CC BY
14Ye.A.Kuznetsova, V.Ye.Zhukov, T.I.Kolodiy EXPERIMENTAL SUBSTANTIATION OF VX EMERGENCY EXPOSURE LIMITS IN OCCUPATIONAL AIR
Research Institute of Hygiene, Toxicology and Occupational Pathology, Volgograd
To substantiate emergency exposure limits (EEL) of Vx, the following toxicological parameters of the substance were defined as follows: 50% lethal concentration, threshold of specific toxic effect, threshold of general toxic effect in experiments at exposure of 30min., 1, 2, and 4 h length. Concentration- time- effect dependence at Vx inhalation was found out. Data obtained were used to set Vx EELs in workplace air and for mathematical forecasting of EEL at exposure length within the interval of 20 min. to 5h.
УДК 612.128.014.46+613.632
Д.С.Хлгатян*1, Л.С.Нерсесова1, М.Г.Газарянц1, З.С.Мкртчян1, Г.О.Меликсетян1, Л.Г.Погосян1, С.Р.Костандян2, Ж.И.Акопян1
ВЛИЯНИЕ ХЛОРОПРЕНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ НА ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ РАБОЧИХ, ЗАНЯТЫХ В ПРОИЗВОДСТВЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО
КАУЧУКА
Институт молекулярной биологии НАН РА, Ереван 2Медсанчасть ЗАО «Завод Наирит», Ереван, Республика Армения
Условия труда рабочих, занятых в производстве хлоропренового каучука, характеризуются воздействием на организм комплекса химических соединений, ведущее место среди которых принадлежит хлоропрену и продуктам его взаимодействия с гидроксильными радикалами и озоном атмосферы. Показано статистически достоверное уменьшение, примерно в 2 раза, по сравнению с контролем активности креатинкиназы и пуриннуклеозидфосфо-рилазы сыворотки крови рабочих, занятых в синтезе хлоропрена. Изменение активности ферментов не зависит от пола, возраста и стажа работы.В активности сывороточных АЛТ и АСТ этих рабочих статистических достоверных изменений не обнаружено.
Ключевые слова: хлоропрен, хроническая интоксикация, креатинкиназа, пуриннуклеозидфосфорилаза, аланинами-нотрансфераза, аспартатаминотрансфераза.
Введение. Условия труда рабочих, занятых в производстве хлоропренового каучука, характеризуются воздействием на организм комплекса неблагоприятных факторов, преимущественно химических. Выбросы хлоропрена в окружающую среду могут иметь место в процессе его производства, транспортирования, хранения, а также в процессе получения из него полихлоропре-новых эластомеров. В атмосфере, в результате реакции хлоропрена с гидроксильными радикалами и озоном, образуются высоактивные органические вещества, многие из которых относятся к стойким органическим загрязнителям, оказывающим токсическое действие на организм [3, 10]. На организм рабочих хлоропрен действует через дыхательные пути и кожу. Согласно данным Агенства по охране окружающей среды США и Международного агенства по изучению рака (МАИР) хроническое действие хлоропрена на рабочих вызывает нарушение кардио-васкулярной системы и угнетение иммунной системы, дерматиты и выпадение волос [11, 17]. В
* фрагмент диссертационной работы
модельных опытах на крысах, длительно вдыхающих хлоропрен, были обнаружены изменения в печени, почках, щитовидной железе, легких и крови [16]. Исследования, проведенные в рамках Национальной Токсикологической Программы США, свидетельствуют о канцерогенной активности хлоропрена в отношении крыс и мышей [15]. С 2000 г., согласно классификации МАИР, хлоропрен включен в группу веществ 2В, вероятно канцерогенных для человека [11]. В связи с этим актуальными являются комплексные исследования, направленные на поиск маркеров риска нарушений здоровья, вызванных этим промышленным ксенобиотиком.
Известно, что большинство ксенобиотиков, попадая в организм человека, подвергаются биотрансформации с образованием реакцио-носпособных метаболитов, мишенями действия которых являются биомолекулы клетки и, в первую очередь, ферменты. Модификация ферментов ведет к нарушению клеточных механизмов, таких как: энергетический гомеостаз и гомео-стаз внутриклеточного кальция, процессы экс-
прессии генов, синтеза белка и клеточного деления, перекисное окисление липидов и проницаемость клеточных мембран и др., поэтому ферменты широко используются в качестве показателей токсического действия инсектицидов, лекарственных препаратов, экотоксикан-тов [5, 13]. Креатинкиназа (КК), ключевой фермент в поддержании энергетического гомеостаза в клетке, отличающаяся высокой чувствительностью к окислительному стрессу и органоспе-цифичностью, широко используется при диа-гностикие ряда заболеваний [7, 12], а также для обнаружения органотоксического действия различных соединений [5, 13]. Аланин- и аспарта-таминотрансферазы (АЛТ и АСТ) — общепринятые маркеры гепатотоксичности ксенобиотиков [5]. Пуриннуклеозидфосфорилаза (ПНФ), один из ведущих ферментов пуринового обмена, служит маркером заболеваний, связанных с имму-нодефицитными состояниями организма [9].
Целью настоящей работы было изучение влияния хлоропрена и его производных на активности КК, ПНФ, АЛТ и АСТ сыворотки крови рабочих, занятых в производстве синтетического каучука с тем, чтобы выявить показатели риска токсического действия хлоропрена.
Материалы и методы исследования. В скрининге активностей сывороточных КК, ПНФ, АЛТ и АСТ участвовало 125 рабочих завода «Наирит» (Ереван, Армения), производящего синтетический каучук и другие эластомеры (каучуковый цех) из хлоропрена, получаемого из метана, как исходного сырья (хлоропреновый цех). В табл. 1 дана демографическая характеристика обследуемых групп. В исследование были вовлечены рабочие, не имеющие диагностированных сопутствующих заболеваний и давшие свое информированное согласие. Контролем служила сыворотка крови здоровых доноров, живущих и работающих в районах, отдаленных от промышленной части города. Исследование одобрено Комитетом по биоэтике Института молекулярной биологии НАН РА.
При очередном профосмотре у рабочих утром натощак забирали кровь из локтевой вены, собирали в специальные центрифужные пробирки, давали ей свернуться при комнатной температуре и центрифугировали при 3000 об/мин в
течение 20 мин не позже 1 ч после забора крови. Определение активностей ферментов проводили в день забора крови. За редким исключением сыворотку крови хранили не более суток при +4°С.
Активность КК в сыворотке крови рабочих определяли по накоплению креатина согласно Эннору и Розенбергу с некоторыми модификациями [1], а активность ПНФ — гуанина [6] и выражали в МЕ/л (в мкмоль креатина и гуани-на/л-мин, соответственно). Активности АЛТ и АСТ определяли методами, основанными на регистрации кинетики окисления NADH в соответствующих сопряженных ферментативных реакциях, при 340 нм [4] и выражали в МЕ/л. Сравнительный анализ уровней активности сывороточной КК проведен с учетом половых различий, поскольку активность этого фермента в сыворотке крови здоровых мужчин значительно выше, чем в сыворотке крови женщин, что связано с их большей мышечной массой и физической нагрузкой [1, 12]. Согласно рекомендациям Научного комитета Международной Федерации клинической химии фактор пола учитывался также при определении активностей АЛТ и АСТ [3]. В доступной литературе отсутствуют данные о влиянии фактора пола на активность ПНФ.
Для статистической обработки данных использован пакет SPSS. Характер распределения полученных данных определен методом Колмогорова-Смирнова. Сравнительный анализ проведен с использованием непараметрического теста Мана-Уитни. Различия считались достоверными при р < 0,05. Корреляционный анализ проведен с использованием непараметрического теста Спирмена.
Результаты и обсуждение. В токсикологической практике КК, АЛТ, АСТ, щелочную фос-фатазу и некоторые другие цитоплазматические ферменты используют в качестве биомаркеров целостности клеток различных тканей, которые отличаются друг от друга по содержанию, а в ряде случаев, как например, в случае КК, по составу изоферментов. Утечка последних из поврежденных клеток в сыворотку крови позволяет определить органы-мишени действия токсиканта и дать сравнительную оценку повреждения различных органов [13]. С другой стороны, из-
Таблица 1
Демографическая характеристика обследуемых групп
Группа Контроль КЦ ХЦ
Средний возраст, годы; (диапазон) женщины 45±3; (25-50) n = 17 52±2; (38-66) n = 16 49±2; (22-61) n = 24
мужчины 43±2; (23-52) n = 21 52±2; (25-73) n = 53 49±2; (25-62) n = 31
Стаж работы на заводе «Наирит», годы женщины - 16±2 16±1
мужчины - 16±1 9±1
Таблица 2
Активность КК, ПНФ, АЛТ и АСТ (МЕ/л) в сыворотке крови здоровых доноров и рабочих каучукового и хлоропренового цехов (медиана/интерквартильный диапазон)
Фермент / группа Контроль КЦ ХЦ
КК женщины 19,7/9,9 25,4/19,4 9,1/28,01,2
мужчины 28,1/15,4 25,4/33,5 12,7/36,31,2
АЛТ женщины 18,6/7,5 24,6/30,4 19,0/8,8
мужчины 21,3/11,3 35,3/40,6 26,2/21,0
АСТ женщины 20,2/10,7 21,2/14,6 22,1/7,4
мужчины 17,3/8,5 29,4/15,2 24,9/7,3
ПНФ 2,7/2,9 3,0/4,6 1,6/2,412
Примечание: 1 — различия в сравнении с контролем достоверны; 2 — различия в сравнении с КЦ достоверны
менения активностей сывороточных ферментов могут быть обусловлены прямым действием ксенобиотиков как на экспрессию, так и на активность ферментов в органах-мишенях и в крови. Как показали наши исследования по изучению органотоксического действия другого промышленного токсиканта, укринола, используемого в производстве алюминевой фольги [2], и ряд других работ [5, 12], изменения активности ферментов и, в частности КК, в органах-мишенях и, соответственно, в сыворотке крови при хроническом отравлении носят бифазный характер и зависят не стольно от дозы токсиканта, сколько от времени воздействия. Начальное повышение активности КК в органах мишенях, связанное с кратковременной адаптацией к действию стрессорного фактора, сменяется понижением активности фермента относительно контрольного уровня, обусловленным утечкой фермента из поврежденных клеток и соответствующим повышением уровня его активности в сыворотке, сопровождающимся появлением в сыворотке органоспецифических изоферментов органов-мишеней. Затем, с течением времени, в органах-мишенях и, соответственно, в сыворотке крови наблюдается приближение уровня активности КК к контрольному уровню, по-видимому, уже на новом уровне адаптации [2, 12]. Можно предположить, что последнее связано с постсинтетической модификацией фермента или с синтезом новых генетических вариантов ферментного белка [7, 12].
В табл. 2 представлены средние значения активностей КК, ПНФ, АЛТ и АСТ для обследованных нами групп в виде медиана/интерквар-тильный диапазон в связи с непараметрическим характером распределения полученных данных в группах рабочих каучукового и хлоропрено-вого цехов. Значительный разброс полученных данных для этих групп связан, по-видимому, как с известной из литературы различной чувствительностью индивидуумов к ксенобиотикам, об-
условленной генетическими особенностями организма, так и с многокомпонентностью факторов воздействия [5, 12]. Соответствующий кор-
А 100
80
Л
О 60
X
s i 40
20
0
Б 140
120
100
О О 80
X
s 1 60
40
20
0
В 16
14
12
л 10
о
m 8
s
k 6
4
2
р < 0,01
Р < 0,01 -г ->■
Группа
р < 0,01
«_Р<0.01 >
Группа
р < 0,05
«_Р < °-05 »
Группа
Рис. Сравнительный анализ активностей КК /мкмоль креатинина/ (А - женщины, Б - мужчины) и ПНФ /гуанин/л мин/ (В) сыворотки крови рабочих каучукового и хлоропренового цехов
1 - контроль, 2 - каучуковый цех, 3 - хлоропреновый цех
реляционный анализ между активностью фермента и полом в каждой контрольной группе выявил статистически достоверную корреляцию только в случае КК (р < 0,01). Во всех контрольных группах отсутствовала статистически достоверная корреляция между активностями ферментов и возрастом (р > 0,05).
Корреляционный анализ с использованием непараметрического теста Спирмена во всех группах рабочих каучукового и хлоропреново-го цехов показал отсутствие корреляции между активностью ферментов и стажем, что обусловлено, по-видимому, тем, что все обследованные были подвержены длительному (от 2 лет и более) действию хлоропрена.
Ниже приведены результаты сравнительно -го анализа уровней активности изученных ферментов в представленных группах рабочих. Оказалось, что между уровнем активности сывороточной КК женщин каучукового цеха и соответствующими контрольными значениями (рис. А) статистически достоверных различий не обнаружено (р > 0,05); в то же время уровень активности сывороточной КК женщин хлоропреново-го цеха достоверно ниже контрольного уровня в 2,2 раза (р < 0,01). Аналогичные изменения отмечены для сывороточной КК мужчин (рис. Б): при отсутствии достоверных различий (р > 0,05) между уровнем активности КК сыворотки крови мужчин каучукового цеха и соответствующим контролем, уровень активности сывороточной КК мужчин хлоропренового цеха достоверно ниже контрольного уровня в 2,2 раза (р < 0,01). В связи с этим следует отметить два факта: 1) в отличие от хлоропренового цеха, где хлоропрен получают по устаревшей технологии из природного газа, используя устаревшее оборудование, каучуковый цех завода «Наирит» снабжен новым оборудованием, обеспечивающим применение новых технологий и соблюдение всех необходимых мер безопасности; 2) в соответствии с техникой безопасности эти два цеха находятся на значительном расстоянии друг от друга. Перечисленные данные свидетельствуют о том, что ведущим фактором, индуцирующим изменения активности КК, является хлоропрен, подверженность действию которого рабочих хлоро-пренового цеха больше, чем рабочих каучукового. При этом следует отметить, что величина изменений сывороточной КК активности не зависит от пола.
В случае с ПНФ наблюдаются те же тенденции изменений ферментативной активности (рис. В). Различия между уровнями активности сывороточной ПНФ рабочих каучукового цеха и контрольной группы были статистически недостоверны (р > 0,05). Активность ПНФ в сыво-
ротке крови рабочих хлоропренового цеха была достоверно понижена в 1,7 раз по сравнению с контрольными значениями (р < 0,01), что свидетельствует о развитии иммунного дефицита у этих рабочих.
Сравнение уровней активности КК и ПНФ рабочих хлоропренового цеха с таковыми рабочих каучукового цеха выявило достоверное уменьшение (р < 0,01) первых по отношению к последним соответственно в 2,8 раз для КК женщин, в 2 раза для КК мужчин и в 1,9 раз для ПНФ (рис.), что, по-видимому, связано, как указывалось выше, с большим контактом рабочих с хлоропреном в хлоропреновом цехе, чем в каучуковом.
Сравнение уровней активности АЛТ и АСТ сыворотки крови рабочих указанных выше групп (табл. 2) между собой и каждой из них с соответствующими контрольными группами не выявило статистически достоверных различий ни в одном случае (р > 0,05), что, по-видимому, связано с развитием фазовых хронических компенсаторных реакций в печени этих рабочих, нивелирующих друг друга.
Согласно обзору ситуации со стойкими органическими загрязнителями (СОЗ) в Армении, составленному НПО «Центр экологических исследований» [3], и другим данным [8, 14] завод хлоропренового каучука «Наирит» является одним из основных источников выбросов СОЗ в окружающую среду Еревана. Мониторинг атмосферных загрязнителей на территории этого завода и на расстоянии 1 км вокруг него с использованием растительной тест системы, 02 клона традесканции, показал уменьшение мутагенного действия окружающего воздуха с удалением растения от завода [8]. Кластогенное действие химических соединений, производимых заводом «Наирит», на лабораторных животных показано в исследованиях А.К.Нерсесяна и соавторов [14].
Заключение. Обобщая полученные нами данные можно константировать, что хроническая интоксикация хлоропреном вызывает понижение, примерно в 2 раза, по сравнению с контролем и группой рабочих каучукового цеха уровней активности КК и ПНФ сыворотки крови рабочих, занятых в хлоропреновом цехе. Эти изменения свидетельствуют о нарушении энергетического гомеостаза клеток органов-мишеней и развитии иммунодефицита организма. В то же время, в активностях сывороточных АЛТ и АСТ этих рабочих статистически достоверных изменений не обнаружено. Перечисленные выше изменения активностей ферментов не зависят от пола, возраста и стажа работы. В крови рабочих каучукового цеха завода «Наирит», ре-
конструированного согласно современным требованиям техники безопасности и значительно удаленного от хлоропренового цеха, статистически достоверных изменений активностей исследованных ферментов не обнаружено. Низкий уровень активности КК сыворотки крови рабочих хлоропренового цеха, не позволил, к сожалению, хроматографически определить изменения изоферментного состава последней с целью определения органов-мишеней действия хлоро-прена. Развитие настоящей работы предполога-ет исследование механизма органотоксичекого действия хлоропрена на ферментные системы в модельных опытах на крысах.
Список литературы
1. Нерсесова Л. С. Определение активности и изоферментного спектра креатинкиназы в сыворотке крови. Методические рекомендации. — Ереван, 1987.
2. Нерсесова Л.С., Газарянц М.Г., Меликсе-тян Г.О. и др. ВВ-изофермент креатинкиназы — биохимический маркер хронической интоксикации, вызванной промышленным ядом укринол // Биолог. журнал Армении, 2005. — № 3. — С. 69.
3. Тадевосян А. Обзор ситуации с СОЗ в Республике Армения. 2000. www/oecd.org/dataoecd/10/ 38/354486795.pdf
4. Тиц Н. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. — М.: Из-во «Лабинформ», 1997.
5. Шабанов П.Д. Наркология: Практическое руководство для врачей. — М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003.
6. Ahmad S.J., Pritchard R.H. A map of four genes specifying enzymes involved in catabolism of nucleosides and deoxynucleosides in Esherichia coli // Mol. and Gen. Genet., 1969. — V. 104. — P. 351
7. Aksenov M., Aksenova M., Butterfield D.A. et al. Oxidative modification creatine kinase BB in Alzheimer's disease brain // J. of Neuroch., 2000. — V. 74. — P. 2520.
8. Arutyunyan R.M., Pogosyan V.S., Simonyan E.G. et al. In situ monitoring of the ambient air around
the chloroprene rubber industrial plant using the Tra-descantia-stamen-hair mutation assa // Mutation Res., 1999. — V. 426. — № 2. — P. 117.
9. Bzowska A., Kulikovska E., Shugar D. Purine nucleoside phosphorylase: properties, functions and clinical aspect // Pharmacol. & Therapeut, 2000. — V. 88. — P. 349.
10. HSDB. 2000. Hazardous Substances Data Base. National Library of Medicine. http://toxnet.nlm. nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?HSDB.
11. International Agency for Research on Cancer. Re-evaluation ofSome Organic Chemicals, Hydrazine, and Hydrogen Peroxid // IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Human, 1998. — V. 71.
12. Lyslova S.N., Stefanov V.E. Phosphagen kinases. — Boston: CRC Press 1991. — P. 191-209.
13. Mac-Gregor J.T. The future of regulatory toxicology: impact of the biotechnology revolution // Toxi-colog. Sci., 2003. — V. 75. — P. 236.
14. Nersesyan A.K., Arutyunyan R.M., Groger A. et al. Spreading of carcinogens and mutagens in the environment of Armenia and possible ways of cancer prevention // Archive of Oncology, 2000. — V. 9. — № 1. — P. 29.
15. NTP. 1998. Toxicology and Carcinogenesis Studies of Chloroprene (CAS no. 126-99—8) in F344/N Rats and B6C31FMice (Inhalation Studies). Technical Report Series № 467. NIH Publication No. 98—3957.Research Triangle Park, NC: National Toxicology Program. P. 371.
16. Sittig M. Handbook of Toxic and Hazardous Chemicals and Carcinogens. 2nd ed. Noyes Publications, Park Ridge, NJ. 1985.
17. U.S. Environmental Protection Agency. A Summary Overview of Health Effects Associated with Chloroprene. EPA/600/8-85/011F. Environmental Criteria and Environmental Assessment, Office of Research and Development, Cincinnati, OH. 1985.
Материал поступил в редакцию 11.07.08.
D.S.Khlgatyan1, L.S.Nersesova1, M.G.Gazaryants1, Z.S.Mkrtchyan1, G.O.Meliksetyan1, L.G.Pogosyan1,
S.R.Kostandyan2, Zh.I.Akopyan1
IMPACT OF CHLOROPRENE AND ITS DERIVATIVES ON FERMENTAL SYSTEMS IN WORKERS ENGAGED IN THE PRODUCTION OF SYNTHETIC RUBBER
'Institute of Molecular Biology, National Academy of Sciences, Republic of Armenia 2Medical Sanitary Room, Industrial Plant «NAIRIT», Erevan
Labor conditions of workers engaged in chloroprene rubber production are characterized by exposure to a complex of chemical compounds among which the leading part is played by chloroprene and products of its interaction with hydroxyl radicals and atmospheric ozone. It was shown with certainty that the activity of creatine kinase and purine nucleoside phosphorylase decreases 2-fold as compared to the control in blood serum of workers engaged in chloroprene synthesis. Changes in enzymes activity are not related to gender, age or length of service. Activity of serumal alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase(AST) did not revealed any changes in those workers.
