CC BY
14УДК 616.002.828
ВВЕДЕНИЕ
УАЬТРАСТРУКТУРНЫЕ АСПЕКТЫ СТАРЕНИЯ КЛЕТОК НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РОДА ASPERGILLUS
Степанова А.А, (вед. н. сотр.)*/ Синицкая И .А. (ст. н. сотр).
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина ГОУ ДПО СПб МАПО, Санкт-Петербург, Россия
© Степанова А. А., Синицкая И А., 2009
На примере разных типов клеток культур 5 видов рода Aspergillus изучены улътраструктурные аспекты старения. Показано, что общий ход старения клеток культур изученных видов аспергиллов протекал в следующе м направлении: вегетативный мицелий^> конидиеносец и головка—> стеригмы —жонидии.
Ключевые слова: Aspergillus, конидиогенный аппарат, мицелий, органеллы, старение, ультраструктура клетки, штаммы
ULTRASTRUCTURAL ASPECTS OF CELLS SENESCENCE OF SOME ASPERGILLUS SPR
Stepanova A.A. (leading researcher), Sinitskaya I.A. (senior researcher)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology, SEI APE SPb MAPE, Saint Petersburg, Russia
© Stepanova A.A., Sinitskaya LA., 2009
On the example of different types of the cells of cultures of 5 species from genus Aspergillus the ultrastructural aspect of senescence were investigated. It was revealed that the general way of senescence of the cells of investigated species cultures pass in such direction: vegetative mycelium—>conidiophore stalk and vesicle—>sterigmes—>conidia.
Key words: Aspergillus, cell ultrastructure, apparatus, mycelium, organelles, senescence, strains
conidiogenous
: Контактное лицо: Степанова Амалия Аркадьевна Тел.: (812) 303-51-40
Грибы, благодаря своеобразным особенностям роста, представляют собой удобную модель для изучения процессов старения. До сих пор ультраструк-турные аспекты старения были детально изучены на примере небольшого числа видов несовершенных, сумчатых и базидиомицетовых грибов [1]. При сравнении особенностей протекания процессов старения в клетках Cryptococcus neoformans в зависимости от степени вирулентности штаммов и условий обитания (in vitro и in vivo) существенные различия отсутствовали [6|. До настоящих исследований в научной литературе лишь упоминали о выявлении у A. flav us первых признаков старения конидиогенных аппаратов в конидиеносце и головке. Тем не менее, эти данные важны для ответа на вопрос: каков характер деструктивных процессов в клетках аспергиллов при естественном старении клеток и непосредственно под влиянием антимикотиков как in vitro, так и in vivo.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
С помощью метода просвечивающей электронной микроскопии изучили клетки культур 5 видов рода Aspergillus: A. niger Tiegh. (PKnrF-1124), A, terreus Thom (РКШТ-1275/1397), A. sydowii (Bainier & Sartory) Thom & Church (РКШТ-1241/797), A.flavus Link (РКГПТ-954/5425) и /1. fumigalus Fresen. (PKnrF-1172) из Российской коллекции патогенных грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина. Первые три штамма были выделены от больных отомикозом, тогда как A. flavus изолирован из биоптата абсцесса и A. fumigatus, соответственно, из промывных вод бронхов больных аспергиллезом. Культуры грибов выращивали на среде Чапека в термостате при 27 °С и фиксировали через 2, 3, 5, 10 и 20 дней после посева по методике, описанной нами ранее [2].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При описании клеточных аспектов старения культур аспергиллов мы использовали классификацию японских исследователей Yanagita Т. и Kogane F. (1962), которые различают 4 морфологические зоны дифференциации (Рис. 1.1-4) вегетативного мицелия: 1) маргинального роста; 2) дифференциации воздушного и субстратного мицелия; 3) формирования ко-нидиофоров и конидиогенеЗа; 4) отмерших клеток.
Общеизвестно, что апикальный рост гиф вегетативного мицелия (Рис. 1.1) по твердому субстрату обусловливает его активную колонизирующую способность. Формируемые апикальной клеткой вегетативного мицелия сегменты подвергались росту и дифференциации (Рис. 1.2), по окончании которых в них практически сразу начинались процессы старения. Массовая закладка конидиеносцев имела место
в третьей зоне колоний аспергиллов (Рис. 1.3), впоследствии дифференцирующихся в конидиофоры. Клетки субстратного мицелия, формирующие ко-нидиеносцы, были в состоянии дифференциации; в них и смежных с ними сегментах гиф происходил синтез большого числа запасных веществ, которые впоследствии утилизировались формирующимися конидиофорами. В последних уже на начальных этапах конидиогенеза содержимое опорной клетки и нижней пятой части конидиеносца были полностью отмершими, без цитозоля. По мере формирования цепочек конидий содержимое конидиеносцев постепенно опустошалось в направлении от его основания к головке (Рис. 1.3). После полного опустошения содержимого головки процессы старения затрагивали стеригмы первого, а затем - и второго ряда (А niger, А. Аауия, А. 1еггеи,ч, А. 8ус1о\уи). В апексе стеригм не наблюдали полностью опустошенных конидиофоров цепочек конидий. Отметим, что полный лизис конидиеносца и головки протекал после исчезновения стеригм из состава конидиофора (Рис. 1.4), заключительным деструктивным процессам подвергались конидиеносец и головка. Темные и сильно деформированные остатки клеточных стенок разрушенных стеригм довольно долго присутствовали на поверхности головки (Рис. 3 с). Зрелые конидии, покидающие стеригмы, после определенного периода покоя приступают к росту в ходе которого их содержимое довольно скоро также подвергается старению и впоследствии полному опустошению.
С возрастом колоний культур изученных видов аспергиллов частота встречаемости стареющих и полностью опустошенных клеток в гифах мицелия существенно возрастала в направлении от центра колонии к ее периферии. В 20-ти дневных колониях грибов интактные клетки в гифах мицелия практически отсутствовали.
На ультраструктурном уровне старение клеток вегетативного мицелия и конидиогенного аппарата у исследованных видов аспергиллов, в целом, протекало однотипно. Вначале отмечали формирование центральной вакуоли, занимающей основной объем клетки (Рис. 2а, 3 ж-м,о). Отметим, что процессы старения в клетках С. пео/огтапя также были сопряжены с их вакуолизацией [6]. В конидиогенном аппарате процесс вакуолизации изначально отмечали одновременно в конидиеносце и головке, а затем - в стеригмах первого и второго рядов {А. niger, А./1ауих, А. Ьеггеш, А. ^усЬти). Вакуолизация стеригм первого и второго рядов обычно происходила синхронно (Рис. 3 р), тогда как последующие деструктивные изменения - асинхронно (Рис. 3 л).
Формирование центральной вакуоли происходило за счет слияния и последующего роста вакуолей средних размеров, что было сопряжено с локальным автолизом цитозоля и органелл клетки. В ходе последнего процесса разные по объему участки цитоплазмы с цитозолем, свободными рибосомами и ор-ганеллами попадали в инвагинацию тонопласта, за-
тем отделялись внутрь вакуоли, где полностью лизи-ровались. Содержимое таких автофаговых вакуолей становилось довольно разнообразным (Рис. Зл,м) благодаря присутствию скоплений фибриллярногранулярного материала разного объема, обрывкам мембран разной протяженности и конфигурации, а также присутствию дегенерирующих митохондрий, пероксисом и т. д. Затем в стареющих клетках исследованных видов аспергиллов происходили изменения в строении ядер и митохондрий. В клетках одного и того же типа первые признаки старения в одних случаях затрагивали ядра (Рис. 3 з,о), тогда как в других - митохондрии (Рис. 2 ж), но чаще всего - одновременно и те и другие (Рис. 2г). Сходная особенность дегенеративных изменений ядер и митохондрий ранее была описана и для разных типов стареющих клеток агариковых грибов.
Ядра клеток теряли групповое расположение и приобретали слегка неправильную (Рис. 2 в, д, ж) либо, напротив, строго сферическую форму (Рис. 2а). В ядрах одних клеток первым исчезал конденсированный хроматин (Рис. 1 ж,д,е), тогда как в ядрах других - диффузный хроматин (Рис. 2з). Нуклеоплазма просветлялась, ядрышко уменьшалось в размерах почти в 2 раза (рис. 2 в, ж), сильно уплотнялось (Рис.
2 ж), гранулярный компонент исчезал из его состава (Рис. 2 и). Далее происходило резкое снижение электронной плотности фибриллярного компонента и его распад на отдельные блоки, которые впоследствии полностью лизировались. В перинуклеарном пространстве формировались нерегулярно расположенные светлые локальные расширения (Рис. 2 г,е,п) разного объема. Отмечали снижение частоты расположения ядерных пор и увеличение их диаметра; компоненты их порового аппарата переставали выявляться. Полярное тельце веретена, приуроченное к наружной мембране оболочки ядра, приобретало неправильную форму и нечеткий контур (Рис. 2 п); оно исчезало довольно поздно, всегда после утраты ядром своего содержимого.
Митохондрии, как и ядра стареющих клеток, теряли групповое расположение (Рис. 2 г), увеличивались в размерах и приобретали неправильный контур (Рис. 2 л). Далее отмечали просветление их матрикса (Рис. 2 г,д,л,м; Зж). Кристы уменьшались в числе и размерах, фрагментировались и полностью лизировались (Рис. 2 г, д). Затем происходил лизис внутренней мембраны оболочки этих компонентов клетки, что фактически превращало их в автолити-ческие вакуоли. По нашим наблюдениям, описанные изменения в строении митохондрий, в одних случаях, происходили в клетках с интактным цитозолем (Рис. 2 г,л; Зж), в других, напротив, - уже без него (Рис. 2 д,к). В некоторых клетках субстратного мицелия, содержащих митохондриальный ретикулум, последний распадался на отдельные, намного более мелкие органеллы (Рис. 2 к), число которых прогрессивно сокращалось. Отмечали фрагментацию и вези-куляцию цистерн эндоплазматического ретикулума,
приводящим к увеличению общего числа пузырьков в содержимом клетки (Рис. 3 а, б). В пероксисомах вначале наблюдали локальное, а затем — и повсеместное просветление матрикса. Контур этих орга-нелл становился неправильным; ограничивающая их мембрана распадалась на фрагменты и впоследствии подвергалась лизису.
В целом, старение клеток протекало на фоне прогрессирующего снижения численности органелл клетки и свободных рибосом. Затем полностью исчезал цитозоль (Рис. 2 б,е-к,м; За,б) и запасные вещества, которые лизировались в следующей последовательности: розетки гликогена, липидные включения, фиброзиновые тельца (А ЩЫшш, Рис. 2н), темные глобулярные включения (Рис. 2м), фибриллярный белок цитозоля (Рис. Зп) и гранулы полифосфатов (А, пщщ А. Ьеггеш, А. fumigatus), локализующиеся в ва-куолярном содержимом (Рис. Зк). В стареющих клетках дольше всего сохранялись ядра (Рис. 2 а,б,д,е,ж; 3 з), тельца Воронина (Рис. 2 р) и вирусоподобные частицы {А. Аауш, рис. 2 о).
Плазмалемма и тонопласт вакуолей подвергались деструктивным процессам в последнюю очередь; это наблюдали при переходе клеток к заключительному этапу старения - некрозу, предшествующему гибели клетки. При этом в одних случаях первым распадался на фрагменты и лизировался тонопласт (Рис. 3 в), в других - плазмалемма (Рис. 2 б, м), а в третьих - одновременно обе названные мембраны (Рис.
3 в). Тонопласт также фрагментировался и формировались многочисленные везикулярные элементы. При этом вещества из вакуолярного содержимого, представляющие собой гидролитические ферменты, попадали в цитоплазму, что и вызывало глобальный автолиз содержимого клетки.
В ходе старения клеток латеральные клеточные стенки постепенно истончались (Рис. 2 а-г, е), теряли присущую им форму, становились неравномерными по толщине (Рис. 3 е) и слабо контрастными. Впоследствии в них происходили локальные разрывы (Рис. 3 е, стрелка) разного диаметра, через которые дегенерирующие остатки содержимого некогда живой клетки выходили наружу. Формирование аналогичных разрывов было характерно для стенок клеток вегетативного мицелия и плодовых тел агариковых грибов (Степанова А.А., Васильев А.Б., 1994), находящихся на заключительных этапах старения. Дегенеративные изменения фибриллярногранулярного слоя, локализующегося снаружи стенок клеток субстратного мицелия некоторых видов аспергиллов |^. А Ьеггеш, А./1ауш), при-
водили к тому, что он приобретал неравномерную толщину (Рис. 2 г,д). Первоначально из его состава исчезал фибриллярный компонент, а затем - и гранулярный, что в конечном итоге полностью обнажало клеточные стенки (Рис. 2 д,з,с; Зб). После отделения цепочек конидий от стеригм, часть клеточной стенки в их апексе локально утолщалась (Рис. 3 к).
По мере старения клеток вегетативного мицелия и конидиогенных аппаратов, вблизи септаль-ных пор вместо телец Воронина появлялись мелкие темные гомогенные пробки округлой (Рис. 2 с), неправильной или дисковидной формы, полностью закупоривающие названные поры. Крайне редко в просвете септальных пор можно было наблюдать пробки в форме шкива (Рис. 2т). Присутствие пробок в порах септ могло полностью блокировать или уменьшать транспорт литических ферментов из стареющих клеток в интактные. Тельца Воронина довольно долго отмечали в стареющих клетках уже без цитозоля, свободных рибосом, ядер и других компонентов клетки (Рис. 2 р). Процессы старения, как правило, затрагивали латеральные клеточные стенки и септы одновременно. При этом значительно снижалась электронная плотность микрофибрилл септ, последующий лизис которых приводил к изменению их клиновидной (на продольном срезе) формы на неправильную (Рис. 2 т). Со временем пробки из септальных пор стареющих клеток исчезали, при этом их диаметр сильно увеличивался. В конечном итоге септы сильно утоньшались и деформировались, как и латеральные клеточные стенки, что делало возможным массовую миграцию дегенерирующих компонентов цитоплазмы из одной клетки в другую.
В целом, проведенными электронно-микроскопическими исследованиями процессов старения в колониях культур пяти видов аспергилллов показано, что массовое старение и отмирание клеток вегетативного мицелия имело место тогда, когда сформированные конидиогенные аппараты закончили рост и уже несли сформированные стеригмы. Далее эти процессы распространялись на конидиеносец и головку, в которых цитозоль с продуктами распада клеточных органелл и запасных веществ можно было наблюдать даже во время формирования конидий. Однако объем, занятый в конидиеносце и головке цитозолем и дегенерирующими компонентами клетки, постепенно сокращался, что могло быть показателем использования продуктов их распада в качестве источников дополнительных питательных веществ, необходимых для нормального прохождения конидиогенеза. Несмотря на то, что процессы старения в стеригмах начинались позже, чем в конидиеносце и головке, они полностью лизировали намного раньше, тогда как оставшиеся от отмерших конидиеносцев и головок клеточные стенки довольно долго сохраняли присущую им в ингактном состоянии форму (Рис. 3 с).
Таким образом, общий ход старения клеток в культурах изученных видов аспергиллов проходил в следующем направлении: вегетативный мицелий-жонидиеносец и головка->стеригмы первого ряда->стеригмы второго ряда-*конидии.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЫІАЯ МИКОЛОГ ИЯ
ВЫВОДЫ
1. Ультраструктурные изменения стареющих клеток вегетативного мицелия и различных типов клеток конидиогенного аппарата у изученных in vitro видов аспергиллов протекали довольно сходно: они сильно вакуолизировались, обеднялись органелла-ми, запасными веществами, свободными рибосомами и цитозолем. Из компонентов цитоплазмы первыми дегенеративным изменениям в одних клетках (независимо от их типа) подвергались митохондрии, тогда как в других - ядра, а в третьих - одновременно и те и другие.
2. В пределах колоний культур изученных видов аспергиллов процессы старения первоначально отмечались в клетках вегетативного мицелия, а затем в конидиеносце и головке, стеригмах первого и второго ряда (A. niger, A.flavus, A. terreus, A. sydowii).
3. В латеральных клеточных стенках стареющих клеток вегетативного мицелия и кони-диогенных аппаратов происходило снижение контраста и плотности расположения составляющих их микрофибрилл; они сильно утоньшались и деформировались; из их состава {А. fumigatus, А. Іеггенч, А. }Іауш) исчезал фибриллярно-гранулярный слой и появлялись локальные разрывы.
4. По мере перехода клеток вегетативного мицелия и конидиогенного аппарата к старению, исчезали тельца Воронина из состава порового аппарата, их сменяли темные гомогенные пробки, локализующиеся непосредственно в просвете септальной поры.
6. Общийход старения клеток культур у изученных видов аспергиллов проходил по соответствующему градиенту: вегетативный мицелий-жонидиеносец и головка->стеригмы первого ряда->стеригмы второго ряда-жонидии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Васильева Н.В., Степанова А.А., Синицкая ИЛ. Особенности морфогенеза клеток Cryptocoecus neoformans в зависимости от вирулентности штаммов // Ж. Проблемы мед. микологии. - 2007. - Т. 9, №4. - С, 23-30.
2. Степанова А. А.,. Синицкая ИЛ. Ультраструктура клеток of Aspergillus niger van Tieghem. Вегетативный мицелий И Ж. Проблемы мед. микологии. - 2003. -Т. Й, №4. - С. 32-39.
Поступила в редакцию журнала 19.11.2009 Рецензент: Коваленко А. Е.
Рис. 1. Схема, иллюстрирующая направленность процессов старения в клетках вегетативного мицелия
и конидиофорах изученных видов аспергиллов.
1 - зона маргинального роста;
2 - зона дифференциации воздушного и субстратного мицелия;
3 - зона формирования конидиофоров и конидиогенеза;
4 - зона отмерших клеток. Белым цветом отмечены интактные клетки, серым - стареющие, черным - отмершие
Условные обозначения (здесь и на рис, 2,3):
В - вакуоль; ВЧ - вирусоподобная частица; Г - головка; Гл - гликоген; К - конидиеносец; Кн - конидии;
КС - клеточная стенка; КХ - конденсированный хроматин; ЛВ - липидное включение; М - митохондрия;
ОК- отмершие клетки; ОЯ - оболочка ядра; П - пробка; ПГ - полифосфатная гранула; Пз - пузырек; Пл - плазмалемма; ПТВ - полярное тельце веретена; С - септа; Ст1 - стеригмы первого ряда; Ст2 - стеригмы второго ряда;
СК - стареющие клетки; Ст - стеригма; Т - тонопласт; ТГ -темная глобула; ТВ - тельце Воронина;
ФТ - фиброзиновое тельце; ФБ - фибриллярный белок; ФГС - фибриллярно-гранулярный слой;
Я - ядро; Яд - ядрышко
Рис. 2.Ультраструктура стареющих клеток вегетативного мицелия А. їепеи$ (а, и, к), А. ШШдаЩ (б, д, е, ж, з), А. підег(в, г), Л. $усІо\уіі (л, м, н, п) и А. І1Ша$ (о, р-т).
Ув.: а - д, и, к, м, - х 20000; е, ж, з, л - х 25000; н - т - х 30000.
Рис. 3. Ультраструктура стареющих клеток конидиогенных аппарата А. Итт (а), А. кппідаШв (б, г; д-ж, и, к-р) и А. $усІо\¥ІІ (в, з). Ув.: а-г - х 25000; д - х 1 5000; е - х 20000; ж, з, и - х 30000; к-о, р, с - х 10000; п - х 35000. Стрелкой (е) показан разрыв в клеточной стенке.
