинин, мочевая кислота, общий белок, трансаминазы, цыплята.
Summary. This paper presents data on the changes in the activity of transaminase, levels of total protein and protein metabolism products, that is uric acid and creatinine in chicken blood serum at immunization with DNA vaccine against Marek's disease and at infection. These studies established a positive profile values of AST and ALT enzymes (increased enzyme activity at the beginning of the experiment and a gradual reduction to the physiological level at the end of the experiment), as well as an increased concentration of uric acid and creatinine (p<0,05) throughout the observation period . Such dynamic pattern may indicate the strengthening of high-energy compounds development aimed at the synthesis of antibodies ofprotective level.
Key words: vaccination, DNA-vaccine, creatinine, chicken, uric acid, total protein, transaminase.
Введение. В условиях крупномасштабного птицеводства одним из основных способов противостояния инфекционным болезням является вакцинопрофилактика. На сегодня с помощью вакцин проводится профилактика более 16 инфекций (вирусных, бактериальных и паразитарных). Среди вирусных инфекций часто встречается болезнь Марека. Вакцинопрофилактика этого заболевания проводится в раннем возрасте с применением живых клеточноассоциированных вакцин из аттенуи-рованных и естественно апатогенных штаммов или сухих вакцин из авирулентного для цыплят штамма герпеса индеек [4]. На сегодня обращает на себя внимание направление «генетической иммунизации» с применением ДНК-вакцин на основе вирусной векторной системы, которое имеет ряд преимуществ, особенно важным из которых является активация гуморального и клеточного иммунного ответа [11].
Анализ источников. За 200 лет существования вакцин форма и содержание этих иммунных препаратов претерпели существенные изменения: Э. Дженнер инфицировал царапины содержимым оспинных пустул, Л. Пастер вводил ослабленные инфекционные агенты шприцем, затем научились создавать вакцины из инактивированных возбудителей (сплит- и субъединичные вакцины), недавно начали использовать рекомбинантные вакцины, содержащие один или несколько антигенов (обычно белковых), и последним достижением вакцинопрофилактики стали вакцины, синтезированные генно-инженерным путем [10].
Начало ДНК-вакцинологии связывают с работами Д. Танга (1992 г.), в которых была показана способность плазмидной ДНК, экспрессирующей гормон роста человека, индуцировать выработку антител.
По структуре ДНК-вакцина - это встроенная в вектор нуклеотидная последовательность, кодирующая определенный антиген. Вектор - молекула нуклеиновой кислоты, которая служит для доставки генетического материала в клетки и обеспечивает его репликацию или экспрессию. Также ДНК-вакцина должна содержать регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии генов в клетках эукариот [9, 11].
Для ветеринарии уже более 20 лет в различных лабораториях мира разрабатываются ДНК-вакцины: против бычьего и лошадиного герпесвирусов, собачьего вируса чумы, вируса классической свиной лихорадки, кроличьей папилломы, ящура, вируса инфекционного гемопоэтического некроза, вируса гриппа, вируса японского энцефалита, вируса бешенства, вируса везикулярного стоматита и т. д. [6]. Много ДНК-вакцин создается для борьбы с вирусными, бактериальными и эукариотическими патогенами рыб [10]. Активно разрабатываются ДНК-вакцины и для повышения неспецифического иммунитета птиц. Но несмотря на многолетний опыт, такие вакцины практически не используются в клинической практике. Это связано с тем, что пока ученые не нашли ответы на ряд вопросов, касающихся в первую очередь безопасности ДНК-вакцин и влияния на организм животных, поэтому работа в этом направлении является актуальной.
Цель работы - изучение динамики активности трансаминаз и уровня метаболитов белкового обмена, а именно мочевой кислоты и креатинина в сыворотке крови цыплят после вакцинации ДНК-вакциной и при экспериментальном течении болезни Марека.
Материал и методика исследований. В опыте использовали интактных суточных цыплят породы Белый леггорн из благополучного по инфекционным болезням птицехозяйства. Все работы проводили в соответствии с принципами Европейской конвенции о защите позвоночных животных (Страсбург, 1986) и «Общими принципами экспериментов на животных», одобренными I Национальным конгрессом по биоэтике (Киев, 2001).
Было сформировано 4 группы цыплят-аналогов по 15 голов в каждой.
Цыплятам первой опытной группы вводили внутримышечно плазмидную ДНК в дозе 110 нг с липосомальным комплексом 10 мМ СТАВ-фосфатидилхолина (молярная часть СТАВ - 0,5 % (по 150 мкл)), которая разработана в лаборатории молекулярной эпизоотологии и диагностики ННЦ «ИЭКВМ».
Птице второй опытной группы вводили плазмидную ДНК в дозе 110 нг с липосомальным комплексом 10 мМ СТАВ-фосфатидилхолина (молярная часть СТАВ - 0,5 % (по 150 мкл)). Одновременно внутримышечно вводили иммуностимулятор Cythosol-AVI (разработчик ННЦ «ИЭКВМ») в дозе 100 мкл.
Цыплята третьей опытной группы оставались интактными до момента инфицирования вирусом БМ (контроль инфекционной активности).
Птица четвертой опытной группы была интактной (контроль физиологического развития).
На 21 -е сутки после прививки цыплят всех опытных групп заражали контрольным штаммом 1М-иА вируса болезни Марека (ВБМ) с инфекционной активностью 10000 ФОЕ/мл в дозе 0,5 мл/цыпленка.
В течение 89 суток вели наблюдения за поведением и клиническим состоянием птицы. На 47-, 68-, 89-е сутки опыта по 5 голов птицы из каждой группы были эутаназированы и обескровлены. Полученные образцы сывороток крови замораживали при температуре минус (22±1)°С для дальнейших исследований.
Активность ферментов аланин- (АлАТ; КФ 2.6.1.2) и аспартатаминотрансфераз (АсАТ; КФ 2.6.1.1), а также концентрацию общего белка, альбумина, мочевой кислоты и креатинина проводили с использованием стандартных наборов реактивов производства фирмы Р. Ъ. CORMAY (Польша).
Математическая обработка результатов была проведена с помощью пакета статистического анализа Statistica 6.0. Различия между сравниваемыми показателями считали достоверными при р<0,05.
Результаты исследований и их обсуждение. К числу показателей, которые с одинаково высокой степенью характеризуют наличие эндотоксикоза и стрессорную реакцию организма, относятся и трансаминазы - аспартат- и аланинаминотрансфераза [3, 7].
Анализируя данные, приведенные в табл. 1, был сделан вывод о повышении активности аспартатаминотрасферазы в сыворотке крови вакцинированных цыплят и невакцинированной группы в течение всего срока наблюдений. Но в начале опыта (47-е сутки) отмечали снижение активности фермента на 10,0 % у цыплят 2-й группы и повышение - на 16,6 % (р<0,05) у цыплят 3-й группы относительно уровня в контрольной группе. На следующем сроке (68-е сутки) повышение активности АсАТ у цыплят 1-й вакцинированной группы составляло 10,9 % (р<0,05), у цыплят 2-й вакциновано! группы - 12,6 % (р<0,05), а у цыплят инфицированной (3-й) группы - 22,4 % (р<0,05). На 89-е сутки эксперимента изменения уровня этого фермента регистрировали у птицы всех опытных групп: на 12,5 % (р<0,05), 9,80 % (р<0,05) и на 27,6 % (р<0,05) соответственно в сравнении с показателями в
группе контроля. Положительный профиль изменений значений фермента АсАТ в сыворотке крови цыплят вакцинированных групп подтверждает отсутствие клинических реакций и является фактором развития поствакцинального периода.
Т а б л и ц а 1. Динамика активности ферментов в сыворотке крови цыплят вакцинированных бигенной ДНК-вакциной и инфицированых ВБМ (М±т, п=15)
Группы птиц Срок исследования, сут.
47 68 89
АсАТ, ммоль/лч
1 1,76±0,02 1,93±0,08 1,71±0,06*
2 1,62±0,04 1,96±0,10 1,67±0,02*
3 2,10±0,04* 2,13±0,02* 1,94±0,04*
контроль 1,80±0,06 1,74±0,04 1,52±0,02
АлАТ, ммоль/лч
1 0,67±0,03 0,88±0,07 0,90±0,04
2 0,70±0,06 0,87±0,04 0,88±0,03
3 0,74±0,02* 0,91±0,03* 1,00±0,05*
контроль 0,60±0,02 0,77±0,04 0,80±0,04
коэфициент де Ритиса
1 2,63 2,19 1,90
2 2,31 2,25 1,89
3 2,84 2,34 1,94
контроль 3,00 2,26 1,90
* - разность значений вероятно по (р<0,05) относительно значений такого показателя у контрольных животных.
Начиная с 47-х суток эксперимента в сыворотке крови цыплят вакцинированных групп наблюдали повышение активности аланинаминотрансферазы на 12,0 % и 16,0 % соответственно. На следующем этапе эксперимента (68-е сутки) регистрируется повышение активности этого фермента, в среднем на 14,0 % у цыплят 1-й группы и 13,0 % - 2-й группы, а на 89-е сутки увеличение составляет 11,0 % и 10,0 % соответственно относительно значений для контрольных цыплят. Такая динамика этого фермента указывает на постепенное восстановление активности АлАТ до физиологического уровня и может быть связана в первую очередь с преимуществом ключевых метаболических реакций анаболического направления [5].
В сыворотке крови цыплят, которые не были вакцинированы уровень активности аланинаминотрансферазы на протяжении всего опытного периода повышался относительно контрольного и составлял, в среднем, 23,3 % (р<0,05), 18,2 % (р<0,05) и 25,0 % (р<0,05) соответственно на 47-, 68- и 89-е сутки. К повышению активности АсАТ и АлАТ в крови инфицированных цыплят, возможно, приводят деструктивные процессы в тканях сердечной мышцы и печени, обусловленные действием токсинов вируса болезни Марека.
Диагностическое значение имеет не только количественный состав ферментов АсАТ и АлАТ в крови, а и их соотношение - коэффициент де Ритиса [5, 12].
Во время опыта отмечали снижение этого показателя на 47-е сутки на 12,3 % и 23,0 % соответственно в 1 -й и 2-й группах относительно контроля, но в то же время эти данные не выходили за пределы физиологической нормы (1,3-3,0). На последующих сроках наблюдений уровень коэффициента приблизился к контрольным показателям.
Такая направленность изменений этого коэффициента может указывать на преобладание процессов синтеза над процессами катаболизма и усиление наработки макроэргических соединений, направленных на синтез защитного уровня антител [2].
Концентрация общего белка в сыворотке крови цыплят опытных групп втечении эксперимента постепенно увеличивалась. На начальном этапе (47-е сутки) существенной разницы не зарегистрировано, за исключением паказателей невакцинированной группы, где повышение составляло 15,0 %. На 68-е сутки опыта отмечается повыщение концентрации общего белка на 12,0 % в сыворотке крови цыплят 1-й группы, на 20,5 % - 2-й группы и на 40,0 % - 3-й группы относительно контроля. В конце эксперимента (89-е сутки) наблюдается увеличение концентрации этого показателя в сыворотке крови цыплят всех опытных групп на 16,9 %, на 28,4 % и на 36,0 % соответственно относительно показателей физиологического контроля (табл. 2).
Т а б л и ц а 2. Концентрация общего белка и альбуминов в сыворотке крови цыплят вакцинированных бигенной
ДНК-вакциной и инфицированных ВБМ (М±т, п=15)
Группы Срок исследования, сут.
птиц 47 68 89
общий белок, г/л
1 32,36±0,61 36,63±0,81 37,28±1,36
2 33,81±1,11 39,43±0,97 40,92±1,34
3 36,42±0,84 45,79±1,20 43,34±0,98
контроль 31,69±0,97 32,71±1,95 31,87±1,83
альбумины, г/л
1 13,01±0,36 11,09±0,72 12,23±0,80
2 13,11±1,11 11,47±0,83 12,59±0,42
3 12,90±0,78 10,22±0,80 13,48±0,65
контроль 14,67±0,61 12,61±1,11 13,87±1,01
Основным белковым компонентом, который синтезируется в печени, является альбумин. Эта белковая фракция во время опыта имеет ожидаемые отклонения от показателей группы физиологического контроля (табл. 2). На 47-е сутки опыта отмечается снижение этого показателя в сыворотке крови цыплят 1-й группы на 11,3 %, у цыплят 3-й группы - 12,0 % относительно контроля. На 68-е сутки эксперимента снижение концентрации альбуминов составляет 12,0 % в сыворотке крови цыплят 1-й группы, а у цыплят 3-й группы - 19,0 % относительно контроля. На последнем сроке эксперимента наблюдается снижение концентрации этого показателя только в сыворотке крови цыплят 1-й группы на 11,8 %. В сыворотке крови цыплят 2-й группы на протяжении всего опыта изменения концентрации альбумина не имели существенной разницы, которая составляла менее 10,0 %.
Мочевая кислота является конечным продуктом обмена пуриновых оснований в печени, индикатором расходов аминогрупп для синтеза нуклеиновых кислот, а также отражает функциональное состояние почек [1, 2].
В табл. 3 отмечено повышение уровня мочевой кислоты, начиная с 47-х суток эксперимента на 10,8 % в сыворотке крови цыплят 1-й вакцинированной группы, на 15,0 % у цыплят 2-й вакцинированной группы и на 28,3 % (р<0,05) у цыплят инфицированной группы относительно показателей цыплят контрольной группы. На следующем сроке наблюдений (68-е сутки опыта) тенденция к повышению концентрации данного показателя сохранялась у цыплят всех опытных групп и разница составляла 12,0 %, 13,7 % и 18,1 % (р<0,05) соответственно. На последнем этапе наблюдений (89-е сутки опыта) регистрировали наибольшую концентрацию мочевой кислоты, особенно у цыплят невакцинированной группы на 33,6 % (р<0,05), а у вакцинированных цыплят разница составляла 17,2 % и 15,6 % соответственно против показателей группы контроля.
Не менее важным конечным продуктом азотистого распада является креатинин, который в комплексе отражает функциональное состояние нефронов [1, 8]. В результате проведенного исследования необходимо отметить достоверное повышение креатинина в сыворотке крови цыплят всех опытных групп, начиная с 47-х суток опыта на 12,0 % (р<0,05), 14,0 % (р<0,05) и 40,1 % (р<0,05) соответственно. На 68-е сутки опыта повышение этого показателя составляло: у цыплят 1-й
вакцинированной группы на 10,0 % (р<0,05), у цыплят 2-й вакцинированной группы на 16,0 % (р<0,05) и у цыплят невакцинированной группы на 28,0 % (р<0,05) относительно показателей у цыплят контрольной группы. В конце опыта (89-е сутки) отмечали повышенную концентрацию креатинина на 10,0 % (р<0,05), 15,0 % (р<0,05) и 34,0 % (р<0,05) соответственно в сыворотке крови всех опытных цыплят.
Т а б л и ц а 3. Концентрация конечных продуктов обмена белков в сыворотке крови цыплят вакцинированных бигенной ДНК-вакциной и инфицированных ВБМ (М±т, п=15)
Группы птиц Срок исследования, сут.
47 68 89
мочевая кислота, мкмоль!л
1 266,00±18,00 277,00±11,00 300,00±14,00
2 276,00±13,00 282,00±14,00 296,00±13,00
3 308,00±16,00* 293,00±10,00* 342,00±15,00*
контроль 240,00±10,00 248,00±12,00 256,00±11,00
креатинин, ммоль!л
1 47,90±1,12* 82,10±1,20* 121,00±2,00*
2 48,80±1,20* 86,50±1,24* 126,00±2,20*
3 60,00±2,00* 95,50±1,18* 147,00±1,46*
контроль 42,80±1,10 74,60±2,00 110,00±1,60
* - разность значений вероятна относительно значений такого показателя у контрольных животных, (р<0,05).
Интенсивность накопления в крови птицы данных метаболитов коррелирует с динамикой активности ферментов, и может быть индуцирована протеолизом и избыточным образованием аммиака, а с другой стороны, - свидетельствовать о снижении скорости клубочковой фильтрации в почках [12].
Заключенеие. Применение ДНК-вакцины против болезни Mарека вызывает кратковременную активацию метаболических процессов, которые направлены на формирование иммунной защиты организма и не оказывают отрицательного воздействия на функциональное состояние внутренних органов, а восстановление до значений физиологического контроля начинается с 47-х суток.
Л И Т E Р А Т У Р А
1. Биохимия I Под ред. Е. С. Северина - 2-е изд., испр. - M.: ГЭОТАР-MEft 2004. - 784 с.
2. Ветеринарна клшчна бiоxiмiя [Текст] I за ред. В. I. Шевченка i В. Л. Галяса. - Бша Церква, 2002. - 400 с.
3. Гаврилов, В. Б. Оценка интоксикации организма по нарушению баланса между накоплением и связыванием токсинов в плазме крови [Текст] I В. Б. Гаврилов, M. M. Бидула, Д. А. Фурманчук. - Клин. лаб. диаг. - M., 1999. - № 2. - С. 13-17.
4. Джавадов, Э. Д. Особенности вакцинопрофилактики в промышленном птицеводстве I Э. Д. Джавадов, M. Е. Дмитриева // Птица и птицепродукты. - 2011. - № 5. - С. 37-39.
5. Долгов, В. В. Лабораторная энзимология [Текст] / В. В. Долгов, А. В. Козлов, В. В. Раков. - M., 2002. - 159 с.
6. Зверев, В. В. Вакцины и вакцинация: Национальное руководство [Текст] I В. В. Зверев, Б. Ф. Семенов, P. M. Хаитов. -Руководство. - M. : ГEОТАP-MEДИА, 2011. - 880 с.
7. Камышников, В. С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: в 2 т [Текст] I В. С. Камышников. - Mmœ: Беларусь, 2000. - Т. 1. - 495 с.; Т. 2. - 463 с.
8. Mаршалл, В. Дж. Клиническая биохимия I В. Дж. Mаршалл. - M.; СПб.: Бином, 2011. - 408 с.
9. Irsa Mateen A Review on DNA Vaccines [Text] / Irsa Mateen, Saba Irshad. - Journal of Health Science, 2011. - Vol. 1. - N. 1 -P. 1 -7.
10. Kurath, G. Biotechnology and DNA vaccines for aquatic animals [Text] / G. Kurath. - Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. - 2008. -N. 27. - P. 175-196.
11. Moreno, S., Timon M. DNA vaccination: an immunological perspective [Text] / S. Moreno, M. Timon. - Immunologia. -2004. - P. 41-55.
12. Wu, A.H.B. Diagnostic enzymology and other biochemical markers of organ damage [Text] / A. H. B. Wu. Mc. Clatchey ed. -2nd ed. - Lippincot Williams & Wilkins. - 2002. - P. 2S1-305.
