CC BY
60
*УДК - 58.002
УНИВЕРСАЛЬНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЛИСТВЕННЫХ И ХВОЙНЫХ ДРЕВЕСНЫХ ВИДОВ К РЕГЕНЕРАЦИИ И ОЦЕНКА ИХ ПЕРСПЕКТИВНОСТИ ДЛЯ ПРИВИВКИ
И. А. Бондорина
Разработана универсальная методика, позволяющая определять регенерационные возможности лиственных и хвойных древесных растений. Полученные результаты позволяют оценить перспективность тестируемого вида для использования его в качестве компонента прививки.
Ключевые слова: методика, лиственные древесные растения, хвойные древесные растения; регенерация, прививка.
Изучение прививки, как метода вегетативного размножения и сохранения интродуцированных древесных лиственных и хвойных растений, в ГБС им. Н.В. Цицина РАН ведется с начала семидесятых годов прошлого века и по настоящее время. Из всех известных способов вегетативного размножения растений, прививку можно отнести к самым сложным. Прививка - это единственный способ размножения растений, где при помощи хирургической операции соединяются две части растений, при этом одна из них, как правило, отделяется от материнского растения (привой) и соединяется с частью другого растения (подвой). Все научно-исследовательские и практические работы в этой области в конечном итоге напрямую или косвенно преследуют одну цель - повышение эффективности прививки. В ГБС уже много лет ведется работа по поиску новых способов и методов для изучения и оценки регенерационного потенциала у интродуцированных древесных растений, используемых в качестве компонентов прививки (Кръстев, Бондорина, 1996, 1999, 2003, 2009).
Продолжение этих исследований и определило основную задачу и направленность данной работы: разработка универсальной методики определения регенерационного потенциала у лиственных и хвойных древесных растений, позволяющую оценивать их пригодность и перспективность для использования в качестве компонентов прививки.
Объектами исследования служили лиственные древесные растения девяти видов и одной садовой формы: Acer negundo L., Acer platanoides L., Aesculus hippocastanum L., Betulapendula Roth, Malus baccata (L.) Borkh., Malus xpurpurea Wierdak', Populus tremula L., Quercus robur L., Rosa canina L., Sorbus aucuparia L.
А также три вида хвойных древесных растений: Abies concolor (Gordon ex Glend.) Lindl. ex Hildebr., Pinus nigra Am., Picea omorica (Pancic) Purk.
При постановке опытов в наших исследованиях при помощи хорошо заточенной трубки из нержавеющей стали на 2-3 летних ветвях вырезали участки коры до ксилемы, по пять вырезов, которые затем удаляли. Место ранения обвязывали прозрачной пленкой (как при обвязке прививкой).
Наблюдение за объектами опытов проводили визуально, а отдельные этапы протекания регенерационного процесса фиксировали цифровой фотокамерой. Полученные фотографии зоны регенерации изучали в пяти-десятикратном увеличении при помощи компьютера.
Оценку регенерационных возможностей изучаемых растений проводили при помощи предложенной нами формулы:
где 8 - регенерационный потенциал растений;
ЕХ - сумма процентов площадей вырезов, занятых каллусом;
N - число вырезов;
N - число дней от начала эксперимента и до окончания наблюдений (в нашем опыте - 25 суток).
Регенерационный потенциал считается неудовлетворительным, если величина показателя 8 не превышает единицу, при 8 от 1 до 2 - удовлетворительным, от 2 до 3 - хорошим, от 3 до 4 - очень хорошим.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методом двухфакторного дисперсионного анализа небольшой группы данных при помощи равенства, рекомендуемого Г.Н. Зайцевым (1984).
Способность большинства древесных растений к образованию каллусной ткани при ранении служит основным признаком для оценки регенерационного потенциала. Образование каллуса характеризует наиболее точно весь регенерационный процесс от начала образования первых очагов до окончательной дифференциации раневого каллуса в специализированные периферийные ткани перидермы. Весь этот сложный процесс напрямую зависит от биологических особенностей растений и его физиологического состояния в конкретный период вегетации. Кроме того, за
S =---/n,
N
протекания отдельных этапов, измеряя площадь раневой поверхности, занятой образовавшимся каллусом.
Как показали проведенные нами исследования у лиственных и хвойных древесных растений, регенерационно-восстановительные процессы протекают по одной схеме. Это связано, прежде всего, с наличием в большинстве случаев анатомически одинаковых тканей и их одинаковой меристематической способностью в зоне выреза периферийных тканей у стеблей разных видов лиственных и хвойных видов древесных растений (Эсау, 1969). В любом случае после выполнения выреза и удаления коры на однолетних стеблях модульного растения лиственного или хвойного древесного вида, в результате этой операции на раневой поверхности обнаруживаются общие одноименные ткани, такие, как эпидерма, феллоген, вторичный луб (флоэма), камбий, вторичная древесина (рис. 1 А, В).
Наряду с одноименными тканями (рис. 1), в зоне выреза присутствуют и такие ткани, которые характерны только для лиственных (колленхима, паренхима первичной коры, волокна протофлоэмы) или только для хвойных (гиподерма, листовой след, листовая подушка, хлоренхима, смоляные ходы коры).
Естественное протекание регенерационного процесса в зоне выреза коры будет в значительной мере зависеть от скорости возобновления деятельности камбия вблизи зоны ранения, в том числе и возобновления меристематической активности некоторых из тканей коры. Исходя из этого, можно предположить, что и лиственные и хвойные древесные виды одинаково будут реагировать на ранения, так как в зоне их вырезов присутствуют в основном одни и те же ткани. Однако, надо особенно подчеркнуть, что в первую очередь, в этот процесс вступают неповрежденные клетки камбия и его производные - вторичная древесина и вторичная флоэма, расположенные вблизи зоны ранения.
Камбий - основная образовательная ткань растений, которая при регенерации прививки и заживлении ран играет главную роль. В зоне ранения каллусная ткань может возникнуть там, где есть живые паренхимные клетки. Но особенно легко и быстро каллус возникает из живых неповрежденных клеток камбия. В образовании каллуса заметное участие будут принимать и живые элементы его производных, в первую очередь - вторичная ксилема. У лиственных деревьев неповрежденные клетки вторичной ксилемы вблизи зоны ранения начинают выполнять функции меристемы, что способствует каллусообразовательному процессу. Вторичная ксилема хвойных растений пронизана большим числом смоляных ходов. Надо отметить, что секреторная система ксилемы, в том числе и вторичной, у хвойных растений состоит из горизонтальных и вертикальных смоляных ходов, которые напрямую не принимают активного участия в регенерации каллуса, но влияют на возобновление меристематической активности вторичной ксилемы. Установлено, что образование каллуса вблизи смоляных ходов начинается быстрее и интенсивнее. Наличие большого числа смоляных ходов во вторичной ксилеме способствует образованию каллуса на поверхности вырезов (Фурст, Богданов 1976).
Вторичная флоэма (луб) в сосудистом растении выполняет функцию доставки питательных веществ от листьев к другим органам. Вторичная флоэма образуется из камбия, как и вторичная ксилема, но она в отличие от ксилемы не долговечна. По мере утолщения осевых органов у многих древесных растений функционирующая флоэма ограничивается одним годичным кольцом. Поскольку вторичная флоэма состоит из ситовидных элементов, паренхимных клеток нескольких типов (живые клетки), волокон и склереид (мертвые клетки), то очевидно, что их роль в образовании каллуса мало заметна. При оценке регенерационно-восстановительных процессов при прививке и заживлении ран, надо учитывать, что каллус может возникать там, где есть живые паренхимные клетки. Благодаря вторичной флоэме, которая в большей своей части состоит именно из таких клеток, также в зоне срастания, при соответствующих благоприятных условиях температуры и влажности, может возникнуть каллус.
Первичная кора присутствует в осевых органах однолетнего стебля лиственных и хвойных деревьев. У лиственных в первичной коре преобладает механическая ткань - колленхима наряду с другими присутствующими в образовании первичной коры тканями. Оценивая их способность к меристемизации, можно утверждать, что их роль и участие в регенерации каллуса ничтожно мала. У хвойных участие тканей первичной коры в образовании каллуса на раневой поверхности вырезов гораздо заметнее (Дубовицкая, Фурст 1954, Фурст, Богданов 1976, 1978).
Даже неполный анализ и оценка всех тканей, присутствующих в зоне выреза, свидетельствуют, о том, что в регенерационно-восстановительном процессе, происходящем на поверхности вырезов, одновременно будет происходить и прямое образование каллуса из меристематически активных тканей (камбий и его производные) и дополнительное - после меристемизации клеток некоторых специализированных тканей - вторичной флоэмы и ксилемы, а также в первичной и вторичной коры, в том числе, и прилегающих к смоляным ходам клеток паренхимы.
Как уже отмечали, основным диагностическим признаком для определения естественного
сделанных на периферийных тканях у годичных или двухгодичных побегов, при этом очень важным моментом является скорость его образования.
При естественном ходе регенерации, независимо от видовой или сортовой принадлежности растений, наблюдаются некоторые общие тенденции. Первые очаги каллуса начинают образовываться по бокам выреза, а спустя некоторое время в нижней его части. В последнюю очередь каллус начинает образовываться в верхней части выреза.
Динамика процесса регенерации хорошо прослеживается на вырезе, сделанном на годичном побеге Populus tremula. На сделанном вырезе перидермы хорошо виден весь слой, из которого она состоит (феллема; феллоген; феллодерма), а также четкий круг обнаженной ксилемы (рис.2). Через 7 суток после выполнения выреза и удаления перидермы можно увидеть, что на обеих боковых сторонах срезов к центральной зоне выреза идет интенсивный процесс образования каллуса (рис.3). За этот период регенерационный процесс последовательно прошел через несколько этапов:
- появление первых очагов каллуса,
- образование сплошных каллусных валиков с двух боковых сторон выреза,
- образование каллуса в нижней части раневого выреза,
- соединение каллуса, образовавшегося в нижней части с боковыми каллусными валиками.
В период от 7 до 14 сутки боковые каллусные валики продолжают увеличиваться, и соединяются с образовавшимся в верхней части каллусом. Таким образом, по периферии выреза образуется сплошное кольцо из камбиальной ткани, которая интенсивно увеличивается, и к 21 суткам занимает приблизительно 70,3% от общей площади раневого круга, а незанятая, соответственно, составляет 29,7% (рис.4).
Вычисление процентного соотношения занятой и незанятой площади проводили простыми последовательными математическими действиями. Общая площадь круга остается в дальнейшем неизменной величиной, которую можно считать за 100%. Потом вычисляли площадь незанятой каллусом ткани. Разница между общей площадью круга и площадью, не занятой каллусом, составляет фактический процент занятой площади в данный момент.
Надо отметить, что площадь, не занятая каллусом, не имеет форму круга. Судя по рисункам 3, 4 и
5, незанятая площадь ближе всего по форме к эллипсу. Например, процент незанятой площади каллусной ткани у выреза, представленном на рисунке, вычисляем последовательно, следующим образом:
1. На фотографии, увеличенной в восемь раз, радиус окружности составляет 42,5 мм. Вычисляем общую площадь выреза
8= к г2 = 3,14-42,52= 5671,6мм2 = 100%
2. Вычисляем незанятую площадь выреза. Сначала находим средний размер радиуса, и поскольку форма, не занятая каллусной тканью представляет собой эллипс, то общий средний радиус складывается из длинного вертикального и короткого горизонтального, и, в данном случае, составляет 27,5 мм (диаметр длинный - 60 мм; диаметр короткий - 40 мм; отсюда - диаметр средний - 50 мм и радиус (г) - 25 мм).
Площадь, не занятая каллусной тканью, которая по форме ближе к эллипсу - 8 = 3,14-25-25 = 1962,5мм2, что составляет 34,6% от общей площади (5671,6 - 100%, 1962,5 - х%, отсюда х = 1962,5-100/5671,6-34,6%).
3. Занятая площадь выреза каллусной ткани составляет 65,4% (100-34,6).
Экспериментальные данные, полученные в результаты наблюдений за динамикой протекания регенерационного процесса, показывают, что начало каллусообразования визуально наблюдается на 3-4 сутки после выполнения раневых вырезов на коре у Populus tremula, и уже на 4-е сутки вновь образованный каллус занимает 5,2% от общей площади (табл. 1). В период с 4-х по 7-е сутки каллусная масса нарастает наиболее интенсивно, в среднем по 6,8% в сутки. С 7-го по 14-й день процесс образования каллуса хотя и замедляется, но идет достаточно интенсивно и составляет в среднем 1,8% в сутки. В дальнейшем интенсивность каллусообразования постепенно уменьшается, и к 25-м суткам составляет всего 0,9%.
Таблица 1.
Динамика естественного протекания регенерационного процесса в весенний период вегетации у
Роры1т 1гвти1а.
Число дней Средняя суточная динамика образования каллуса, % Образование каллуса, %
4 1,3 5,2±0,04
7 6,8 52,7±0,13
14 1,8 65,4±0,20
21 1,0 72,4±0,15
r 25 0,9 7б,І±0,27 ^
28 0,7 78,2±0,28
35 0,б 82,2±0,І7
42 0,7 87,І±0,24
49 0,б 9І,3±0,29
5б 0,4 94,І±0,32
бЗ 0,2 95,5±0,25
Анализируя состояние естественного протекания регенерационного процесса, можно отметить, что процесс каллусообразования начиная с 25-х суток протекает медленно и к 49-50 суткам занятая площадь вырезов достигает 91,3%, т.е. всего по 0,6% в сутки.
Из приведенного примера видно, что за 25 суток с начала с начала эксперимента на поверхности раневых вырезов у Populus tremula образуется 76,1% каллуса, т.е. больше, чем % из возможных 100%. Надо отметить, что такая тенденция наблюдается и для других видов древесных растений.
Результаты оценки регенерационного потенциала у 10 лиственных и 4 хвойных древесных растений в условиях ГБС по предложенной нами методики, представлены в таблице 2.
Таблица 2.
Оценка регенерационного потенциала у древесных растений в весенний (24.04 по 19.05) и летний
(G1.GS по 25.GS) периоды вегетации.
Название растений Образование каллуса за 25 суток
весна лето среднее
каллус,% баллы каллус,% баллы каллус,% баллы
Лиственные
Acer negundo 34,8±0,29 І,4 50,7±0,35 2,0 42,7 i,8
Acer platanoides 33,б±0,20 І,3 4б,3±0,8І І,8 39,9 І,б
Aesculus hippocastanum 37,5±0,28 i,5 42,5±0,30 i,7 40,0 І,б
Betula pendula Зб,б±0,20 i,4 40,0±0,20 І,б 38,3 i,5
Malus baccata 57,3±0,49 2,3 77,б±0,24 3,i б7,5 2,7
Malus x purpurea 'Wierdak' 3б,3±0,20 i,5 42,5±0,І9 i,7 39,4 І,б
Populus tremula 75,І±0,27 3,0 82,2±0,i7 3,3 78,7 3,2
Quercus robur 22,5±0,49 0,9 33,б±0,52 i,3 28,І i,i
Rosa canina 32,2±0.І9 i,3 77,5±0,27 3,i 54,8 2,2
Sorbus aucuparia 3І,8±0,20 i,3 75,0±0,30 3,0 53,4 2,i
Среднее 39,S 1,6 56,S 2,3 4S,3 2,G
Хвойные
Abies concolor 2,0±0,І0 0,i 27,8±0,22 i,i І4,9 0,б
Larix sibirica 24,8±0,І8 i,0 4i,7±0,27 i,7 24,8 i,4
Picea omorica 3,8±0,І5 0,2 27,i±0,34 i,i І5,4 0,7
Pinus nigra І,5±0,07 0,i 27,8±0,3б i,i І4,7 0,б
Среднее S,Q Q,6 31,1 1,3 14,2 Q,S
Лиственные древесные растения обладают не одинаковой способностью к регенерации (табл. 2) как по сравнению между собой, так и в зависимости от периода вегетации. В весенние сроки из десяти тестируемых видов только у Quercus robur величина вычисленного регенерационного потенциала ниже одного балла, то есть неудовлетворительная. Удовлетворительный регенерационный потенциал от одного до двух баллов наблюдается у семи из десяти видов. В весенние сроки вегетации один вид (Malus baccata) показал хороший и один (Populus tremula) очень хороший регенерационный потенциал.
Особый интерес для настоящего исследования представляет определение регенерационного потенциала у одних и тех же видов, но в разные периоды вегетации. В этой связи те же самые 10 видов лиственных растений были протестированы в летние сроки. Полученные результаты (табл. 2) убедительно показывают, что в летние сроки эти виды проявляют в среднем хорошую (2,3 балла) способность к регенерации, в начале весны наблюдаются в среднем удовлетворительные результаты (1,6 баллов). Интересно в этой связи отметить, что в летний период у пяти видов наблюдается удовлетворительная регенерационная способность, у одного хорошая и у четырех очень хорошая. Суммируя результаты, полученные в весенние и летние сроки можно получить объективное представление о биологической способности конкретного вида лиственного древесного растения в конкретных условиях. По средним показателям десять изученных видов распределяются следующим образом: удовлетворительным регенерационным потенциалом обладают растения шести видов (Acer negundo, Acer platanoides, Aesculus hippocastanum, Betula pendula, Malus x purpurea 'Wierdak', Quercus robur; хорошим - Malus baccata, Rosa canina, Sorbus aucuparia; очень хорошим в условиях ГБС г. Москвы показал только один вид - Populus tremula.
Особый интерес для настоящего исследования представляет оценка регенерационг потенциала у хвойных видов древесных растений, наименее изученных в этой области. В связи с этим, по той же самой методике, как и для лиственных древесных растений, были проведены экспериментальные исследования для оценки регенерационного потенциала у хвойных растений четырех видов. У хвойных древесных растений в данных конкретных условиях способность к регенерации намного ниже, чем у лиственных растений, о чем свидетельствуют полученные результаты в среднем для весенних сроков - 0,6 баллов, то есть неудовлетворительные и удовлетворительные - 1,3 для летнего периода. Важно отметить, что в весенний период только у Larix sibirica вычисленную регенерационную способность (1 балл) можно считать удовлетворительной, а для остальных хвойных растений трех видов результаты ниже одного балла, то есть неудовлетворительные. В летний период вегетации все тестируемые растения показали удовлетворительные результаты. Следует отметить, что в среднем, только Larix sibirica показывает устойчиво удовлетворительную регенерационную способность (1,4 балла), а все остальные виды - неудовлетворительную, то есть ниже одного балла.
Предложенный метод и формула для определения регенерационного потенциала и носит универсальный характер, то есть ее можно применить независимо от видовой принадлежности растений, периода вегетации и условий окружающей среды.
Достоверность результатов опыта оценивали при помощи дисперсионного анализа, разработанного Г.Н. Зайцевым (1984).
Таблица 3
Дисперсионный анализ данных регенерационного потенциала у лиственных и хвойных растений
(по данным таблицы 2).
Варьирование данных Сумма квадратов отклонений Степень свободы, V Дисперсия, q2 Критерий Фишера Доля влияния, %
F F (P = 95%)
Общая І3025,34 27 482,42 - - І00
По градациям фактора 1 (видовые особенности) 9457,38 ІЗ 727,49 8,33 2,60 72,6
По градации фактора 2 (сроки - весна, лето) 2433,ІІ І 2433,ІІ 27,87 4,67 І8,7
Остаточное ІІ34,85 ІЗ 87,30 - - 8,7
Общая средняя арифметическая каллусообразования Мср=40,07±1,76%
Ошибка общей средней арифметической: ш^=±1,76%
Показатель точности опыта: Р=4,4%, меньше 5% критического значения.
В результате проведенного математического анализа были получены фактические значения критерия Фишера, которые сравнивали с табличными величинами. Так, для фактора 1 (влияние видовых особенностей изучаемых объектов на способность к регенерации) полученная величина критерия Фишера 8,32 больше, чем его табличное значение 2,60, делаем вывод о том, что регенерационная способность достоверно зависит от видовой принадлежности тестируемых растений. Поскольку F2 = 27,87 больше, чем Б'таб = 4,67, также с уверенностью можно считать доказанным, что физиологическое состояние растений и климатические факторы в весенний и летний сроки существенно влияют на регенерационную способность растений, независимо от видовой принадлежности объектов (таблица 3).
Данный метод статистического анализа позволил выделить долю участия каждого фактора из общей совокупности факторов, оказывающих влияние на регенерационный потенциал и образование раневого каллуса, как его объективное отражение. Так, регенерационный потенциал в наибольшей степени зависит от видовых особенностей. Его доля влияния составляет 72,6% (фактор 1) от общей 100% совокупности, а доля влияния фактора 2 намного меньше (18,7%), т.е. можно считать, что регенерационный потенциал у тестируемых древесных видов больше всего зависят от видовых особенностей, о чем свидетельствует доля влияния, неучтенные факторы в данном эксперименте всего 8,7% из общей совокупности факторов.
Таким образом, математическая обработка экспериментальных данных подтвердила сделанные при сравнительном анализе выводы и предположения. Косвенным подтверждением этому служит и вычисленный показатель точности опыта P = 4,4%. Так как эта величина меньше критического 5% значения, можно считать, что предложенная методика и формула для определения регенерационного потенциала у растений древесных видов и оценки их перспективности для вегетативного размножения методом прививки перспективна.
Universal method of estimation of biological ability of coniferous arboreal plants and deciduous arboreal plants to regeneration has been worked out. The results show their perspective as a component for grafting of the species being tested. The key words: method, coniferous arboreal plants, deciduous arboreal plant, regeneration, grafting.
1. Александров В.Г. Анатомия растений. М.: Советская наука. 1954. 499 с.
2. Дубовицкая ИИ. Регенерация и возрастная изменчивость растений. М.: Из-во АН СССР. 1961
г.- 62 с.
3. Дубовицкая И.И., Фурст Г.Г. Каллус как очаг новообразований растений. Известия АН СССР. Сер. Бюлл. 1954. №4.
4. Зайцев Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной ботанике. М.: Наука. 1984. 424 с.
5. Кръстев М.Т., Бондорина И.А. Прививка сортов миниатюрных роз на неукорененные черенки//Бюлл. Гл. ботан. Сада. 1996. вып. 173. с. 167-169.
6. Кръстев М.Т, Бондорина И.А Оценка регенерационного потенциала древесных растений, используемых в качестве компонентов прививки // В сб.: Проблемы дендрологии на рубеже XXI века. Тезисы докладов Международной конференции, посвященной 90-летию со дня рождения члена-корреспондента РАН П.И. Лапина. М.: Российская академия наук, Совет ботанических садов Росси, ГБС им. Н.В. Цицина. 1999. с. 183-184.
7. Кръстев М.Т., Бондорина И.А. Прививка в штамб как способ изменения декоративных качеств древесных лиственных растений//Бюллетень Государственного Никитского ботанического сада, Ялта. 2003. - вып. 88. с. 79-81.
8. Кръстев М.Т., Бондорина И.А. Методы оценки регенерационного потенциала древесных лиственных растений//«Сохранение биоразнообразия растений в природе и при интродукции». Материалы международной научной конференции, посвященной 165-летию Сухумского ботанического сада 15-20 октября 2006 г. Абхазия, Сухуми. 2006. с. 282-283.
9. Фурст Г.Г., Богданов Б. Раневые реакции тканей секреторной системы коры в прививках сосны румелийской на сосну обыкновенную//Лесоведение. 1976. Т.5-6. № 3. С.74-83.
10.Фурст Г.Г., Богданов Б. Влияние прививочного ранения на структуру и функцию смоляных ходов стебля в межвидовых прививках сосен//Лесоведение. 1978. Т.5-6. № 3. С. 50-59.
11.Эсау К.А. Анатомия растений. М.: Мир. 1969. т.1, т. 2.
Об авторе
Бондорина И. А.- главный ботанический сад имени Н.В. Цицина РАН, кандидат биологических наук, заведующая отделом декоративных растений, [email protected].
