Упрощение трипсинового гидролизата протеома E. coli при поиске пептидов РНК-полимеразы методом масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией (es-tof-ms)

Корнева Е. С.; Верещагин А. Л.; Новиков А. В.; Грачев М. А.

ISSN 0868-5886

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2007, том 17, № 0, c. 37-41

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 577.112:579.842.11

УПРОЩЕНИЕ ТРИПСИНОВОГО ГИДРОЛИЗАТА ПРОТЕОМА E. COLI ПРИ ПОИСКЕ ПЕПТИДОВ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ МЕТОДОМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ С ЭЛЕКТРОРАСПЫЛИТЕЛЬНОЙ ИОНИЗАЦИЕЙ (ES-TOF-MS)

Упрощение трипсинового гидролизата протеома E. coli при поиске пептидов РНК-полимеразы достигнуто путем применения гельпроникающей хроматографии. В результате анализа методом времяпролетной масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией полученных при хроматографии фракций идентифицированы пептиды, наличие которых свидетельствует о присутствии РНК-полимеразы в исходном суммарном белке.

ВВЕДЕНИЕ

Для поиска индивидуальных белков, возможность присутствия которых в протеомах живых клеток вытекает из структуры их геномов, широко применяются методы протеомики. Целью таких исследований является решение как фундаментальных проблем молекулярной биологии, так и практически важных задач, например задач медицинской диагностики. Наиболее широко применяется сочетание техники двумерного электрофореза — электрофокусировки — с масс-спектрометрией с лазерной ионизацией (МАЬБ1). Применение этой техники имеет два серьезных ограничения. Во-первых, выделение чистых белковых фракций ограничивается недостаточной емкостью пластин двумерных гелей, следствием которой является загрязнение целевых белков мажорными клеточными белками, например тубулинами и актинами. Во-вторых, метод МАЬБ1, как и другие методы масс-спектрометрии пептидов, является принципиально неколичественным, и потому, например, отсутствие искомых сигналов в масс-спектрах никак не говорит об отсутствии соответствующих белков в исследуемых клетках.

В связи с этим в последние годы развивается альтернативный подход, который иногда называют пептидомикой [1], — поиск не самих целевых белков, а индикаторных продуктов их расщепления, например характерных триптических пептидов. Для разделения пептидов можно применять не гель-электрофорез, а жидкостную хроматографию, динамический диапазон допустимой нагрузки для которой гораздо более широк по сравнению с гель-электрофорезом. Для реализации техники пептидомики необходимо выделить из клеток суммарный белок и подвергнуть его химической модификации для разрыва дисульфидных связей

и их последующей защиты (обычно путем алкили-рования йодуксусной кислотой). Необходимо также принять меры для предотвращения неконтролируемого расщепления белков клеточными про-теазами. Далее необходимо упростить подвергаемую масс-спектрометрии сложнейшую смесь пептидов для того, чтобы обеспечить ионизацию целевых пептидов и их надежную детекцию в масс-спектрах.

Целью настоящей работы было исследование возможности идентификации в протеоме E. coli РНК-полимеразы — белка с умеренным уровнем экспрессии (7000 копий на клетку [2]) путем трип-синолиза, гель-проникающей хроматографии и времяпролетной масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали концентрированную культуру E. coli, ацетонитрил ("Криохром", Санкт-Петербург), йодуксусную кислоту, трифторуксус-ную кислоту фирмы "Merk" (Германия), PMSF ("Bio Rad", США), меркаптоэтанол ("Хеликон", Москва), азид натрия ("Лабтех", Москва), ацетон ("Экос-1"), дигидроортофосфат калия, тиомочеви-ну, додецилсульфат натрия (SDS) фирмы "Реахим" (Москва), Tris и мочевину фирмы "Sigma" (Германия), TPCK трипсин ("Sigma" T 1426, Германия).

Лизаты клеток E. coli готовили, экстрагируя биомассу Tris-буфером, содержащим мочевину, тиомочевину, SDS. Полученный лизат последовательно карбоксиметилировали 0.05 М йодуксусной кислотой, восстановили 0.7 М меркаптоэта-нолом и карбоксиметилировали 0.075 М йодуксусной кислотой. Белок из смеси осаждали ацетоном [3]. Последующий трипсинолиз выполняли

Номер фракции 23456789 10

Объем, мкл

Рис. 1. Профиль гель-фильтрации триптических пептидов E. coli

по стандартной методике [3, 5], время инкубирования 6 ч.

Гель-фильтрацию проводили на колонке 20x0.5 см с сефадексом G-25. Элюирование — 0.2 М фосфатным буфером (рН = 6.5) с 0.02 % NN3, собирая фракции по 1 мл. Фракции концентрировали и короткое время диализовали на холоде.

Хроматограммы записывали на микроколоночном жидкостном хроматографе с многоволновой фотометрической детекцией "Милихром А-02" (ЗАО "ЭкоНова", Новосибирск, Россия). Масс-спектрометрический анализ проводили на приборе MX 5303, оборудованном электрораспылительным источником ионов (ESI) и времяпролетным масс-анализатором (TOF) в режиме регистрации положительных ионов (Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург, Россия). Объем анализируемой пробы 10 мкл. Скорость подачи образца 1-2 мкл/мин. Анализ фракций производился в режиме "жидкостной хроматограф—масс-спектрометр" в режиме прямой стыковки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что в геноме E. coli закодировано около 4800 белков, дающих при трипсинолизе 37 000 пептидов. РНК-полимераза E. coli состоит из пяти субъединиц: ß' (165 кДа), ß (155 кДа), двух а (35 кДа) и g (70 кДа). Прогнозируемая по геному смесь пептидов РНК-полимеразы E. coli представляет собой набор из приблизительно 450 компонентов. Из них основную часть составляют пептиды длиной менее 15 аминокислотных остатков (390 штук), а пептиды, содержащие более чем 20 аминокислот, имеются в количестве лишь 37 штук. Мы предположили, что, поделив сумму триптических пептидов E. coli с помощью гель-проникающей хроматографии, можно снизить ее сложность в области крупных молекул до степени, достаточной для регистрации индивидуальных пептидов РНК-полимеразы в масс-спектре. Основное внимание было уделено изучению фракций, содержащих длинные пептиды.

Суммарный белок E. coli выделяли из суперна-танта, полученного путем центрифугирования го-могената бактериальной массы в смеси c 7 M мочевиной, 2 М тиомочевиной, 0.1 % SDS и 0.04 M Tris.OH (рН 8.5). Супернатант последовательно подвергали алкилированию, восстановлению и вновь алкилированию. Белок осаждали ацетоном, растворяли в 0.1 М растворе Tris.OH и гидролизо-вали трипсином до получения постоянного профиля обращенно-фазовой жидкостной хроматографии.

Полученную смесь триптических пептидов E. coli разделяли методом гель-проникающей хроматографии на сефадексе G-25 (рис. 1). Масс-спектрометрии было подвергнуто 7 фракций. Судя по выходной кривой гель-проникающей хроматографии, короткие пептиды были отсеяны на 95 %.

Отобранные для дальнейшего анализа фракции короткое время диализовали против воды и концентрировали упариванием в вакууме, а затем доводили до объема 40 мкл. В полученных образцах методом времяпролетной масс-спектрометрии были обнаружены пептиды, распределившиеся в соответствии с размерами (табл., рис. 2).

Пептиды РНК-полимеразы, обнаруженные в трипсинолизате биомассы E. coli

Аминокислот- Аминокислотная Субъединица М. в. № фрак-

ный участок последовательность ции

135б-13б9 LIPAGTGYAYHQDR B' 15б0.7б85 б

12б4-1284 ATIVNAGSSDFLEGEQVEYSR B' 2270.952 5

912-933 GEAIGVIAAQSIGEPGTQLTMR B' 2198.22б 5

УПРОЩЕНИЕ ТРИПСИНОВОГО ГИДРОЛИЗАТА..

39

1100.6

1100.11

1136.98

1101.1

1101.59

1136.48

"У^РТ^П! .-гчит^тлщп mlz ' m/z

1096 1100 1104 1108 1132 1136 1140 1144

ОЕДЮМДДОЗЮЕРОТОЬТМР *

ДТ!УМД0880РЬЕ0Е0УЕУ8Р *

1080

1100

1120

1140

1160

Рис. 2. Фрагмент масс-спектра фракции 5, содержащий сигналы пептидов 0ЕА10У1ААР8ЮБР0ТРЬТМК, АТ1УМА088ВРЬБ0БрУБУ8К субъединицы В' РНК полимеразы E.coli. На врезке показаны в увеличенном масштабе участки (*)

В группе крупных пептидов (длиннее 20 ами- белкам (рис. 2). Массы, предположительно соот-

нокислотных остатков) два из интересовавших нас ветствующие двухзарядным катионам пептидов сигнала были отчетливо видны на фоне сигналов

фрагментов, принадлежащих другим клеточным ATГVNAGSSDFLEGEQVEYSR/

LI PA GTGYAYHQDR ★

765

770

775

780

785

790

795

781.38

781.98

I—1—I—1—I—1—I—1—I—1—I—1—I—1—I

776 778 780 782 784 786 788 790

Рис. 3. Фрагмент (а) масс-спектра фракции 6, содержащий сигнал пептида LIPAGTGYAYHQDR субъединицы B' РНК полимеразы E. Coli. Участок спектра (*) показан в увеличении на (б)

найдены во фракции 5. Кроме того, в шестой фракции обнаружен сигнал 14-членного фрагмента LIPAGTGYAYHQDR (рис. 3). Поиск, выполненный с помощью системы Mascot для E. coli, показал, что одновременное наличие трех указанных сигналов может объясняться лишь тем, что в

исходном белке присутствовала РНК-полимераза.

Принято считать, что трипсиновый гидролизат протеома живой клетки, состоящий из нескольких тысяч пептидов, представляет большую сложность для обнаружения в нем конкретных пептидов из-за трудоемких операций по их выделению или обогащению. Нами показано, что методом, включающим лишь одну стадию упрощения полного трип-синового гидролизата суммарного белка, можно установить наличие в нем протеина, не являющегося мажорным.

Благодарности

Работа выполнена в рамках программы фундаментальных исследований Российской академии наук "Физико-химическая биология" (проект 10.3) и гранта РФФИ 04-04-48669.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Soloviev M., Finch P. Peptidomics, Current Status // Journal of chromatography B. 2005. V. 815. P.11-24.

2. (http://www.nsu.ru).

3. Практическая химия белка / Ред. А. Дарбре. М.: Мир, 1989. 621 с.

4. Basir Y.J., Conlon J.M. Peptidomic Analysis of the Skin Secretions of the Pickerel Frog Rana palustris Identifies Six Novel Families of Structurally-Related Peptides // Peptides. 2003. V. 24. P.379-383.

5. Ihling C., Sinz A. Proteome Analysis of Escherichia coli Using High-Performance Liquid Chromatography and Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry // Pro-teomics. 2005. V. 5. P. 2029-2042.

Лимнологический институт Сибирского отделения РАН, Иркутск (Корнева Е.С., Верещагин А.Л., Грачев М.А.)

Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург (Новиков А.В.)

Материал поступил в редакцию 10.04.2007.

б

YnPQfflpHHE TPHnCHHOBOro rHflPOHH3ATA.

41

SIMPLIFICATION OF TRYPSIN DIGEST OF PROTEOM E. COLI IN SEARCHING FOR RNA-POLYMERASE PEPTIDES BY MASS-SPECTROMETRY WITH ELECTROSPRAY IONIZATION (ES-TOF-MS)

1 12 1 E. S. Korneva , A. L. Vereshchagin , A. V. Novikov , M. A. Grachev

1Limnological Institute of the RAS Siberian Branch, Irkutsk 2Institute for Analytical Instrumentation RAS, Saint-Petersburg

Simplification of trypsin proteom E. coli in searching for RNA-polymerase peptides has been achieved by using gel-penetrating chromatography. As a result of analyzing the fractions obtained in the process of chromatography by the method of time-of-flight mass spectrometry with electrospray ionization, peptides were identified, the presence of which is the evidence of the presence of RNA-polymerase in the initial total protein.

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Корнева Е. С., Верещагин А. Л., Новиков А. В., Грачев М. А.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Корнева Е. С., Верещагин А. Л., Новиков А. В., Грачев М. А.

SIMPLIFICATION OF TRYPSIN DIGEST OF PROTEOM E. coli IN SEARCHING FOR RNA-POLYMERASE PEPTIDES by mass-spectrometry with electrospray ionization (ES-TOF-MS)