CC BY
275
СИБИРСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ № 42009 (выпуск 1)
ОПЫТ РЕГИОНОВ
УДК 615.453.2
И.А. Бахтин, Е.В. Орлова, В.А. Несчисляев
E-mail: [email protected]
УНИВЕРСАЛЬНЫЙ РЕЖИМ СУБЛИМАЦИОННОГО ВЫСУШИВАНИЯ ПРОБИОТИКОВ
ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ Филиал «Пермское НПО «Биомед»
Способ получения медицинских пробиотических препаратов (лакто-, бифидумбактерин и др.) базируется, как правило, на использовании технологической схемы, включающей в качестве основных стадий, помимо процесса культивирования штаммов, стабилизацию бактериальной культуры и изготовление лекарственных форм. Стабилизация бактериальной культуры необходима для обеспечения жизнеспособности клеток в препарате, что определяет срок его годности.
Из многих известных способов сохранения бактериальных культур к пригодным для массового производства лекарственных форм пробиотиков относится лиофилизация - высушивание из замороженного состояния. Лиофильное высушивание является надежным способом сохранения биоматериалов. Выживание клеток в этом случае обеспечивается за счет естественной способности микроорганизмов впадать в анабиоз при неблагоприятных условиях внешней среды [1, 2]. В лиофилизированных культурах значительная часть бактерий сохраняется в жизнеспособном состоянии в течение многих лет, не теряя при этом биологических свойств. Техническая доступность данного вида стабилизации бактериальных культур обеспечила ему широкое распространение, в том числе в производстве пробиотических препаратов.
Повышение эффективности использования сублимационной техники при традиционном выпуске пробиотиков в виде сухой биомассы во флаконах предполагает значительное снижение продолжительности операции лиофилизации препаратов и ее унификацию.
Предпосылки к разработке единых режимов замораживания и высушивания для разных препаратов базировались на применении аналогичных за-
щитных сред и объемов наполнения флаконов. Кроме того, использование унифицированных питательных сред (казеиново-дрожжевые) для культивирования лакто- и бифидобактерий и близкий по составу спектр продуцируемых ими экзометаболитов также способствовали реализации данного направления исследований.
Препараты разливали в инсулиновые флаконы ФИ-5 по 2 мл (5 доз). Высота (толщина) вертикального столба препарата при таком объеме розлива составляла (13±1) мм и зависела от вариабельности диаметра флакона. Замораживали препарат в низкотемпературных шкафах ТУ-2000 (Германия) холодовым воздействием на уровне минус 50°С не более 20 ч как в вертикальном, так и в наклонном положении под углом (60±15)°. В ходе высушивания на установке ТГ-50 (Германия) применяли интенсивный нагрев полок со скоростью до 20°С/ч.
При отработке единого режима замораживания препаратов не возникло каких-либо затруднений, так как процесс сверхмедленного охлаждения (менее 1°С/мин) обеспечивает первичную и вторичную кристаллизацию влаги в бактериальных суспензиях без существенного негативного влияния на жизнеспособность клеток [2]. При заданной температуре (минус 50°С) гарантированно достигается полное замораживание суспензии лакто- и бифидобактерий, эвтектические параметры которых охватываются диапазоном минус (38±6)°С. Практически этот режим может быть использован в производстве всех пробиотических препаратов, так как при его осуществлении нивелируется роль объема наполнения флаконов и состава защитной среды.
При отработке оптимального унифицированного режима сублимационного высушивания препаратов необходимо было подобрать и адаптировать к техническим возможностям каждой сушильной установки максимально короткие этапы собственно сублимации и досушивания, обеспечивающие сохранение необходимой структуры биомассы и жизнеспособности клеток. Известно, что длительность этапа сублимации, когда удаляется до 90% всей влаги, пропорциональна объему наполнения флакона и зависит от температуры материала, состава защитной среды и толщины (высоты) замороженного слоя. Недостаточная продолжительность этого этапа может привести к резкому нарушению макроструктуры полученного препарата.
Практика лиофилизации свидетельствует, что избежать подобного, а также исключить проявления неравномерного высушивания, пересушивания и повреждения бактерий в поверхностных слоях биоматериала можно при толщине слоя не более 12 мм или, соответственно, наполнении флаконов не более 35% от их объема [2]. Указанные условия объективно подчеркивали основную проблему данной разработки, связанную с тем, что обоснованная с точки зрения эффективности препарата дозировка (5 доз
И.А. Бахтин и др.
СУБЛИМАЦИОННОЕ ВЫСУШИВАНИЕ ПРОБИОТИКОВ
Таблица
Влияние способа замораживания на параметры лиофилизированных препаратов
Препарат Способ замораживания * Кол-во образцов Биологические показатели
Всего С дефектом макроструктуры КОЕ/доза Активность кислото-образования, °Т
Лакгобакгерин Наклонно** 1100 8 (2,1-2,3-2,3)х109 246 - 258
Вертикально 1100 41 (2,0-2,2-2,4)х109 248 - 252
Бифидум- бактерин Наклонно** 1100 4 (7-5-10)х107 129 - 136
Вертикально 1100 12 (6-8-8)х107 125 - 134
Ацилакт Наклонно** 1100 7 107 270 - 276
Вертикально 1100 29 107 270 - 280
Примечание: * - при 50°С в течение 16 ч; ** - под углом 45.
в объеме 2 мл) во флаконе ФИ-5 (инсулиновый) обладает критическими (пограничными) параметрами с позиции технологических возможностей. Высота (толщина) вертикального столба препарата при таком наполнении флакона составляет (13±1) мм.
Снижение объема наполнения флакона за счет уменьшения дозировки препарата экономически нерационально, так как вызывает существенное увеличение себестоимости единицы готовой продукции. Применение концентрирования бактериальной суспензии объективно приводит к снижению эффективности препарата из-за удаления из культуральной жидкости биологически активных компонентов.
Наше решение данной проблемы базировалось на использовании технологического приема, связанного с увеличением площади свободной поверхности замороженного препарата и, соответственно, ускорением процесса сублимации. Данный эффект обусловлен тем, что фронт десорбции пара проходит параллельно верхней поверхности материала и его глубина при этом значительно уменьшается. Замороженный в кассете в наклонном положении под углом (60±15)° флакон позволяет вдвое увеличить площадь открытой поверхности продукта.
Сравнительный анализ параллельно высушенных в одном сублиматоре образцов ацилакта, лакто-и бифидумбактерина с вертикальной и наклонной заморозкой флаконов показал, что наклонная заморозка позволяет снизить количество некондиционных по макроструктуре образцов бифидумбактери-на (в 3 раза), лактобактерина (в 5 раз) и ацилакта (в 4 раза) по сравнению с вертикальным вариантом. При этом биологические параметры тех и других образцов не имеют отличий (табл.).
После отработки этапа сублимации, отличительной особенностью которого является ускоренный нагрев полок до максимальной температуры (35±5)°С, необходимо было определить оптимальную длительность этапа досушивания препаратов. В ходе многочисленных экспериментов было установлено, что выдерживание продукта на плюсовых температурах
в течение (20±4) ч обеспечивает остаточную влажность основной массы готового препарата в диапазоне 1-2%. Такие параметры обеспечивают высокую стабильность биологических показателей ацилакта, лакто- и бифидумбактерина на протяжении регламентированного срока хранения (годности).
Разработанный универсальный режим лиофили-зации пробиотиков, включающий наклонное замораживание препаратов во флаконах и интенсивный нагрев полок на этапе сублимации при определенных значениях показателей вакуума и температуры конденсатора, признан изобретением (Патент РФ № 2333161). Указанный режим в настоящее время используется при изготовлении лакто- и бифидум-бактерина в Пермском филиале ФГУП «НПО «Микроген».
Представленные результаты исследований в сфере технологии флаконных форм препаратов послужили основой для совершенствования производственного процесса стабилизации пробиотиков и позволили в 1,5 раза увеличить эффективность использования парка сублимационного оборудования, а также снизить расходы на единицу готовой продукции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Долинов К.Е. Основы технологии сухих биопрепара-тов/К.Е. Долинов. - Москва: Медицина, 1969. - 230 с.
2. Нежута А.А. Теоретические и практические основы технологии сублимационного высушивания биопрепаратов / А.А. Нежута, Э.Ф. Токарик, А.Я. Самуйленко и др. - Курск, 2002. - 211 с.
UNIVERSAL REGIMEN OD SUBLIMATION DRYING OF PROBIOTICS
I.A. Bakhtin, Ye.V. Orlova, V.A. Neschislyayev
SUMMARY
The development of universal regimen of freezing and sublimation drying of probiotics, influence
ОПЫТ РЕГИОНОВ
of freezing method on biologic markers of liophylized preparations and their macroctructure are described in the article.
Key words: inclined freezing, square of free surface of the preparation freezed, universal regimen of probiotics liophylization
Поступила в редакцию 20.09.2009 г.
