CC BY
89
УДК 616.98:578.828 HIV-08:615.37
Н.П. Судаков 3, Н.А. Судакова 4, А.И. Катышев 3, С.Б. Никифоров Ю.М. Константинов 2 3
УРОВЕНЬ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК ПРИ АНТИРЕТРОВИРУСНОЙ ТЕРАПИИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ
1НЦРВХ СО РАМН (Иркутск)
2 Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН (Иркутск)
3 Иркутский государственный университет (Иркутск)
4 МУЗ МСЧ ИАПО (Иркутск)
В обзоре анализируются, возможности анализа уровня мтДНК адипоцитов и мононуклеаров периферической крови в качестве прогностического и диагностического биомаркера развития осложнений антиретровирусной терапии. Показано, что развитие липоатрофии при. лечении аналогами нуклеозидов (ингибиторы, обратной транскриптазы) сопровождается формированием митохондриальной дисфункции, и. снижением уровня мтДНК адипоцитов. На фоне антиретровирусной терапии происходит, уменьшение концентрации. мтДНК мононуклеарных клеток крови, отражающее длительность и. интенсивность лечения, но не ассоциированное с развитием, липоатрофии. В целом., данная тематика требует, дальнейших исследований, направленных на повышение избирательности метода в отношении субтипов анализируемых клеток и. детализацию динамики, показателя. Ключевые слова: митохондриальная ДНК, митохондриальная дисфункция, антиретровирусная терапия, липоатрофия, ВИЧ-инфекция
MITOCHONDRIAL DNA LEVEL IN ANTIRETROVIRAL THERAPY OF HIV INFECTION
N.P. Sudakov 3, N.A. Sudakova 4, A.I. Katyshev 3, S.B. Nikiforov Yu.M. Konstantinov 2- 3
1SCRRS SB RAMS, Irkutsk 2 Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, Irkutsk
3 Irkutsk State University, Irkutsk
4 Municipal Hospital of Irkutsk Aviation Industrial Association, Irkutsk
The possibilities to analyze mtDNA level of peripheral blood adipocyte and mononuclear leukocytes to predict and diagnose complications after the antiretroviral therapy. The lipoatrophy development was shown to be accompanied by mitochondrial dysfunction and a decrease in adipocytes mtDNA level. There is a decrease in mtDNA concentration of mononuclear leukocytes during the treatment with, nucleoside analogues (reverse transcriptase inhibitors) that reflects therapy duration but is not associated, with lipoatrophy development. The topic requires further investigation, most aimed, at increase of the method, selectivity in respect of different cell subtypes and. detailed, elaboration, of cellular mtDNA level dynamics.
Key words: mitochondrial DNA, mitochondrial dysfunction, antiretroviral therapy, lipoatrophy, HIV
ВВЕДЕНИЕ
Эффективное лечение ВИЧ-инфекции во многом определяется расширением возможностей прогноза осложнений антиретровирусной терапии. Ключевую роль в этом играет поиск и патогенетическое обоснование новых прогоностических биомаркеров. Существует большое количество работ, посвященных закономерностям изменения уровня мтДНК тканей ВИЧ-инфицированных больных, получающих антиретровирусную терапию аналогами нуклеозидов. Данные препараты
— зальцитабин, диданозин, ставудин — являются не только ингибиторами обратной транскриптазы ВИЧ, но и ДНК-полимеразы у, ассоциированной с митохондриями [33]. Системное подавление репликации мтДНК при антиретровирусной терапии приводит к развитию синдрома липодистрофии, гиперлактатемии, миопатии, кадиомиопатии, панкреатита, периферической нейропатии, микро-везикулярного стеатоза печени, ассоциированного с молочнокислым ацидозом и/или печеночной недостаточностью [2, 3, 10, 17]. Из перечисленных выше побочных эффектов, наиболее частыми являются липодистрофия и гиперлактатемия [6, 16].
Низкий уровень мтДНК клеток-мишеней может объективно отражать развитие в них патологических изменений на фоне антиретровирусной терапии. Широкая распространенность в медицинских лабораториях метода ПЦР в реальном времени, создает доступность для анализа количества мтДНК различных клеток организма не только в экспериментальной, но и в клинической практике. Это определяет актуальность систематизации существующих исследований для оценки прогностических возможностей данного показателя и рационального планирования дальнейших исследований в этой тематике, что и определило цель настоящего обзора.
ВЛИЯНИЕ АНТИРЕТРОВИРУСНОЙ ТЕРАПИИ НА УРОВЕНЬ МТДНК КЛЕТОК-МИШЕНЕЙ
Установлено, что при развитии липодистрофии на фоне лечения ставудином или зидовудином, жировая ткань пациентов характеризуется существенным снижением уровня мтДНК адипоцитов, инфильтрацией макрофагами и повышенной продукцией провоспалительных цитокинов [13]. Существуют данные о взаимосвязи снижения уровня
мтДНК жировой ткани с развитием нейропатии [ЗО]. Концентрация мтДНК подкожной жировой клетчатки и лактата плазмы крови при лечении аналогами нуклеозидов (ставудин, диданозин, зальцитабин), была ниже, чем в отсутствие приема данных препаратов [7]. Показана взаимосвязь использования ставудина с уменьшением количества мтДНК, структурно-функциональными нарушениями митохондрий подкожной жировой клетчатки и скелетной мускулатуры пациентов [24]. Несмотря не то, что, при липоатрофии наблюдается меньший уровень мтДНК жировой ткани, концентрация мтДНК скелетной мускулатуры и уровень аэробного метаболизма пациентов без липоатрофии не отличается [З1]. Установлено, что гиперлактатемия, наблюдаемая при лечении ставудином, ассоциирована с истощением пула мтДНК скелетной мускулатуры и снижением окислительной способности организма, регистрируемой непрямой калоримерией [14].
Для выявления механизмов, связующих уменьшение уровня мтДНК адипоцитов и развитие липоатрофии при лечении аналогами нуклеозидов, используются методы анализа экспрессии митохондриальных и ядерных генов клеток-мишеней. Данные L. Galluzzi и соавторов (2005), свидетельствуют о снижении экспрессии мРНК митохондриальных генов ND1, CYTB и ND6 жировой ткани пациентов, получающих в составе высокоактивной антиретровирусной терапии аналогами нуклеозидов [11]. На ранних этапах лечения (2 недели) ингибиторами обратной транскриптазы наблюдали снижение уровня мтРНК в отсутствии признаков истощения пула мтДНК. Это свидетельствует, что первичным механизмом митохондриальной дисфункции при липоатрофии является нарушение процессов экспрессии митохондриальных генов, не ассоциированое с ингибированием ДНК-полимеразы у. Наблюдаемое нарушение экспрессии генов метаболизма липидов является возможным механизмом развития липоатрофии при терапии аналогами нуклеозидов [20]. Тем не менее, это не исключает возможности участия истощения мтДНК в механизмах формирования липоатрофии на более поздних этапах лечения аналогами нуклеозидов.
Наблюдения пациентов после снижения дозы аналогов нуклеозидов или их замены другим препаратом позволяют объективно изучить взаимосвязь антиретровирусной терапии, уровня мтДНК клеток-мишеней и клинических проявлений токсических эффектов лечения. Установлено, что двукратное снижение дозы ставудина способствует возрастанию мтДНК жировой ткани и снижению уровня лактата [22]. Изучена обратимость изменений, индуцированных ставудином (З года лечения) при его замене другим нуклеозидными ингибитором обратной транскриптазы (абакавиром или зидовудином) у пациентов с липоатрофией и/ или гиперлактатемией. К 48-й неделе наблюдения уровень мтДНК скелетной мускулатуры, жировой ткани и мононуклеаров крови возрос на 141 %,
146 % и 369 % соответственно. На данный период отмечено увеличение объема жировой ткани рук (21 %), ног (11 %) и туловища (16 %). Интенсивность процессов апоптоза адипоцитов к данному сроку существенно снижалась [23].
ИЗМЕНЕНИЯ МТДНК КЛЕТОК КРОВИ
НА ФОНЕ АНТИРЕТРОВИРУСНОЙ ТЕРАПИИ
Помимо жировой ткани и скелетной мускулатуры, антиретровирусная терапия аналогами нуклеозидов способствует снижению уровня мтДНК мононуклеаров периферической крови [9, 12]. Изучение взаимосвязи уровня мтДНК клеток крови с формированием липоатрофии открывает перспективы создания неинвазивной технологии диагностики и прогноза развития осложнений антиретровирусной терапии. Показано, что двукратное истощение пула мтДНК мононуклеаров периферической крови при ли-поатрофии ассоциировано с недостаточностью дыхательного комплекса III и IV, частично кодируемых мтДНК [25].
В сравнении с ВИЧ-инфицированными пациентами, не получающими аналогов нуклеозидов, в мононуклеарах больных получавших ставудин и диданозин (не менее 6 месяцев), наблюдали снижение уровня мтДНК. В то же время, экспрессия СОХ-П и активность СОХ оставались неизмененными. Это свидетельствует о наличии механизмов, компенсирующих нарушение митохондриальных функций, обусловленное истощением пула мтДНК [26]. Данный факт определяет возможности анализа уровня мтДНК при прогнозировании дегенеративных изменений митохондрий до развития их функциональных нарушений. Изучен уровень мтДНК и мтРНК мононуклеаров периферической крови на протяжении 48-недельного лечения курса в двух группах из ВИЧ-1-инфицированных пациентов, получавших комбинацию ритонавира, индинавира, эвафиренца с или без ставудина соответственно. На протяжении всего наблюдения не было выявлено статистически значимых различий между данными группами, но к последнему этапу исследования, они характеризовались возрастанием уровня мтДНК и мтРНК. Наблюдаемые явления могут отражать компенсаторные процессы, индуцированные антиретровирусной терапией на протяжении первого года лечения, вне зависимости от модификации схемы лечения [5].
Показано, что содержание мтДНК моно-нуклеаров крови может не быть существенным маркером митохондриальной токсичности органов-мишеней. Так, скелетная мускулатура ВИЧ-инфицированных пациентов, получающих антиретровирусную терапию, характеризовалась редуцированным соотношением мтДНК/ядерная ДНК, более частыми делециями мтДНК в сравнении с контролем. В то же время, содержание мтДНК в клетках периферической крови было снижено у ВИЧ-инфицированных пациентов, как получающих, так и не получающих антиретровирусную терапию [18]. Показано отставание
изменений уровня мтДНК мононуклеаров периферической крови от клинических показателей при замене тимидиновых аналогов на абакавир: в течение 24-недельного наблюдения, несмотря на редукцию липоатрофии, значительных изменений уровня мтДНК мононуклеаров не наблюдалось [15]. Установлено, что инфекция ВИЧ-1 сама по себе способствует редукции уровня мтДНК моно-нуклеаров периферической крови [4]. Существует аргументированное мнение, что истощение уровня мтДНК крови не является предиктором липоатрофии. Данный показатель зависит только от длительности лечения аналогами нуклеозидов [21].
Предполагается, что изучение уровня мтДНК индивидуальных клеточных субтипов может оказаться более показательным биомаркером в сравнении с фракцией мононуклеаров крови. Анализ содержания мтДНК фракции CD4 + и CD8 + T-клеток, без примеси тромбоцитов при HAART показал существенное возрастание уровня мтДНК CD8+ T-клеток, наблюдаемое по истечении 6 месяцев после прерывания антиретровирусной терапии [27]. Показано, что прерывание антиретровирусной терапии на 12 месяцев, на фоне возрастания вирусной нагрузки и снижения количества CD4 + -клеток, способствует частичному восстановлению уровня мтДНК мононуклеаров периферической крови и значительному уменьшению концентрации лактата [28]. Показано значительное увеличение мтДНК CD4 + -клеток пациентов с липоатрофией, в то время как различий между CD4 + и CD8 + клеток больных без липоатрофии и группы клинического сравнения не было [8]. Изучен уровень мтДНК CD4 + и CD8 + T-клеток, CD19 + B-клеток, and CD14 + моноцитов. Уровень мтДНК CD8 + T-клеток и B-клеток пациентов, не получающих ART, был примерно в два раза меньше чем в контроле. Во всех субтипах лимфоцитов данный показатель негативно коррелировал с экспрессией CD38+PD-1 + (r = —0,66 p < —0,9; p < 0,03), и во фракции B-клеток уровень мтДНК коррелировал с уменьшением количества CD4 + T-клеток (r = 0,66; p < 0,3). У пациентов, получающих NRTI, уменьшение уровня мтДНК наблюдали в обоих подклассах Т-клеток, но наиболее выраженным оно было при лечении диданозином (p < or = 0,002) [10].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Резюмируя вышеизложенное, развитие липоатрофии при антиретровирусной терапии сопровождается развитием митохондриальной дисфункции и снижением уровня мтДНК ади-поцитов. Замена аналогов нуклеотидов другими препаратами или уменьшение их дозировки способствует постепенному восстановлению концентрации мтДНК. К сожалению, анализ данного показателя требует пункции жировой ткани, в сравнении с классическими методами диагностики липоатрофии (двухфотонная рентгеновская адсорбциометрия, биоэлектрический импеданс,
компьютераная и магнитно-резонансная томография), являющимися неинвазивными. Данные относительно возможностей использования этого показателя для прогноза развития липоатрофии отсутствуют. Это определяет необходимость подробных исследований динамики уровня мтДНК адипоцитов при лечении аналогами нуклеозидов и развитии липоатрофии, а также минимизации инвазивности метода.
В сравнении с адипоцитами, мононуклеары периферической крови являются более удобным источником для взятия биоматериала. Установлено, что уровень мтДНК клеток крови в меньшей степени связан с развитием липоатрофии, чем концентрация мтДНК адипоцитов. Наблюдаемые закономерности могут быть частично связаны с различиями структуры и функции адипоцитов и моноуклеаров, а также с неоднородностью моно-нуклеарной фракции (различным соотношением субфракций лимфоцитов, примесью нейтрофи-лов, тромбоцитов) [1, 29, 32]. Показана четкая взаимосвязь содержания мтДНК мононуклеаров только с длительностью лечения аналогами нуклеозидов, но не с развитием липоатрофии. Имеется взаимосвязь концентрации мтДНК мононукле-аров с дозировкой и типом антиретровирусных препаратов. В данном случае, можно рассматривать уровень мтДНК мононуклеаров в качестве биомаркера, отражающего степень нагрузки терапии аналогами нуклеозидов на организм. Несомненно, более интересную перспективу в данном направлении имеют исследования уровня мтДНК различных субтипов клеток крови, очищенных иммуномагнитной сепарацией [8, 19, 27, 28]. В целом, результаты данных исследований должны служить основой для дальнейших исследований в области механизмов влияния аналогов нуклеозидов на различные клетки организма и поиска новых прогностических и диагностических биомаркеров развития осложнений антиретровирусной терапии.
Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» (проект ФНМ-16).
ЛИТЕРАТУРА
1. Banas B., Kost B.P., Goebel F.D. Platelets, a typical source of error in real-time PCR quantification of mitochondrial DNA content in human peripheral blood cells // Eur. J. Med. Res. — 2004. — Vol. 9. — P. 371 -377.
2. Brinkman K. et al. Adverse effects of reverse transcriptase inhibitors: mitochondrial toxicity as common pathway // AIDS. — 1998. — Vol. 12. — P. 1735—1744.
3. Carr A. et al. Diagnosis, prediction, and natural course of HIV-1 protease-inhibitorassociated lipodystrophy, hyperlipidaemia, and diabetes mellitus: a cohort study // Lancet. — 1999. — Vol. 353. — P. 2093 — 2099.
4. Casula M. et al. Infection with HIV-1 induces a decrease in mtDNA // J. Infect. Dis. — 2005. — Vol. 191. - P. 1468-1471.
5. Casula M. et al. Mitochondrial DNA and RNA increase in peripheral blood mononuclear cells from HIV-1-infected patients randomized to receive stavudine-containing or stavudine-sparing combination therapy // J. Infect. Dis. — 2005. — Vol. 192. — P. 1794 — 1800.
6. Chene G. et al. Role of long-term nucleoside-analogue therapy in lipodystrophy and metabolic disorders in human immunodeficiency virus-infected patients // Clin. Infect. Dis. — 2002. — Vol. 34. — P. 649 — 657.
7. Cherry C.L. et al. Exposure to dideoxynucleo-sides is reflected in lowered mitochondrial DNA in subcutaneous fat // J. Acquir. Immune. Defic. Syn-dr. — 2002. — Vol. 30. — P. 271 —277.
8. Cossarizza A. et al. Increased mitochondrial DNA content in peripheral blood lymphocytes from HIV-infected patients with lipodystrophy // Antivir. Ther. — 2003. — Vol. 8. — P. 315 — 321.
9. De Mendoza C. et al. Changes in mitochondrial DNA copy number in blood cells from HIV-infected patients undergoing antiretroviral therapy // AIDS Res. Hum. Retroviruses. — 2004. — Vol. 20. — P. 271 —273.
10. Fromenty B., Pessayre D. Inhibition of mitochondrial beta-oxidation as a mechanism of hepato-toxicity // Pharmacol. Ther. — 1995. — Vol. 67. — P. 101 — 154.
11. Galluzzi L. et al. Altered mitochondrial RNA production in adipocytes from HIV-infected individuals with lipodystrophy // Antivir. Ther. — 2005. — Vol. 10. — P. M91—M99.
12. Gourlain K. et al. Quantitative analysis of human mitochondrial DNA using a real-time PCR assay // HIV Med. — 2003. — Vol. 4. — P. 287 — 392.
13. Hammond E., McKinnon E., Nolan D. Human immunodeficiency virus treatment-induced adipose tissue pathology and lipoatrophy: prevalence and metabolic consequences // Clin. Infect. Dis. — 2010. — Vol. 51. — P. 591 —599.
14. Haugaard S.B. et al. Depleted skeletal muscle mitochondrial DNA, hyperlactatemia, and decreased oxidative capacity in HIV-infected patients on highly active antiretroviral therapy // J. Med. Virol. — 2005. — Vol. 77. — P. 29 — 38.
15. Hoy J.F. et al. Changes in mitochondrial DNA in peripheral blood mononuclear cells from HIV-infected patients with lipoatrophy randomized to receive abacavir // J. Infect. Dis. — 2004. — Vol. 190. — P. 688 — 692.
16. John M. et al. Chronic hyperlactatemia in HIV-infected patients taking antiretroviral therapy // AIDS. — 2001. — Vol. 15. — P. 717 — 723.
17. Lewis W., Dalakas M.C. Mitochondrial toxicity of antiviral drugs // Nat. Med. — 1995. — Vol. 1. — P. 417 — 422.
18. Maagaard A. et al. Mitochondrial (mt)DNA changes in tissue may not be reflected by depletion of mtDNA in peripheral blood mononuclear cells in
HIV-infected patients // Antivir. Ther. — 2006. — Vol. 11. — P. 601 —608.
19. Maagaard A. et al. Distinct mechanisms for mitochondrial DNA loss in T and B lymphocytes from HIV-infected patients exposed to nucleoside reverse-transcriptase inhibitors and those naive to antiretroviral treatment // J. Infect. Dis. — 2008. — Vol. 198. — P. 1474—1481.
20. Mallon P.W. et al. In vivo, nucleoside reverse-transcriptase inhibitors alter expression of both mitochondrial and lipid metabolism genes in the absence of depletion of mitochondrial DNA // J. Infect. Dis. — 2005. — Vol. 191. — P. 1686—1696.
21. McComsey G. et al. Extensive investigations of mitochondrial DNA genome in treated HIV-infected subjects: beyond mitochondrial DNA depletion // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. — 2005. — Vol. 39. — P. 181 — 188.
22. McComsey G.A. et al. Effect of reducing the dose of stavudine on body composition, bone density, and markers of mitochondrial toxicity in HIV-infected subjects: a randomized, controlled study // Clin. Infect. Dis. — 2008. — Vol. 46. — P. 1290—1296.
23. McComsey G.A. et al. Improvements in lipoatrophy, mitochondrial DNA levels and fat apoptosis after replacing stavudine with abacavir or zidovudine // AIDS. — 2005. — Vol. 19. — P. 15 — 23.
24. McComsey G.A., Walker U.A. Role of mitochondria in HIV lipoatrophy: insight into pathogenesis and potential therapies // Mitochondrion. — 2004. — Vol. 4. — P. 111 — 118.
25. Miro O. et al. Mitochondrial DNA depletion and respiratory chain enzyme deficiencies are present in peripheral blood mononuclear cells of HIV-infected patients with HAART-related lipodystrophy // Antivir. Ther. — 2003. — Vol. 8. — P. 333 — 338.
26. Miro O., Lopez S., de la Rodriguez M. Concepcion et al. Upregulatory mechanisms compensate for mitochondrial DNA depletion in asymptomatic individuals receiving stavudine plus didanosine // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. — 2004. — Vol. 37. — P. 1550—1555.
27. Mussini C. et al. Effect of treatment interruption monitored by CD4 cell count on mitochondrial DNA content in HIV-infected patients: a prospective study // AIDS. — 2005. — Vol. 19. — P. 1627—1633.
28. Noguera A. et al. Evolution of mitochondrial DNA content after planned interruption of HAART in HIV-infected pediatric patients // AIDS Res. Hum. Retroviruses. — 2010. — Vol. 26. — P. 1015—1018.
29. Pyle A. et al. Fall in circulating mononuclear cell mitochondrial DNA content in human sepsis // Intensive Care Med. — 2010. — Vol. 36. — P. 956 — 962.
30. Rabing Christensen E. et al. Mitochondrial DNA levels in fat and blood cells from patients with lipodystrophy or peripheral neuropathy and the effect of 90 days of high-dose coenzyme Q treatment: a randomized, double-blind, placebo-controlled pilot study // Clin. Infect. Dis. — 2004. — Vol. 39. — P. 1371 — 1379.
31. Sutinen J. et al. Skeletal muscle mitochondrial DNA content and aerobic metabolism in patients
with antiretroviral therapy-associated lipoatrophy // J. Antimicrob. Chemother. — 2010. — Vol. 65. — P. 1497—1504.
32. Urata M. et al. Platelet contamination causes large variation as well as overestimation of mitochondrial DNA content of peripheral blood mononuclear
cells // Ann. Clin. Biochem. — 2008. — Vol. 45. — P. 513 — 514.
33. Walker U.A. et al. Depletion of mitochondrial DNA in liver under antiretroviral therapy with didano-sine, stavudine, or zalcitabine // Hepatology. — 2004.
— Vol. 39. — P. 311—317.
Сведения об авторах
Судаков Николай Петрович - к.б.н., доцент, н.с. отдела экспериментальной хирургии с виварием НЦРВХ СО РАМН (664079, г. Иркутск, м-н Юбилейный, 100; тел.: (3952) 40-76-67; e-mail: npsudakov@rambler.ru)
Судакова Наталья Алексеевна - врач-инфекционист МУЗ мСч ИАПО (664002, г. Иркутск, ул. Жукова, 9; тел.: (3952) 3297-03)
Катышев Александр Игоревич - к.б.н., н.с. лаборатории генетической инженерии растений СИФИБР СО РАН (664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132; тел.: (3952) 42-67-21)
Никифоров Сергей Борисович - д.м.н., с.н.с. отдела экспериментальной хирургии с виварием НЦРВХ СО РАМН (664079, г. Иркутск, м-н Юбилейный, 100; тел. (3952) 40-76-67)
Константинов Юрий Михайлович - д.б.н., профессор, зав. лабораторией генетической инженерии растений СИФИБР СО РАН (664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132; тел.: (3952) 42-67-21)
