CC BY
241
ОРГАНИЗАЦИЯ
ПРОИЗВОДСТВА
МЕДИЦИНСКИХ
ПРЕПАРАТОВ
УДК 636.049.6.
Т.Д. Лимарева, В.Н. Девякович, М.И. Демешева, Л.Н.Мезенцева, Е.В. Рузавина
E-mail: dem @virion.tomsknet.ru.
ВЛИЯНИЕУСЛОВИЙ СУБЛИМАЦИОННОГО ВЫСУШИВАНИЯ ПРОБИОТИКОВ НА СПЕЦИФИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ
Филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ в г Томск «НПО «Вирион»
ВВЕДЕНИЕ
Метод сушки биоматериалов из замороженного состояния в вакууме является наиболее перспективным и удобным для практических целей. Этот метод получил название сублимационного высушивания.
В настоящее время в технологии производства сухих форм пробиотиков широко используется сублимационная сушка. Сублимация - наиболее надёжный и мягкий из известных способов удаления воды из биологически активных веществ. Лиофилизированные препараты сохраняют свою биологическую активность в течение длительного срока с минимальными потерями по количеству живых микробных клеток [1].
Выживаемость микроорганизмов при высушивании зависит от большого количества факторов, среди которых важное место занимают биологические особенности микробов, связанные с их видовой специфичностью, условия культивирования и технологические возможности процесса лио-фильной сушки, обусловленные имеющимися видами оборудования [2].
Целью данной работы явилось изучение влияния условий сублимационного высушивания препаратов лактобактерина и бифидумбактерина на установках ТГ-50.4 и BOC Edwards на специфическую активность препаратов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В качестве исследуемого материала были использованы полуфабрикаты и готовые серии лактобакте-рина и бифидумбактерина производства НПО «Вирион». Препараты были высушены на вакуумносушильных установках ТГ-50 и BOC Edwards в режимах, утверждённых действующими регламентами производства. В качестве ксеропротекторов использовали сахарозо-желатиново-молочную среду, которую добавляли к микробной суспензии в количестве 50%. Препараты разливали во флаконы ФИ-1-5: лакто-бактерин - по 2,2 мл; бифидумбактерин - по 1,8 мл.
На рисунке 1 (кривая АВ1С1) представлены процессы замораживания лактобактерина и бифидум-бактерина в сублиматоре BOC Edwards. Замораживание препаратов вели до температуры не выше минус 42°С в течение не менее 5 часов при температуре полок не выше минус 50°С. Конечная температура замораживания препаратов не выше минус 42°С. При использовании для сублимационного высушивания установки ТГ-50 предварительное замораживание лактобактерина и бифидумбактерина осуществляли в низкотемпературных прилавках TV-1000, охлаждённых до температуры не выше минус 50°С (рис. 1, АВ2С2). Полуфабрикаты загружали в морозильную камеру. Начальная температура продукта при загрузке составляла (22±2)°С. Длительность замораживания продукта при температуре не выше минус 42°С не менее 16 часов, после чего замороженный полуфабрикат загружали в камеру сублиматора.
На рисунке 2 представлен процесс сублимационного высушивания препаратов на установке BOC Edwards. По окончании замораживания препаратов сублиматор переводили на режим высушивания. Охлаждали конденсатор до температуры не выше минус 40°С, включали вакуумный насос. При дости-
♦ В сублимационной установке BOC Edwards □ В низкотемпературном прилавке НС 280/75 Температура конденсатора
Рис. 1. Кривые замораживания пробиотиков
Т.Д. Лимарева, В.Н. Девякович и др.
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ВЫСУШИВАНИЯ ПРОБИОТИКОВ
кривая сублимационнэпо оыеушквачия на О ОС Edwarös кривей суб пг ^¡¡ционмпГо йыСушкйаниЯ на ТГ-50
■rcwnopaiypa полок температура конденсатора
Рис. 2. График сублимационноговысушивания пробиотиков на установке ВОС Edwards и ТГ-50
жении температуры конденсатора не выше минус 40°С и стабилизации вакуума в камере сублиматора не более 13,3 Па начинали подогрев полок: каждый час на 5°С до температуры плюс 30°С. Окончание процесса высушивания определяли по количеству положительных температур препарата. Положительную температуру препарат должен иметь не менее 7 час. Общая продолжительность высушивания препаратов - не менее 27 час.
При высушивании препаратов в вакуумно-сушильной установке ТГ-50 (рис. 2) полки сублиматора охлаждали до температуры не выше минус 25°С, конденсатор - до температуры не выше минус 50°С. Замороженный полуфабрикат максимально быстро выгружали из морозильной камеры, загружали в камеру сублиматора, включали вакуумный насос. В течение 30-60 мин препарат самоохлаждался под вакуумом. При достижении температуры препарата не выше минус 42°С и стабилизации вакуума не более 13,3 Па начинали подогрев полок следующим образом: три часа - до температуры минус 40°С, затем подогрев на 5-10°С в час до температуры плюс 20°С. Температуру плюс 20°С выдерживали не менее 1 часа. Затем вели подогрев полок до температуры плюс 30°С. Конечная температура продукта - не выше плюс 30°С. Длительность процесса высушивания определяли по количеству положительных значений температур препарата, которое должно быть не менее 10 часов для бифидумбактерина и 12 час - для лактобактерина. Общая длительность высушивания бифидумбактерина не менее 38 час, лактобактерина - не менее 45 час.
Оценку специфической активности препаратов по количеству живых микробных клеток проводили согласно ФСП 42-0504722405 «Бифидумбактерин сухой, лиофилизат для приготовления суспензии для приёма внутрь и местного применения» и ФСП 42-0504729805 «Лактобактерин сухой, лиофилизат
для приготовления суспензии для приёма внутрь и местного применения».
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета Excel. Для выявления статистической значимости результатов использовали критерий t Стъюдента [3].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рисунке 1 приведены кривые замораживания пробиотиков: в сублимационной установке BOC Edwards (кривая АВ1С1) и в низкотемпературном прилавке TV-1000 (кривая АВ2С2). Общеизвестно, что степень повреждения биоструктур особенно зависит от глубины и скорости замораживания на предварительном этапе [4].
Скорость охлаждения до температуры минус (10-15)°С на сублимационной установке BOC Edwards (кривая 1, участок АВ1) в два-три раза превышает скорость охлаждения препаратов до этих же температур в низкотемпературном прилавке TV-1000 (кривая 2, участок АВ2). Длительность полного замораживания препаратов при температуре не выше минус 42°С составляет не менее 5 час на установке BOC Edwards и не менее 16 час - в низкотемпературном прилавке TV-1000.
Из литературы известен факт повреждающего действия кристаллов льда на клетки биоматериалов [1]. При этом форма клеток и другие факторы их жизнедеятельности лучше сохраняются в процессе быстрого замораживания (рис. 1, кривая ABjCj). При медленном замораживании (рис. 1, кривая АВ2С2) кристаллы льда формируются преимущественно вне клеток, в результате клетки обезвоживаются, что вызывает сгущение их содержимого и изменение рН среды.
Таким образом, на этапе замораживания повреждение клеток происходит:
1) за счёт перепада температур и механического повреждения клеток при образовании и росте кристаллов льда (быстрое замораживание) и 2) за счёт денатурации белка при пребывании клеток длительное время в концентрированных растворах электролитов и механического повреждения клеток при росте кристаллов льда (медленное замораживание).
На рисунке 2 представлены кривые высушивания препаратов. Важнейшими режимными параметрами, обеспечивающими качество сухого продукта, является температура (отрицательная - при сублимации и положительная - при досушивании) и длительность её поддержания в материале. Длитель-
ОРГАНИЗАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВА МЕДИЦИНСКИХ ПРЕПАРАТОВ
ность этапа сублимации пропорциональна объёму препаратов. Длительность этапа досушивания зависит от времени достижения остаточной влажности не выше допустимой.
При сублимационном высушивании препаратов на установке BOC Edwards окончание процесса определяют по количеству положительных температур препарата. Положительную температуру препарат должен иметь не менее 7 час. Общая продолжительность высушивания - не менее 27 час (рис. 2).
При сублимационном высушивании на ТГ-50
процесс идёт медленнее, и длительность его также определяется количеством положительных температур препаратов: не менее 10 час для бифидумбакте-рина и не менее 12 час для лактобактерина. Общая продолжительность высушивания: не менее 38 час для бифидумбактерина и не менее 45 час для лакто-бактерина (рис. 2).
Одним из основных показателей качества пробиотиков является жизнеспособность микробных клеток после сублимационной сушки (специфическая активность). В таблицах 1 и 2 представлены ре-
Таблица 1
Количество живых микробных клеток бифидумбактерина до и после сублимации
Сублимационное высушивание на BOC Edwards Сублимационное высушивание на ТГ-50
№ серии препарата Количество живых микробных клеток КОЕ/мл (M±m) № серии препарата Количество живых микробных клеток КОЕ/мл (M±m)
До сушки После сушки До сушки После сушки
297 (8,5±0,5) х108 (2,0±1,0) х108 299 (1,5±0,5) х109 (8,2±0,8) х107
303 (1,5±0,5) х109 (2,5±0,5) х108 301 (1,5±0,5) х109 (7,0±0,5) х107
305 (1,5±0,5) х109 (3,5±0,5) х108 304 (1,0±0,5) х109 (1,3±0,2) х108
298 (2,0±1,0) х109 (3,5±0,5) х108 306 (1,0±0,0) х109 (1,3±0,6) х108
300 (9,0±1,0) х108 (3,0±0,5) х108 312 (1,0±0,0) х109 (8,6±0,6) х107
302 (2,0±0,0) х109 (3,5±0,5) х108 313 (9,0±0,0) х108 (7,2±0,2) х107
305 (1,5±0,5) х109 (1,2±0,5) х108 315 (1,0±0,0) х109 (1,0±0,3) х108
314 (8,5±0,5) х108 (2,0±0,1) х108 318 (2,0±0,0) х109 (1,2±0,5) х107
316 (1,0±0,0) х109 (1,0±0,0) х108 319 (7,5±0,1) х108 (8,8±0,4) х107
317 (1,0±0,0) х109 (1,0±0,0) х108 - - -
320 (7,0±0,1) х108 (2,0±0,0) х108 - - -
321 (8,5±0,5) х108 (2,0±0,1) х108 - - -
Итого (1,2±1,01) х109 (2,43±1,6) х108 Итого (1,2±0,67) х109 (9,6±0,43) х107
Таблица 2
Количество живых микробных клеток лактобактерина до и после сублимации
Сублимационное высушивание на BOC Edwards Сублимационное высушивание на ТГ-50
№ серии препарата Количество живых микробных клеток КОЕ/мл (M±m) № серии препарата Количество живых микробных клеток КОЕ/мл (M±m)
До сушки После сушки До сушки После сушки
61 7,2±0,07 2,7±0,14 62 7,9±0,07 2,0±0,02
63 8,6±0,14 2,3±0 65 7,8±0,21 2,2±0,05
64 8,6±0,21 2,3±0 70 8,9±0,07 2,08±0,1
66 8,2±0,14 2,3±0,14 74 8,3±0,21 1,6±0,1
67 8,0±0 2,3±0 76 9,2±0,21 2,2±0,1
68 7,8±0,21 2,7±0,14 78 7,8±0,14 2,0±0
69 7,3±0,21 2,5±0,14 83 8,5±0,21 1,8±0,2
71 8,5±0,14 2,05±0,07 88 9,0±0,21 2,3±0,5
72 7,8±0,07 2,35±0,07 92 8,7±0 2,3±0,1
73 7,8±0,07 2,05±0,07 98 7,7±0,14 2,3±0,1
77 8,05±0,07 2,25±0,07 107 7,8±0,14 2,08±0,2
79 8,0±0,14 2,05±0,07 124 8,2±0,14 2,03±0,5
Итого 7,97±0,4 2,3±0,2 Итого 8,31±0,5 2,07±0,2
зультаты анализа количества живых микробных клеток в полуфабрикатах и готовых препаратах бифи-думбактерина и лактобактерина до сублимационного высушивания и после.
Как видно из таблиц, средние показатели активности жидких полуфабрикатов, предназначенных для сушки как на BOC Edwards, так и на ТГ-50, фактически не отличались друг от друга (р>0,05; r=0,4 для бифидумбактерина и р>0,05; r=0,15 - для лактобактерина), то есть статистически значимых различий нет.
Бифидумбактерин, высушенный на установке BOC Edwards, имел активность микробных клеток на порядок выше, чем препарат, высушенный на ТГ-50 (р<0,05; r=0,32), для сухого лактобактерина выявлена аналогичная зависимость (р<0,05; r=0,0098).
ВЫВОДЫ
В результате проведённого сравнительного анализа режимов лиофильного высушивания пробиотиков на сублимационных установках BOC Edwards и ТГ-50 установлено:
1. Наиболее критичным этапом в процессе является замораживание. Условия замораживания в низкотемпературном прилавке TV-1000 и в установке BOC Edwards отличаются своей скоростью и длительностью. Высокие скорости замораживания приводят к минимальным повреждениям микробных клеток.
2. Установлено статистически значимое снижение активности пробиотиков при сублимационном высушивании на ТГ-50 по сравнению с BOC Edwards.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антонов С.Ф., Сигаев Г.И., Никонов Б.А., Кобатов А.И. Особенности сублимационной сушки лекарственных и диагностических препаратов в ампулах.// Биотехнология. 1998. - № 5. - С. 48-69.
2. Семёнов Г.В. Вакуумная сублимационная сушка. Основные понятия и определения. - Материалы международной научно-технической конференции. - Москва, 2005. - С. 86-92.
3. Гельман В.Я. Медицинская информатика: практикум. -С-Пб: Питер. - 2002. - 480 с.
4. Нежута А.А., Токарик Э.Ф., Самуйленко А.Я., Безгин В.М., Сербис Е.С. Теоретические и практические основы технологии сублимационного высушивания биопрепаратов. - Курск: Изд-во КГСХА. - 2002. - 239 с.
INFLUENCE OF SUBLIMATION DRYING OF PROBIOTICS ON THEIR SPECIFIC ACTIVITY
T.D. Limareva, V.N. Devyakovich, M.I. Demesheva, L.N. Mezentseva, Ye.V. Rouzavina
SUMMARY
Comparative analysis of conditions of lyophilization of probiotics on freeze-drying devices BOS Edwards and TG-50 was performed. Influence of conditions of freezing and sublimation on specific activity of probiotics is demonstrated to be different.
Key words: sublimation device, liophylization, specific activity.
