CC BY
8УДК [616.153.96-092:612.017.1]-057:66 В.А.Айвазян1, Д.С.Хлгатян1, Э.А.Аракелова1, Л.А.Манукян1, Г.В.Цаканова1, Р.В.Бадалян2
УГНЕТЕНИЕ АКТИВНОСТИ КОМПЛЕМЕНТА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ РАБОТНИКОВ, ЗАНЯТЫХ В ПРОИЗВОДСТВЕ ХЛОРОПРЕНОВОГО КАУЧУКА
Институт молекулярной биологии НАНРА 2Медсанчасть ЗАО «Завод Наирит», Ереван, Республика Армения
Исследованы параметры иммунного статуса у работников, занятых в производстве хлоропренового каучука и работающих в районах, отдаленных от промышленной части города. Определение активности комплемента по классическому, альтернативному и лектиновому пути активации проводили методом иммуноферментного анализа. Результаты исследований показали угнетение классического пути активации у работников, занятых в производстве хлорпренового каучука.
Ключевые слова: комплемент, хлоропреновый каучук.
Введение. В Армении действуют многочисленные предприятия, использующие высокотемпературные технологии по производству различных химических продуктов, в том числе хлора, хлоропрена, полихлоропреновых и других химических соединений. Технологические особенности производства вышеназванных продуктов, а также бесконтрольное сжигание промышленных и бытовых отходов могут способствовать образованию диоксинов и их поступлению в объекты окружающей среды. Расчетная величина эмиссий диоксинов в республике в год составляет 28,33 г/ТЭ (токсический эквивалент), из которых на долю завода «Наирит», производителя хлоропренового каучука и латекса, приходится 4,5—5 г/ТЭ. На его территории действует ряд производств по выпуску свободного хлора, а также карбида, ацетилена, получаемого из последнего (впоследствии из природного газа), хлорирование моновинилацетилена и бутадиена, с получением 3,4-дихлорбутана-1, с последующим дегидрохлорированием и получением хлоропрена. Продукты хлорирования после перегонки использовались для получения ацетата дихлорфеноксиуксусной кислоты, который применялся как гербицид [1].
Одной из наиболее чувствительной к действию указанных факторов является иммунная система. Согласно данным литературы, ксенобиотики, с одной стороны, могут вступать во взаимодействие с макромолекулами организма и изменять их антигенные свойства, а с другой — существенно изменять процессы активации лимфоцитов, повышать или понижать синтез антител, продукцию цитокинов, комплементарный фактор. Эти изменения зависят от концентрации, продолжительности действия и вирулентности ксенобиотика [2-25].
Поэтому особое значение приобретают экологические причины развития иммунопатологии, а вопросы обеспечения безопасных для здоровья условий труда рабочих, занятых в производстве, и снижение риска профессиональных болезней продолжают оставаться актуальным.
Одной из главных звеньев иммунного ответа организма является система комплемента, которая участвует в ряде нормальных физиологических и патологических реакций. Система комплемента — это совокупность белков сыворотки крови, циркулирующих в неактивном состоянии. Более 20 белков и белковых фрагментов входят в состав системы комплемента, включая белки плазмы крови и клеточной мембраны. Центральный компонент этого протеолити-ческого каскада — С3. Его активация путем расщепления представляет собой главную реакцию всей цепи активации комплемента. С3 может быть активирован тремя основными путями — классическим, альтернативным и лектиновым.
Классический путь запускается активацией комплекса С1 (СЦ, С1г и С18). Комплекс С1 соединяется (через СЦ) с антителами (LgM и LgG), связанными с антигенами, и возникает каскадная реакция. Ранние компоненты (С1, С4, С2) формируют С3-конвертазу (С4Ь2а), которая расщепляет С3 [26].
Альтернативный путь отличается от классического только механизмом активации и ранними реакциями. Расщепление С3 в альтернативном пути не требует взаимодействия антигена с антителами или наличия ранних С1, С4, С2 факторов комплемента. Альтернативный путь запускается гидролизом С3 прямо на поверхности патогена (бактериальные полисахариды и липо-полисахариды, вирусные частицы, опухолевые клетки). С3-конвертаза (СЗЬВЬ) формируется
Таблица 1
Cредний возраст, пол и стаж работы у работников каучукового цеха и контрольной группы
Показатель Контрольная группа Работники каучукового цеха
Средний возраст, годы (М+с); п (женщины/мужчины) 31±10,4 (14/7) 54,7+9,6 (17/14)
Стаж работы на заводе «Наирит», годы (М+с) - 17,8±1З,7
взаимодействием С3 с факторами сыворотки (В и Б) [26].
Маннан (маннан — полимер маннозы) — связанный лектиновый путь гомологичен классическому пути активации системы комплемента, но запускается независимо от антител. Лектиновый путь активирует комплемент при помощи ман-нан-связывающего лектина (МВЦ). MBL (подобный СЦ) — формирует комплекс с МЛ8Р-белками (МЛ8Р-1 и МЛ8Р-2). Когда MBL связывается с поверхностью патогенов (маннозные остатки и другие сахара на мембране болезнетворных микроорганизмов), МЛ8Р- белки (схожи с С1г и с1б) активируются и расщепляют белки С4, С2, которые затем формируют СЗ-кон-вертазу (С4Ь2а). Во всех трех путях СЗ-конвер-таза гидролизует СЗ (СЗа и СЗЬ). Далее, присоединяя дополнительно молекулу С3Ь (опсонин), СЗ-конвертаза превращается в конвертазу С5, которая запускает реакцию формирования мем-браноатакующего комплекса (С5-С9) [27].
При активации комплемента генерируются биологически активные фрагменты белков С2Ь, СЗЬ, СЗа, С4а и С5а-анафилатоксины и С5Ь-С9, которые опосредуют воспалительные реакции, включающие лейкоцитарный хемотаксис (С2Ь,С4а, С5а), активацию макрофагов, нейтро-филов и тромбоцитов, тучных и эндотелиальных клеток (СЗЬ), повышение сосудистой проницаемости (СЗа, С5а приводят к высвобождению ги-стамина из тучных клеток), цитолиз и тканевое повреждение (С5-С9) [26].
Перечисленные выше процессы контролируются специальными белками — ингибиторами острой фазы. Они включают С1-ингибитор (инактиватор С1), факторы I и Н (СЗЬ инакти-ваторы), DAF и СЯ1 (инактиваторы СЗ-конвер-
тазы), СБ59 (ингибитор С9). DAF ускоряет распад СЗ-конвертазы альтернативного пути. СЯ1 (рецептор СЗЬ) расположен главным образом на поверхности эритроцитов и отвечает за удаление из плазмы крови опсонизированных иммунных комплексов (классический путь) [26].
Проявлениями нарушения состояния комплемента являются частые инфекционные заболевания, системные бактериальные инфекции, а также развитие аутоиммунных процессов, что является наиболее вероятным при длительном, хроническом действии токсикантов на организм [28,29]. И в этом аспекте важна оценка возможных маркеров деструкции, что позволило бы при определении характера течения острофазового ответа решать вопросы: постановки диагноза заболевания, прогнозирования его течения и выбора метода лечения.
Учитывая вышесказанное, нами были исследованы параметры иммунного статуса у работников завода «Наирит».
Материалы и методы исследования. В сыворотке крови у 31 работника завода «Наирит» (каучуковый цех) была определена функциональная активность компонента комплемента СЗ по классическому, альтернативному и лекти-новому путях активации.
В исследование были вовлечены рабочие, не имеющие диагностированных сопутствующих заболеваний и давшие свое информированное согласие. Контролем служила сыворотка крови здоровых доноров, живущих и работающих в районах, отдаленных от промышленной части города. Исследование одобрено Комитетом по биоэтике Института молекулярной биологии. В табл. 1 представлен средний возраст, пол и стаж работающих на заводе.
Таблица 2
Интерквартильный размах значений активности комплемента у работников каучукового цеха и
контрольной группы, нг/мл
АктивностьС3 по классическому пути Активность С3 по альтернативному пути Активность С3 по лектиново-му пути
контрольная группа работники каучукового цеха контрольная группа работники каучукового цеха контрольная группа работники каучукового цеха
Число исследованных лиц 19 31 19 31 19 31
Квартили, нг/мл 25% 1300,1 815,85 1241,0 1171,75 1525,0 1565,0
50% (Me) 1463,8 1000,95 1442,0 1288,5 1620,0 1679,0
75% 1731,4 1078,1 1787,7 1581,25 1800,0 1781,5
При очередном профосмотре у рабочих утром натощак забирали кровь из локтевой вены, собирали в специальные центрифужные пробирки, давали ей свернуться при 4°С в течение 1 ч и центрифугировали 20 мин при 3000 об/мин. Полученную сыворотку хранили при <^30°С не более 1 месяца.
Определение активности проводили методом иммуноферментного анализа [30]. В качестве первичных антител к компоненту комплемента С3 были использованы поликлональные кроличьи антитела. Вторичными антителами являлись козьи антитела, коньюгированные щелочной фосфатазой. Активность выражалась количеством распавшегося С3 (нг/мл) в течение часовой инкубации. Все измерения и расчеты проводили на автоматическом планшетном фотометре.
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Graphpad Prism — расчет медианы, квартилей, тест Манна и Уитни, корреляционный анализ по Спирмену.
Результаты и обсуждение. Полученные данные представлены в виде медиан и интерквар-тильного размаха — Me (25 и 75%) (табл. 2). Результаты исследований показали статистически значимые различия активации комплемента по классическому пути у работников каучукового цеха по сравнению с контрольной группой. Статистически значимых различий в активации комплемента по альтернативному и лектиново-му пути в данных группах не наблюдалось. На рис. 1 и 2 дана характеристика дисперсий выше-отмеченных показателей в двух группах. Кроме
Рис. 1. Диапазон распределения значений активности С3 по классическому пути активации комплемента у работников каучукового цеха и контрольной группы
Ме - медиана, высота «коробки» - диапазон данных между 25 и 75% квартилями. р < 0,0001
□ - контроль
□ - рабочие каучукового цеха
того, у работников каучукового цеха практически не наблюдалось корреляции между активностью комплемента и такими факторами как стаж работы (г = 0,033, р = 0,86), возраст (г = <0,096, р = 0,61).
Химические реакции, лежащие в основе образования полимеров, могут идти по типу полимеризации или поликонденсации. Характер неблагоприятного действия продуктов синтеза полимерных соединений на организм работающих определяется в первую очередь токсичностью используемых мономеров. Большинство из них очень реактивны и биологически агрессивны. Обладая сходными химическими свойствами, виниловые мономеры обнаруживают сходство и по своему биологическому действию. Обладая повышенной летучестью, они могут вызывать развитие как острых, так и хронических интоксикаций.
Таким образом, обобщая данные литературы и результаты наших исследований, можно заключить, что хроническая интоксикация виниловыми мономерами, в частности, хлоропре-ном, характеризуется значительным понижением активности компонента комплемента С3 по классическому пути в сыворотке крови рабочих по сравнению с контролем. Результаты альтернативного и лектинового пути активации комплемента свидетельствуют, что, вероятно, уровни компонентов комплемента С2 и С4 соответ-
Рис. 2. Диапазон распределения значений активности С3 по альтернативному и лектиновому пути активаии комплемента у работников каучукового цеха и контрольной группы
□ - контроль
□ - рабочие каучукового цеха
1; 2 - альтернативный путь активации С3 (р = 0,18); 3; 4 - лектиновый путь активации С3 (р = 0,87) Ме - медиана; высота «коробки» - диапазон данных между 25 и 75% квартилями
ствуют значениям нормы. Кроме того, мы предполагаем, что угнетение активности классического пути активации, возможно, является результатом пониженного уровня С1, связанного с действием хлоропрена. Пониженный уровень С1 может привести к преципитации циркулирующих иммунных комплексов в тканях и воспалению. Образование иммунных комплексов — один из компонентов нормального иммунного ответа. Иммунные комплексы образуются при каждой встрече антител с антигеном и разрушаются мононуклеарными фагоцитами после активации комплемента. При избытке антигена (при длительной инфекции или аутоиммунном заболевании), недостаточности комплемента антитела теряют способность нейтрализовать антигены, вместо этого они образуют иммунные комплексы, которые оседают в тканях (этому способствуют факторы, повышающие проницаемость кровеносных сосудов) и вызывают там воспалительные реакции, чреватые повреждением тканей, например, системные заболевания, гломерулонефрит, васкулит и др. [31].
Заключение. Наблюдается значительное понижение активности комплемента по классическому пути активации в сыворотке крови работников каучукового цеха по сравнению с контрольной группой, связанное с хронической интоксикацией хлоропреном. Угнетение классического пути не влияет на активность С3 комплемента по альтернативному и лекти-новому пути активации, что, вероятно, свидетельствует о нормальных уровнях компонентов комплемента С2 и С4 у работников завода. Практически отсутствует корреляция между активностью комплемента и факторами: стаж работы, возраст.
Список литературы
1. Международный проект по ликвидации СОЗ: Обзор ситуации с СОЗ в Республике Армения/НПО Центр экологических исследований; Координатор Тадевосян al. - 2000. - www.oecd. org/dataoecd/10/38/354486795.pdf
2. Арилова Т.У., Меджидов А.В., Алибекова М.Г. и др. //Иммунология, 1991. - № 2. - С. 67-68.
3. Сибиряк С.В., Красилова И.А., Рябчинская Л.А. и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология, 1992. - Т. 55. - № 4. - С. 46-49.
4. Tiefenbach B., Lange P. // Arch. Toxicol., 1980. - V. 45. - № 4. - P. 167-170.
5. Tiefenbach B., Hennighausen G., Lange P. // Zbl. Pharm., Pharmakother und Laboratoriumstiagn, 1983. - V122. - № 2. - P. 22.
6. Lin WQ, White KL Jr. // J. Toxicol. Environ. Health, 1993. - V. 39. - № 2. - P. 273-285.
7. Забродский П.Ф., Трошкин Н.М., Меркина С.М. и др. // Токсикологический вестник, 2004. -№ 6. - С. 14-17.
8. Cabassi E. // Veterinary Research Communications, 2007. - V. 31. - № 1. - P. 115-120.
9. Savvas C. Makridesa //Department of Cell Biology, PRAECIS Pharmaceuticals, Inc., Cambridge, Massachusetts, 1998. - V. 50. - № 1. - P. 59-88.
10. Makker S.P., Aikawa M. //A new model. Lab Invest., 1979. - № 41. - P. 45-49.
11. Ewers U., Stiller-Winkler R., Idel H. // Environ Res., 1982. - № 29. - P. 351.
12. Ayub S., Deb K., Sharma M. et al. // Current Science, 2001. - V 80. - № 12. - P. 1592-1595.
13. Merrick B., Bruno E, Jennifer H. et al. // J. Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2006. - № 318. - P. 792-802.
14. Markiewski M., Mastellos D., Tudoran R. et al.//J. Immunol., 2004. - № 173. - P. 747-754.
15. Matsushitaa M., Miyakawaa H., Tanakab A. et al. // Journal of Autoimmunity, 2001. - V. 17. - № 3. - P. 251-257.
16. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. - М.: Изд-во ВНИ-РО, 1995. - C. 219.
17. Общая токсикология / Под ред. Б.А.Курлянд-ского, В.А.Филова. - М.: Медицина, 2002. - C. 608.
18. Куценко С.А. Основы токсикологии. Научно-методическое издание. - СПб: ООО Изд. Фолиант, 2004. - C. 720.
19. Ayub S, Deb K., Sharma M. et al. // Department of Biochemistry. - 2001. - V. 80. - № 12. -P. 1592.
20. Shipley J.M., Waxman D.J. // Toxicol. Appl. Pharmacol., 2006. - V. 213. - № 2. - P. 87-97.
21. Mayeno A.N., Yang R.S., Reisfeld B. //Sci. Technol., 2005. - V. 39. - № 14. - P. 5363-5371.
22. Gober M.D., Gaspari A.A. //Curr Dir Autoimmun., 2008. - № 10. - P. 1-26.
23. Aly M.A., Schreder P. //Environ. Sci. Pollut. Res. Int., 2008. - V. 15. - № 2. - P. 143-149.
24. Aninat C., Andre F., Delaforge M. // Food Ad-dit. Contam., 2005. - V. 22. - № 4. - P. 361-368.
25. Wilson I.D., Nicholson J.K. // Xenobiotica, 2003. - V. 33. - № 9. - P. 887-901.
26. Unsworth D.J. //J. Clinical Pathology, 2008. -V. 61. - P. 1013-1017.
27. Worthley D.L., Bardy P.G., Mullighan C.G. // Intern. Med. J, 2005. - V. 35. - № 9. - P. 548-555.
28. Sjoholm A.G., Jonsson G., Braconier J.H. et al. //Mol. Immunol, 2006. - V. 43. - № 1-2. - P. 78-85.
29. Turner M.W. // Mol. Immunol., 2003. - V. 40. - № 7. - P. 423-429.
30. Doods AW., Sim R.B. Complement. A practical approach. Practical Approach series. - Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press Inc., 1997. - P. 274.
31. Wen L., Atkinson J.P., Giclas P.C. // J. Allergy Clin. Immunol., 2004. - V. 113. - № 4. - P. 585-593.
Переработанный экз. материалов поступил в
редакцию 15.10.08.
