ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.152.342*1'134
Участие остатков E34, K35 и R38 N-домена в формировании функционально активной структуры Lon-протеазы Escherichia coli
А. Г. Андрианова1, А. М. Куджаев1, В. А. Абрикосова1, А. Е. Гущина2, И. В. Смирнов1, Т. В. Ротанова1*
1Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, 117997 Россия
2Macromolecular Crystallography Laboratory NCI-Frederick, P.O. Box B, Frederick, MD 21702, USA
*E-mail: tatyana.rotanova@ibch.ru Поступила в редакцию 09.09.2020 Принята к печати 21.10.2020 DOI: 10.32607/actanaturae.11197
РЕФЕРАТ АТР-зависимая Lon-протеаза Escherichia coli (.EcLon), относящаяся к суперсемейству ААА+-белков, является ключевым участником системы контроля качества клеточного протеома, в которой она отвечает за расщепление потенциально опасных для клетки мутантных, поврежденных и короткоживущих регуляторных белков. .EcLon функционирует как гомоолигомер, субъединица которого включает центральный характеристический ААА+-модуль, С-концевой протеазный домен, а также N-концевую некаталитическую область, образованную двумя доменами - собственно N-концевым и вставочным а-спирализованным. Анализ пространственной структуры N-домена позволил выявить остатки E34, K35 и R38 на поверхности молекулы фермента, предположительно вовлеченные в формирование стабильной, функционально активной EcLon-протеазы. Получен тройной мутант LonEKR, несущий замены остатков E34, K35 и R38 на аланин. Показано, что введение указанных замен влияет на конформационную стабильность и межцентровые алло-стерические взаимодействия в ферменте, обусловленные действием нуклеотидов, а также на формирование корректного сайта связывания белкового субстрата.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА контроль качества клеточного протеома, ААА+-белки, АТР-зависимый протеолиз, LonA-протеазы, N-домен.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ AMPPNP - аденозин-5'-(Р,у-имидо)трифосфат; DTDP - 4,4'-дитиодипиридин; Nu -нуклеотид; РерТВЕ - Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl; Suc - сукцинил; ОП - оптическое поглощение.
ВВЕДЕНИЕ
АТР-зависимые Lon-протеазы (MEROPS: клан SJ, семейство S16) - ключевые участники системы контроля качества клеточных белков, обеспечивающей сохранность протеома во всех царствах природы. Наряду с Lon и другими АТР-зависимыми протеа-зами система контроля качества (СКК) включает молекулярные шапероны, которые обеспечивают корректный фолдинг белков, отвечают за формирование белковых ансамблей и препятствуют накоплению агрегатов в клетке. В свою очередь АТР-зависимые протеазы и мультисубъединичные бифункциональные комплексы - протеасомы - деградируют поврежденные, мутантные, а также короткоживу-щие регуляторные белки, потенциально опасные для клетки [1-6].
Lon-протеазы - гомоолигомерные ферменты. Их субъединицы включают АТР-азный (ААА+) модуль, образованный нуклеотидсвязывающим (NB) и а-спирализованным (H) доменами, протеазный (P) домен, представляющий собой серин-лизиновую пеп-тидгидролазу, а также N-концевой или инсерцион-ный некаталитический экстрадомен (ED) (рис. 1) [7, 8].
Наличие ААА+-модуля в структуре Lon-протеаз, как и других протеаз СКК, определяет их принадлежность суперсемейству ААА+-белков (ATPases Associated with a variety of cellular Activities), широко распространенных в природе и участвующих в важнейших процессах, таких, как репликация ДНК, транскрипция, деление клеток, внутриклеточный транспорт, фолдинг, протеолиз и др. [9-12]. ААА+-протеазы - высокоселективные ферменты,
основными особенностями которых являются сопряжение протеолитической активности с гидролизом АТР и процессивный характер гидролиза белковых мишеней, в результате которого образуются исключительно низкомолекулярные продукты (5-15 аминокислотных остатков, а.о.) [13-15].
Из множества клеточных белков АТР-зависимые протеазы отбирают свои субстраты по наличию в них особых структурных элементов: экспонированных гидрофобных частей белковой молекулы либо меток, называемых дегронами. Дегроны представляют собой специфические аминокислотные последовательности, локализованные на конце или внутри полипептидной цепи субстрата [16-18]. Меткой для субстратов протеасом, функционирующих в клетках эукари-от, служит белок убиквитин [19, 20]. Процессивный механизм гидролиза субстратов ААА+-протеазами реализуется благодаря бочкообразной четвертичной структуре этих ферментов. Их цилиндрические оли-гомеры используют энергию АТР для связывания,
денатурации и транслокации белковых субстратов вдоль центральной поры, образованной уложенными друг на друга кольцами АТР-азных модулей и про-теазных доменов, к пептидазным центрам, скрытым внутри олигомера фермента [21-23].
На сегодняшний день в базе данных MEROPS из общего пула АТР-зависимых Lon-протеаз выделены три подсемейства: А, В и С (рис. 1А). Основой для разделения ферментов Lon на подсемейства служат различия в окружении каталитически активных остатков серина и лизина протеолитических центров, а также локализация экстрадоменов, определяющая архитектуру АТР-азного компонента [7, 8, 24]. В семействе Lon-протеаз идентифицировано два типа протеолити-ческих центров - тип РА, обнаруженный в Р-доменах ферментов самого крупного подсемейства LonA, объединяющего ферменты бактерий и эукариот [7, 8, 24, 25], и тип РВ, детектируемый в ферментах подсемейства LonB из архей [8, 26], а также малочисленного бактериального подсемейства LonC (рис. 1А) [27, 28].
Мотивы Уолкера: GPPGVGKT
-61 а.о-
Ч
Ф4DE
LonA
А
LonB
LonC
Экстрадомен (ED)
ААА+-модуль (A.)
>170 а.о.
GXPGVGKS Трансмембранный сегмент Ф4DE
I ^
GPXGXXKX
• 250 а.о.
Ф4ЕА
-43 а.о->|
KDGPS*AG КХК*ХФ
/
HI CC NB H P
ED-AA-PA
PA
I*-43 а.о.-
ФEGDS*AS ТХК*ФЕ
ч /
NB CI H P
Экстрадомен (ED +
AB(ED)-PB
U-43 а.о.
ФEGDS*AG
Л
►I
ХХК*ФЕ
«NB» H P Ab*(ED)-PB
h-ч Экстрадомен (ED)
«ААА+»-модуль (AB.)
E34K35R38
1 S ,—1-1 117 124 173
Ec-Lon
N HI CC
Экстрадомен (ED)
- "LE-H6
NB H P
ААА+-модуль (AA)
Рис. 1. Доменная организация Lon-протеаз из разных подсемейств (A) и границы доменов в субъединице Lon-протеазы E. coli (Б). А - S* и K* - каталитически активные остатки протеолитического центра, Ф - остаток гидрофобной аминокислоты, Х - остаток любой аминокислоты, РА и РВ - протеазные домены А-типа (розовый) и В-типа (фиолетовый), Аа, АВ и АВ* - ААА+-модули соответственно А-типа (голубой), В-типа и В*-типа «вырожденный» (синие), NB - нуклеотидсвязывающие домены, Н - а-спирализованные домены, ED - экстрадомены, представленные N-доменом (коричневый) и HI(CC) - вставочным а-спирализованным доменом (зеленый) с coiled-coil-участком (салатовый) у протеаз LonA, трансмембранным доменом (светло-голубой) у LonB и вставочным доменом (заштрихован) у LonC; а.о. - аминокислотный остаток; замены аминокислот в консервативных фрагментах выделены синим цветом. Б - субъединица LonA-протеазы E. coli с С-концевым 6His-тэгом; в N-домене заштрихован регион, включающий остатки E34, K35 и R38
P
B
Б
P
A
Экстрадомен LonA-протеаз представлен пролонгированной N-концевой областью, являющейся отличительной особенностью представителей этого подсемейства. Протеазы LonB и LonC содержат инсерционные экстрадомены, локализованные в их нуклеотидсвязывающих доменах между мотивами Уолкера А и В. Особенностью экстрадомена ферментов LonB является наличие включенного в него трансмембранного сегмента. Экстрадомен LonC-протеаз отличает большая протяженность по сравнению с экстрадоменом LonB и вырождение АТР-азной функции вследствие замены существенных остатков АТР-азного центра (рис. 1А). Тем не менее, LonC-протеазы также участвуют в системе контроля качества протеома, поскольку регуляция их протео-литической активности опосредована сохранившейся способностью к связыванию нуклеотидов [27].
Наиболее изучены представители подсемейства LonA. Их N-концевая область имеет двухдоменную организацию [21, 29]. У LonA-протеазы Escherichia coli (EcLon) она включает 325 а.о. и сформирована «истинным» N-концевым (M1-Y117) и вставочным а-спирализованным (а-helical inserted, HI(CC), (E124-P302)) доменами (рис. 1Б) [29, 30]. Первый имеет структуру скрученного Р-листа и топологически сходен с РНК-связывающими PUA-доменами [31, 32]. Второй, сформированный восемью а-спиралями, включает участок последовательности со специфической coiled-coil (СС) конформацией и проявляет выраженное сходство с Н-доменом собственного ААА+-модуля, а также с а-спирализованным доменом первого ААА+-модуля шаперонов-дезагрегаз ClpB/Hsp104, содержащим инсерционный М-домен с СС-конформацией [30, 31, 33].
К настоящему времени накоплен значительный объем сведений о роли ААА+-модуля и протеаз-ного домена в функционировании LonA-протеаз. Однако функции N-концевой области LonA-протеаз охарактеризованы еще не в полной мере. Согласно опубликованным данным, эта область молекулы участвует в распознавании и связывании белков-субстратов [34-37]. Недавно было показано участие N-концевой области в образовании додекамерных структур из гексамеров LonA-протеазы E. coli [38, 39]. Кроме того, выявлено различие функций, выполняемых N- и Н1(СС)-доменами в полноразмерной EcLon-протеазе [40-45], что служит подтверждением двухдоменной организации N-концевой области фермента. Совокупность результатов различных исследований указывает на важнейшую роль N-концевой области LonA-протеаз в поддержании их функционально активной конформации. При этом остается неясным, какие именно фрагменты N-домена важны
для структурной организации и принимают участие в стабилизации ферментов.
Цель настоящей работы состояла в выявлении остатков N-концевого домена, способных участвовать в формировании стабильной, функционально активной структуры EcLon-протеазы (далее - Lon-протеаза), проведении сайт-направленного мутагенеза этих остатков с получением мутантной формы фермента и последующем исследовании ее структурных и ферментативных характеристик в сравнении c соответствующими характеристиками интакт-ной EcLon.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы
В работе использовали коммерческие реактивы фирм Sigma, Bio-Rad, Thermo Scientific (США), Fluka, Bachem (Швейцария), Boehringer Mannheim (Германия), Pharmacia (Швеция), Difco (Англия), Panreac (Испания) и «Реахим» (Россия).
Получение рекомбинантной EcLon-протеазы (Ec-Lon) и ее мутантной формы LonEKR
Рекомбинантную форму EcLon-протеазы, содержащую гексагистидиновый фрагмент в составе окта-пептида LEHHHHHH на С-конце белка (Ec-Lon), получали по ранее описанной методике [40].
Тройной мутант LonEKR получали с помощью мегапраймерного подхода на основе нуклеотидной последовательности Ec-Lon-протеазы с использованием следующих праймеров: Lon_E34K35R38/AAA, T7 promoter и f9 (5'-CCATCGCCGCTTCCAGACA-AGCGATAGATGCTGCCCGCCCGACAAATAAG-GGG-3', 5'-TTAATACGACTCACTATAGGGGA-3' и 5'-CGTTTACACCCGGCTCATCC-3' соответственно). Амплификацию фрагмента гена проводили в два этапа, используя в качестве матрицы плазмидную ДНК pET28-Ec-lon. На первом этапе с помощью праймеров Lon_E34K35R38/AAA и Т7 promoter получили ПЦР-фрагмент, который использовали в качестве праймера на втором этапе совместно с прай-мером f9. Полученный фрагмент ДНК длиной около 250 п.н. клонировали в вектор pET28-Ec-lon по уникальным сайтам рестрикции XbaI и HindIII.
Секвенирование клонированных ДНК и синтез праймеров осуществлены компанией «ЕВРОГЕН» (www.evrogen.ru). Процедуры рестрикции и лигиро-вания проводили согласно протоколам производителей соответствующих ферментов.
Клетки E. coli штамма BL21(DE3), несущие плаз-миду pET28-lonEKR, культивировали в среде LB с канамицином при 37°С и интенсивном перемешивании до достижения ОП600 0.5 о.е., после чего темпера-
туру клеточной культуры понижали до 25°С и проводили индукцию при 0.1/1 мМ IPTG в течение 3 ч.
Выделение и очистку Ес-Lon и LonEKR проводили с использованием №2+-хелатной аффинной хроматографии (колонка HisTrap FF, 5 мл, GE Healthcare, США) и анионообменной хроматографии (колонка HiTrap™ Q FF, 5 мл, GE Healthcare) согласно ранее описанной методике [40], а также последующей двухстадийной гель-фильтрацией на HiPrepTM 16/60 Sephacryl S-300 HR (120 мл, GE Healthcare), буферы: 50 мМ имидазол, рН 7.5; 0.5 М NaCl (стадия 1) и 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5; 0.5 М NaCl (стадия 2).
Концентрации белков определяли по методу Брэдфорд [46].
Гомогенность белков в препаратах тестировали электрофоретически [47] с использованием коммерческого набора маркеров (кДа): Р-галактозидаза (116.0), бычий сывороточный альбумин (66.2), оваль-бумин (45.0), лактатдегидрогеназа (35.0), рестриктаза Bsp98I (25.0), Р-лактальбумин (18.4) и лизоцим (14.4).
Определение энзиматических свойств Ес-Lon и ее тройного мутанта LonEKR
АТР-азную активность тестировали по накоплению во времени неорганического фосфата в реакции гидролиза АТР в 50 мМ Трис^С^буфере, pH 8.1, содержащем 200 мМ NaCl, 2.5 мМ ATP, 2.5 или 20 мМ MgCl2 и 0.1-1.0 мкМ фермент в отсутствие и при наличии Р-казеина (1 мг/мл), при 37оС [48]. В контрольном опыте фермент заменяли буфером. Начальные скорости реакций определяли по величине ОП смеси из 200 мкл реакционной среды и 600 мкл реагента (100 мМ Zn(AcO)2, 15 мМ (NH4)6Mo7O24, 1% SDS, pH 4.5-5.0) при длине волны 350 нм (е350 = 7 3 6 0 М-1 см-1).
Тиоэстеразная активность. За гидролизом тио-бензилового эфира N-защищенного трипептида Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl (PepTBE) следили спектро-фотометрически при длине волны 324 нм по величине ОП 4-тиопиридона (е324 = 16 5 0 0 М-1 см-1), образующегося в результате взаимодействия продукта гидролиза (бензилтиолата, BzlS-) c 4,4'-дитиодипи-ридином (DTDP) [49]. Гидролиз РерТВЕ проводили при 37оС в 50 мМ Трис^^-буфере, рН 8.1, содержащем 200 мМ NaCl, 10% DMSO, 0.2 мМ DTDP, 0.1 мМ PepTBE и 0.1-1.0 мкМ фермент. При изучении влияния эффекторов в смесь добавляли нуклеотид до 2.5 мМ и MgCl2 до 20 мМ.
Протеолитическую активность ферментов тестировали электрофоретически [47]. Реакцию проводили при температуре 37оС в 50 мМ Tрис-HCl-буфере,
pH 8.1, содержащем 200 мМ NaCl, 20 мкМ Р-казеин и 1 мкМ фермент, в отсутствие или при наличии 5 мМ Nu и 20 мМ MgCl2. В контрольном эксперименте фермент заменяли буфером. Аликвоту реакционной или контрольной смеси смешивали с лизирующим буфером (0.2 M Tрис-HCl, pH 8.9, 4% SDS, 20% глицерин, 0.5 hM EDTA, 0.8% бромфеноловый синий, 3% Р-меркаптоэтанол) в соотношении 3:1, кипятили в течение 5 мин, наносили на 12% ПААГ для электрофореза.
Автолитическую активность ферментов тестировали электрофоретически [47] в условиях, аналогичных условиям определения протеолитической активности, но в отсутствие Р-казеина.
Ограниченный протеолиз химотрипсином Ec-Lon-протеазы и ее тройного мутанта LonEKR проводили при температуре 30оС в 50 мМ Tрис-HCl-буфере, pH 8.1, содержащем 300 мМ NaCl, 11 мкМ фермент и 0.2 мкМ химотрипсин, в отсутствие и при наличии эффекторов EcLon-протеазы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Идентификация остатков N-домена EcLon-протеазы, предположительно участвующих в формировании функционально активного фермента
Ранее нами было показано, что ключевая роль в корректном связывании белкового субстрата EcLon-протеазой, эффективном функционировании ее АТР-азного и пептидазного центров, реализации межцентровых аллостерических взаимодействий и процессивного механизма протеолиза принадлежит инсерционному Ш^^-домену [40-45]. При этом для взаимодействия с белковым субстратом и его гидролиза критически важными оказались фланкирующие СС-участок фрагменты (E124-H172) и (M281-N302) [41-43].
Нами установлено [44], что N-концевой домен обеспечивает конформационную стабильность EcLon-протеазы в условиях сопряжения протеоли-за с гидролизом АТР, поскольку укороченная форма фермента (G107-K784), полученная в результате удаления фрагмента (M1-N106), подвергается интенсивному автолизу, несмотря на сохранение способности к процессивному протеолизу. Наряду с этим показано [34], что остатки R33, E34 и K35 N-концевого домена принимают участие в специфическом связывании субстратов EcLon, содержащих так называемый su^-дегрон (фрагмент ингибитора клеточного деления SulA), что, в свою очередь, влияет на активность АТР-азного и протеолитического центров.
В то же время результаты рентгеноструктурного анализа N-концевой области LonA-протеазы E. coli [31] позволяют предположить, что регион, включающий остатки R33, E34, K35, а также R38, может иметь важное значение для реализации междоменных и/ или межсубъединичных взаимодействий в ферменте. Этот регион локализован на поверхности N-домена EcLon-протеазы (рис. 2), и, таким образом, указанные остатки могут быть непосредственно вовлечены как во взаимодействия с субстратом, так и во взаимодействия между протомерами внутри олигомеров EcLon. Предположение об участии рассматриваемого региона в формировании активной структуры и функционировании EcLon можно проверить путем изучения свойств мутантной формы фермента, несущей замены потенциально значимых остатков.
Однако, как следует из рис. 2, остаток R33 образует ионную пару с остатком Е62, расположенным на конце длинной поверхностной петли из 18 остатков. Такое взаимодействие ограничивает подвижность этой петли и тем самым поддерживает ее конформацию. Предполагаемая мутация остатка R33 может привести к нарушению топологии исследуемой области. По этой причине в настоящей работе исследована мутантная форма EcLon-протеазы (LonEKR), в которой заменам на аланин были подвергнуты только три остатка, а именно, E34, K35 и R38.
Получение LonEKR - тройного мутанта Lon-протеазы E. coli
Мутантную форму LonEKR, содержащую замены E34A, K35A и R38A, получали на основе рекомби-нантной формы EcLon, содержащей гексагисти-диновый фрагмент на С-конце белка (Ес-Lon) [40]. Интактный фермент и его тройной мутант выделяли согласно схеме, включающей аффинную хроматографию на Ni-сефарозе, ионообменную хроматографию на Q-сефарозе и гель-фильтрацию на сефакри-ле S-300. Для интактного и мутантного ферментов определяли АТР-азную, пептидазную, протеоли-тическую и автолитическую активность. При изучении гидролиза АТР оценивали влияние избытка ионов магния и присутствия белкового субстрата. Пептидазную (субстрат - Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl, PepTBE), протеолитическую (модельный белковый субстрат - ß-казеин) и автолитическую активность тестировали в отсутствие и в присутствии эффекторов Lon-протеазы - нуклеотидов и ионов магния.
АТР-азная активность мутантной формы LonEKR
Ранее было показано, что интактная Ес-Lon-протеаза демонстрирует максимальный уровень АТР-азной активности в реакционной среде с рН 8.0-8.2 и при эквимолярных концентрациях АТР
Рис. 2. Поверхность ^домена Е^оп-протеазы (остатки 7-118). Красным цветом показаны элементы вторичной структуры, голубым - боковые цепи поверхностных остатков, желтым пунктиром обозначено ионное взаимодействие между остатками R33 и Е62
и ионов магния, равных 2.5 мМ. При повышенной концентрации ионов Mg2+, характерной для физиологических условий (20 мМ), наблюдается понижение АТР-азной активности. Присутствие белкового субстрата способно восстанавливать скорость гидролиза АТР до значений, соответствующих оптимальным условиям ее проявления [40, 43].
Тройной мутант Ес^оп-протеазы по эффективности гидролиза АТР близок к интактному ферменту, при этом сохраняются особенности его функционирования, в том числе ингибирование избытком ионов магния и последующая активация АТР-азных центров Р-казеином (далее - казеин). Однако активация центров мутантной формы в ответ на взаимодействие с казеином происходит с меньшей эффективностью, чем у интактной Ес^оп-протеазы (рис. 3), что может быть обусловлено ослаблением связывания белковой мишени вследствие введения мутаций по остаткам Е34, К35 и R38.
В отдельном эксперименте показано влияние условий культивирования штамма-продуцента, в частности условий индукции, на эффективность функционирования АТР-азных центров выделенной формы фермента LonEKR. При работе с Ес^оп-протеазой и ее модифицированными формами в качестве оптимальных были приняты условия, понижающие влияние краудинг-эффекта в процессе экспрессии целевого гена: ферментацию проводили в присутствии 0.1 мМ изопропил-Р-О-1-тиогалактопиранозида
¡5 20
и
0
1 15
ш 15 у
I-
та 10
к
та
IS 5
с
Ф
£ о
Ec-Lon LonEKR LonEKR-1
Рис. 3. АТР-азная активность интактной Ес-Lon-протеазы и ее мутантных форм LonEKR и LonEKR-1. Условия эксперимента: 50 мМ Трис-НС1-буфер, рН 8.1; 0.2 M NaCl; 37°С. Концентрации: АТР -2.5 мМ; MgCl2 - 2.5 (1, 3) или 20 мМ (2, 4); Р-казеин -0 (1, 2) или 1 мг/мл (3, 4); фермент - 0.1-1.0 мкМ. Величина среднеквадратичного отклонения R2 в экспериментах составила 0.98-1.00
(IPTG) и температуре 25°С. В случае увеличения концентрации индуктора до 1 мМ наблюдалось понижение базовой АТР-азной активности выделенного мутанта (LonEKR-1) на 40% по сравнению с интактным ферментом (рис. 3). Эффективность восстановления АТР-азной активности LonEKR-1 при взаимодействии с белковым субстратом также оказалась заметно ниже, чем у интактной Lon-протеазы и формы LonEKR (рис. 3). Таким образом, можно полагать, что присутствие IPTG в концентрации 1 мМ неблагоприятно влияет на фолдинг мутантной формы Ес^оп-протеазы, что также подтверждается экспериментами по гель-фильтрации LonEKR-1, в ходе которой наблюдаются изменения в характере белкового пика по сравнению с Lon и LonEKR - расширение пика и появление у него «хвоста».
Активность пептидазного центра мутантной формы LonEKR
Эффективность функционирования пептидазных центров интактной Ес-Lon-протеазы и ее мутантной формы LonEKR оценивали по гидролизу тиобензи-лового эфира N-защищенного трипептида - Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl (РерТВЕ) [40]. При гидролизе пептидного субстрата в отсутствие нуклеотидных эффекторов мутантная форма LonEKR оказалась более эффективной (в 1.7 раза), чем интактная Lon (рис. 4). При этом ионы магния активируют пепти-дазные центры обеих форм в незначительной мере. Среди свободных нуклеотидов лишь АТР проявляет слабое, но близкое по эффективности активирующее действие, в то время как ADP и AMPPNP в одина-
X у 200
.0 160
1-
и
О X 120
ш
у
1- X 80
та
к
та 40
X
.0
с 0
ф
ti
>
ATP/Mg
-Lon LonEKR LonEKR-1
ADP/Mg
AMPPNP/Mg
Рис. 4. Пептидазная активность интактной Ес-Lon-протеазы и ее мутантных форм LonEKR и LonEKR-1. Условия эксперимента: 50 мМ Трис-НС1-буфер, рН 8.1; 0.2 M NaCl; 10% DMSO; 0.2 мМ DTDP; 37°С. Концентрации: PepTBE — 0.1 мМ; нуклеотиды — 2.5 мМ; MgCl2 - 20 мМ; фермент - 0.1-1.0 мкМ. Величина среднеквадратичного отклонения R2 в экспериментах составила 0.98-1.00
ковой мере ингибируют пептидазную активность, что свидетельствует о сходном сродстве нуклеоти-дов с интактной и мутантной формами фермента. Наибольшее активирующее влияние на пептидаз-ные центры обеих форм Lon оказывают комплексы АТР/Mg и AMPPNP/Mg (рис. 4). Таким образом, можно констатировать, что пептидгидролазные центры тройного мутанта ведут себя, в целом, подобно центрам интактного фермента.
Полученные результаты позволяют считать, что введение мутаций по остаткам E34, K35 и R38 N-концевого домена EcLon не приводит к значительным изменениям функционирования пептидазных центров фермента. Однако, поскольку активация интактной Lon комплексами АТР/Mg и AMPPNP/Mg заметно превышает активацию ими формы LonEKR, можно полагать, что у мутанта изменяется передача аллостерических сигналов от АТР-азного центра к пептидазному, возможно, за счет различий в эффективности связывания комплексов Nu/Mg.
Необходимо отметить, что форма фермента LonEKR-1, полученная в результате экспрессии гена мутантной формы Lon-протеазы в присутствии 1 мМ IPTG, проявляет резко пониженную пепти-дазную активность относительно активности формы LonEKR (рис. 4). В отсутствие эффекторов гидролиз низкомолекулярного субстрата формой LonEKR-1 протекает в 8 раз медленнее, чем формой LonEKR, но при этом сохраняется активирующий эффект ионов магния. В отличие от действия на LonEKR любые свободные нуклеотиды ингибируют пептидазную активность LonEKR-1, а их комплексы с Mg2+ ускоряют
гидролиз пептида в среднем только в 2 раза, что мало отличается от действия ионов магния. Таким образом, как и в случае с АТР-азной активностью, полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что проведение индукции в присутствии 1 мМ IPTG приводит к значительным конформационным нарушениям в структуре фермента, что сказывается на его функциональной активности.
Протеолитическая активность и автолитические свойства мутантной формы LonEKR
Протеолитическую активность Ес^оп-протеазы и ее мутантной формы оценивали по гидролизу ß-казеина (рис. 5) как в [40-45]. Форма LonEKR сохраняет характерную для ферментов СКК способность гидролизовать белковую мишень по процес-сивному механизму (без высвобождения крупных промежуточных продуктов) в условиях сопряжения протеолиза с гидролизом АТР (рис. 5Б). Этот механизм реализуется гексамерной структурой LonEKR, образование которой подтверждено экспериментами по гель-фильтрации (данные не приведены). В присутствии комплекса ATP/Mg за первые 10 мин реакции более 50% казеина подвергается деградации мутантной формой, что сопоставимо с известной эффективностью АТР-зависимого гидролиза этого субстрата нативной EcLon-протеазой [43]. Интактный фермент характеризуется также способностью деградировать белковый субстрат в присутствии комплекса негидролизуемого аналога АТР, AMPPNP, с ионами магния. Продуктами реакции в этом случае являются высокомолекулярные фрагменты, т.е. про-теолиз происходит по непроцессивному механизму и с низкой эффективностью (рис. 5А). Ионы магния отдельно также можно рассматривать в качестве активаторов непроцессивного гидролиза казеина Ес-Lon-протеазой (рис. 5А). В противоположность ин-тактному ферменту протеолитическая активность тройного мутанта LonEKR в присутствии как ионов магния, так и комплекса AMPPNP/Mg за тот же период времени практически не проявляется (рис. 5Б). Полученные результаты могут отражать как ухудшение эффективности связывания белкового субстрата с LonEKR, так и нарушения аллостерических взаимодействий между АТР-азным и протеолитиче-ским центрами в мутантном ферменте.
Из рис. 5 следует, что в отсутствие эффекторов, а также при наличии ионов магния взаимодействие фермента с белковым субстратом сопровождается выраженным автолизом интактной Lon-протеазы и слабым автолизом мутанта. Изучение автолити-ческой функции нативной и мутантной форм Lon в отсутствие белка-мишени показало, что за исследуемый интервал времени (36 ч - для Lon и 33 ч -
А
Lon —
ß-казеин —
Время, ч 0 3 0 3 3 03333 33
.о
ц
о
а.
н
н
О
ей
О
р
О н
к е
«t ш m
LonEKR —
-казеин
U)
£
Q_j?CL Ü_ \ Q_
^S<<<<<
U) £ \ Ü_
ж
Время, ч 0 3 мин
0 3 3 3 3 3 3 3
0 10 20 30 40
Рис. 5. Гидролиз р-казеина Ес^оп-протеазой (Л) и ее мутантной формой LonEKR (Б) в отсутствие и в присутствии эффекторов (электрофорез в 12% ПААГ). Условия эксперимента: 50 мМ Трис-НС1-буфер, рН 8.1; 0.2 М №С1; 37°С; концентрации: р-казеин - 20 мкМ; нуклеотиды - 5 мМ; МдС^ - 20 мМ; фермент - 1 мкМ
для LonEKR) количество обеих форм фермента значительно уменьшается (рис. 6А, Б). При этом автолиз интактной Lon наблюдается исключительно в отсутствие нуклеотидных эффекторов, в то время как автолиз мутанта LonEKR происходит при любых условиях, однако нуклеотиды и их комплексы с ионами магния заметно стабилизируют мутантную форму фермента.
С помощью М-концевого секвенирования установлено, что стабильные фрагменты LonEKR образуются в результате автолиза фермента по связям, локализованным во вставочном Н1(СС)-домене ^138-Е139 и М234-К235), а также на границе ЫВ-и Н-доменов ^490^491) (рис. 1Б и 7). Продуктами автолиза по связям F138-E139 и М234-К235 являются соответственно Фрагмент-1 с молекулярной массой около 50 кДа и Фрагмент-2 около 44 кДа (рис. 6Б).
Б
m О О.
О
н
*
Ш
£
п ■§"
кДа М
0 шл <
£ -Ч Q.
Q <
£
Q.
О-
<
A
116 — 66 —
45 — 35 —
25 —
-Lon
Рис. 6. Автолитические свойства интактной Ес-Ьоп-протеазы (А) и ее мутантных форм LonEKR (Б) и LonEKR-1 (В). М - маркеры; Nu - нуклеотид (АТР, ADP или AMPPNP). Условия эксперимента: 50 мМ Трис-НС1-буфер, рН 8.1; 0.2 M NaCl; 37°С. Концентрации: нуклеотиды - 5 мМ; MgCl2 - 20 мМ; фермент -2 мкМ. А - время реакции 36 ч; 0 - контроль (время реакции -0 ч)
Без
КДа М эффекторов 116—1
66
45 35
25
-LonEKR
кДа М 116— 66
Nu
—Фрагмент-1 4с_
—Фрагмент-2
35
—Фрагмент-3 (НР)
25
Время, ч 0 8 24 33
0 8 24 33
Без
кДа М эффекторов Nu или Nu/Mg 116 — 66
кДа М 116—
66
45
35
Nu/Mg
0 8 24 33
LonEKR-1
45 35
Б
В
25
Время, ч 0 5 24 0 5 24
В этих продуктах отщеплены, по-видимому, также С-концевые части последовательности LonEKR (предположительно Р-домены). Автолитическое расщепление тройного мутанта по связи L490-S491 приводит к образованию Фрагмента-3 (33 кДа), включающего Н- и Р-домены (рис. 6Б и 7).
Стабильные фрагменты нативной Lon-протеазы образуются при автолизе, происходящем в NB-домене по связям М410-А411 и I488-R489, и исключительно
в отсутствие нуклеотидных эффекторов [43] (рис. 7). В последнем случае так же, как и у LonEKR, образуется фрагмент, включающий а-спирализованный и протеазный домены (НР), мол. масса которого соответствует 33 кДа. Таким образом, результаты автолиза свидетельствуют о различии конформаций интактной Lon-протеазы и ее тройного мутанта LonEKR, а также о возможном влиянии введенных мутаций на эффективность связывания комплексов Nu/Mg.
EcLon
M410-A411
I488-R489
117 124 173
281 302 326
Т I
491
580 596
N
\ HI | CC - NB 1 h — P
ААА+-модуль
t i
F138-E139 M234-K235
i
L490-S491
LonEKR
Рис. 7. Локализация сайтов автолиза в нативной EcLon-протеазе и в мутантной форме LonEKR
Расщепление нативного фермента по связи M234-K235, расположенной в характеристической «длинной спирали» СС-участка, тоже возможно, но такой характер деградации имеет место только при ограниченном протеолизе Lon химотрипсином в присутствии нуклеотидов или комплексов Nu/Mg [50]. Таким образом, можно констатировать, что связи M234-K235 и L490-S491 (или I488-R489) локализованы в областях субъединицы Lon, доступных воздействию различных протеаз. Однако расщепление по связи F138-E139, которая находится в N-концевой а-спирали Н1(СС)-домена, до сих пор не обнаружили ни в нативной Lon-протеазе, ни в каких-либо ее модифицированных формах.
Сайты автолиза в Н1(СС)-домене (а.о. 124-302), не характерные для интактной Lon-протеазы, ранее нашли в трех укороченных по N-концевому домену формах фермента в присутствии комплекса АТР/Mg. Так, форма Lon-d106, утратившая первые 106 а.о., в этих условиях подвергается интенсивному расщеплению по связи A267-K268, локализованной на N-конце последней спирали СС-участка [44]. Поскольку Lon-d106 - единственная укороченная форма, которая сохраняет способность к АТР-зависимому процессивному гидролизу белкового субстрата, сделано заключение о том, что N-домен Lon-протеазы не участвует в реализации механизма процессивного протеолиза, но его присутствие обеспечивает конформационную стабильность фермента в классических условиях его функционирования [44]. Форма Lon-d172, не содержащая первых 172 остатков, также нестабильна в присутствии комплекса ATP/Mg и подвергается автолизу по связи D245-D246 (центральная часть СС-участка) [43]. Полученный методом ограниченного протеолиза фрагмент Lon-протеазы Lon-d234 (а.о. 235-784) тоже проявляет повышенную автолитическую активность в условиях сопряжения с гидролизом АТР: 50%-ный автолиз наблюдается уже через 20 мин, при этом расщепление происходит непосредственно после СС-участка, по связи А286-Е287 [50].
Таким образом показано, что введение трех мутаций в Ы-концевой домен Lon-протеазы приводит к заметной дестабилизации фермента и вызывает конформационные изменения, которые обусловливают экспонирование в среду скрытого в нативной структуре региона, включающего Ы-концевую часть а-спирализованного Н1(СС)-домена.
Следует отметить, что эти особенности LonEKR становятся еще более очевидными, когда индукция мутантного гена происходит в условиях, неоптимальных для данного фермента (1 мМ 1РТО). Полученная таким путем мутантная форма LonEKR-1 подвергается практически полному автолизу за сутки независимо от присутствия нуклеотидов или нуклеотид-магниевых комплексов в реакционной смеси (рис. 6В).
Для дальнейшей характеристики конформаци-онной стабильности Lon-протеазы и ее мутантной формы LonEKR использовали также метод ограниченного протеолиза химотрипсином. Характер хи-мотрипсинолиза нативной Lon-протеазы является эффектор-зависимым [50]. В отсутствие эффекторов образуются лишь Ы-концевой фрагмент (1-207), Р- и Н-домены, тогда как присутствие нуклеотида ведет к стабилизации центрального ЫВ-домена и, как результат, к образованию добавочного фрагмента (235-584), включающего ААА+-модуль и, кроме того, часть Н1(СС)-домена (235-302) с линкером (303-325) (рис. 8А). Продукты химотрипси-нолиза Lon-протеазы схематически представлены на рис. 9. Присутствие нуклеотид-магниевых комплексов стабилизирует область между АТР-азным модулем и протеазным доменом, что приводит к образованию фрагмента (235-784), упоминаемого выше как Lon-d234 (рис. 8А и 9).
Ограниченный протеолиз формы LonEKR химо-трипсином происходит подобным же образом (рис. 8А и Б), и можно полагать, что образующиеся при этом фрагменты не отличаются от продуктов химотрипси-нолиза интактного фермента. Однако в случае формы LonEKR-1, полученной при 1 мМ 1РТО, образование стабильных фрагментов последовательности, вклю-
A
кДа М
116 — Лш
66
45 т
35 mm
25
18 — 14 —
о р
з тор
ек
Бе ф
ф э
g M
Q_
I—
<
Q.
Q <
Q. Q.
£ <
g
M
/
I—
<
g
M
/
Q.
Q <
g M
Q. Q.
£ <
Lon
235-784 (Lon-d234) •235-584
.1-207
585-784 (Р-домен)
f—491-584 (Н-домен)
Б
кДа
116 —
66
45 35
25
18 —
Без
М 0 эффекторов
Nu
Nu/Mg
LonEKR
Время, мин 30 60 120 30 60 120 30 60 120
0
*
*
*
Без
кДа М 0 эффекторов Nu Nu/Mg
Время, мин 10 20 30 90 10 20 30 90 10 20 30 90
Рис. 8. Химотрип-синолиз нативной EcLon-протеазы (А) и мутантных форм LonEKR (Б) и LonEKR-1 (В). М - маркеры; 0 -образец реакционной смеси в начальный момент времени; Nu -нуклеотид (АТР, ADP или AMPPNP). * - Продукты химотрипсино-лиза мутантных форм LonEKR и LonEKR-1, N-концы которых не подтверждены секвенирова-нием. Условия эксперимента: 50 мМ Трис-HCl-буфер; рН 8.1; 0.3 M NaCl; 30 °С. Концентрации: EcLon (LonEKR или LonEKR-1) -11 мкМ; нукле-отиды - 5 мМ; MgCl2 - 20 мМ; химотрипсин -0.2 мкМ. А - время реакции 2 ч
чающих NB-домен, не зафиксировано ни в присутствии нуклеотидов, ни в присутствии их комплексов с ионами магния (рис. 8В). Результаты химотрип-синолиза, свидетельствующие о том, что нуклео-тиды и нуклеотид-магниевые комплексы не стабилизируют структуру мутантной формы LonEKR-1, полностью согласуются с данными по автолизу этой формы. Таким образом, индукция гена lonEKR (1 мМ IPTG) является причиной формирования нестабильной конформации фермента LonEKR-1, что приводит к его быстрому автолитическому расщеплению в условиях эксперимента.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Ранее мы установили, что N-концевой домен обеспечивает конформационную стабильность EcLon-протеазы. В настоящей работе на основании рентгеноструктурных данных было предложено тестировать роль остатков E34, K35 и R38 N-домена в качестве остатков, участвующих в поддержании стабильной функциональной структуры фермента посредством межсубъединичных и/или междоменных взаимодействий. Показано, что замены этих остатков на аланин с образованием тройного мутанта LonEKR не приводят к значительным изменениям в характере функционирования АТР-азных и пеп-тидгидролазных центров фермента, но вызывают ухудшение связывания белкового субстрата.
Как и нативный фермент, мутантная форма LonEKR образует гексамерные структуры, однако вопрос о возможности формирования мутантных додекамеров остается открытым. При этом форма LonEKR сохраняет главное свойство АТР-зависимых протеаз - способность к процессивной деградации белка-мишени при сопряжении протеолиза с гидролизом АТР, несмотря на детектируемое нарушение межцентровых аллостерических взаимодействий. Вместе с тем, в отличие от интактного фермента, форма LonEKR в некоторой степени дестабилизирована введенными заменами, поскольку нуклеотиды и их комплексы с ионами магния, являющиеся стабилизаторами структуры Lon-протеазы, не способны полностью предотвратить автолитическое расщепление мутанта.
Следует особо подчеркнуть, что ключевую роль в формировании стабильной структуры функционально активной Lon-протеазы играют индукция гена и последующий фолдинг белковой молекулы в условиях краудинг-эффекта. Форма LonEKR-1, полученная при относительно высокой концентрации индуктора (1 мМ IPTG), совсем не стабилизируется нуклеотидами и проявляет повышенную скорость автолиза по сравнению с интактной Lon и формой LonEKR.
Таким образом, в настоящей работе установлено, что остатки E34, K35 и R38 N-концевого домена EcLon-протеазы влияют на формирование кор-
В отсутствие эффекторов
1-207
585-784 (Р-домен)
491-584 (Н-домен)
235-584
235-784 (Lon-d234)
585
491
H
207
- HI
CC
784
+ Nu
584
235
+
CC
Hl - NB
235
+
CC
Hl
NB
H
H
+ Nu/Mg
584
- P
784
Рис. 9. Схема строения продуктов ограниченного протеолиза Lon-протеазы E. coli химотрипсином
N
P
ректного сайта связывания белкового субстрата, вовлечены в превращения фермента, вызываемые взаимодействием с нуклеотидами, и участвуют в поддержании конформационной стабильности фермента. Предполагаемое участие изучаемых остатков в образовании додекамерных форм .EcLon-протеазы может служить задачей предстоящего структурного исследования мутанта LonEKR. •
Авторы выражают благодарность Ю.Ф. Леоновой за проведение N-концевого секвенирования фрагментов EcLon-протеазы и мутантной формы LonEKR.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 19-04-00646).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Gottesman S., Wickner S., Maurizi M.R. // Genes Dev. 1997. V. 11. P. 815-823.
2. Mogk A., Haslberger T., Tessarz P., Bukau B. // Biochem. Soc. Trans. 2008. V. 3. P. 120-125.
3. Tyedmers J., Mogk A., Bukau B. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010. V. 11. P. 777-788.
4. Balchin D., Hayer-Hartl M., Hartl F.U. // Science. 2016. V. 353 (6294). aac4354.
5. Jeng W., Lee S., Sung N., Lee J., Tsai F.T.F. // F1000Research. 2015. V. 4. (F1000 Faculty Rev). 1448.
6. Finka A., Mattoo R.U.H., Goloubinoff P. // Annu. Rev. Biochem. 2016. V. 85. P. 715-742.
7. Ротанова Т.В., Цирульников К.Б., Мельников Э.Э. // Биоорган. химия. 2003. Т. 29. С. 97-99.
8. Rotanova T.V., Melnikov E.E., Khalatova A.G., Makhovskaya O.V., Botos I., Wlodawer A., Gustchina A. // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 4865-4871.
9. Steinman J.B., Kapoor T.M. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2019. V. 50. P. 45-54.
10. Miller J.M., Enemark E.J. // Archaea. 2016. V. 2016. P. 1-12.
11. Puchades C., Sandate C.R., Lander G.C. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2020. V. 21. P. 43-58.
12. White S.R., Lauring B. // Traffic. 2007. V. 8. P. 1657-1667.
13. Bittner L.M., Arends J., Narberhaus F. // Biopolymers. 2016. V. 105. P. 505-517.
14. Striebel F., Kress W., Weber-Ban E. // Curr. Opin. Struc. Biol. 2009. V. 19. P. 209-217.
15. Gottesman S. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2003. V. 19. P. 565-587.
16. Anthony J.R., Steven E.G. // J. Mol. Biol. 2017. V. 429. P. 873-885.
17. Baker T.A., Sauer R.T. // Trends Biochem. Sci. 2006. V. 31. P. 647-653.
18. Gur E., Sauer R.T. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. P. 18503-18508.
19. Ciechanover А., Stanhill А. // Biochim. Biophys. Acta. 2014. V. 1843. P. 86-96.
20. Lopez-Castejon G. // FEBS J. 2020. V. 287(1). P. 11-26.
21. Sauer R.T., Baker T.A. // Annu. Rev. Biochem. 2011. V. 80. P. 587-612.
22. Gur E., Vishkautzan M., Sauer R.T. // Protein Sci. 2012. V. 21. P. 268-278.
23. Francis T.T., Christopher P.H. // eLife. 2020. V. 9. P. 1-3.
24. Rotanova T.V., Botos I., Melnikov E.E., Rasulova F., Gustchina A., Maurizi M.R., Wlodawer A. // Protein. Sci. 2006. V. 15. P. 1815-1828.
25. Botos I., Melnikov E.E., Cherry S., Tropea J.E., Khalatova A.G., Rasulova F., Dauter Z., Maurizi M.R., Rotanova T.V., Wlodawer A., Gustchina A. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279.
P. 8140-8148.
26. Botos I., Melnikov E.E., Cherry S., Kozlov S., Makhovskaya O.V., Tropea J.E., Gustchina A., Rotanova T.V., Wlodawer A. // J. Mol. Biol. 2005. V. 351. P. 144-157.
27. Liao J.H., Kuo C.I., Huang Y.Y., Lin Y.C., Lin Y.C., Yang C.Y.,
Wu W.L., Chang W.H., Liaw Y.C., Lin L.H., et al. // PLoS One. 2012. V. 7(7). P. 1-13.
28. Liao J.H., Ihara K., Kuo C.I., Huang K.F., Wakatsuki S., Wu S.H., Chang C.I. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2013. V. 69. P. 1395-1402.
29. Ротанова Т.В., Мельников Э.Э. // Биомед. химия. 2010. Т. 56. С. 412-419.
30. Ротанова Т.В., Дергоусова Н.И., Морозкин А.Д. // Биоорган. химия. 2013. Т. 39. С. 309-319.
31. Li M., Gustchina A., Rasulova F., Melnikov E.E., Maurizi M.R., Rotanova T.V., Dauter Z., Wlodawer A. // Acta Crystallogr. Sec. D Biol. Crystallogr. 2010. V. 66. P. 865-873.
32. Bertonati C., Punta M., Fischer M., Yachdav G., Forouhar F., Zhou W., Kuzin A.P., Seetharaman J., Abashidze M., Ramelot T.A., et al // Proteins. 2009. V. 75. P. 760-773.
33. Rotanova T.V., Andrianova A.G., Kudzhaev A.M., Li M., Botos I., Wlodawer A., Gustchina A. // FEBS OpenBio. 2019. V. 9. P. 1536-1551.
34. Wohlever M.L., Baker T.A., Sauer R.T. // Mol. Microbiol. 2014. V. 91. P. 66-78.
35. Rudyak S.G., Shrader T.E. // Protein Sci. 2000. V. 9. P. 1810-1817.
36. Adam C., Picard M., Dequard-Chablat M., Sellem C.H., Hermann-Le Denmat S., Contamine V. // PLoS One. 2012. V. 7. P. 1-10.
37. Ebel W., Skinner M.M., Dierksen K.P., Scott J.M., Trempy J.E. // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 2236-2243.
38. Botos I., Lountos G.T., Wu W., Cherry S., Ghirlando R., Kudzhaev A.M., Rotanova T.V., de Val N., Tropea J., Gustchina A., Wlodawer A. // Curr. Res. Struct. Biol. 2019. V. 1. P. 13-20.
39. Vieux E.F., Wohlever M.L., Chen J.Z., Sauer R.T., Baker T.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V. 110. P. 2002-2008.
40. Андрианова А.Г., Куджаев А.М., Серова О.В., Дергоусова Н.И., Ротанова Т.В. // Биоорган. химия. 2014. Т. 40. С. 673-681.
41. Куджаев А.М., Дубовцева Е.С., Серова О.В., Андрианова А.Г., Ротанова Т.В. // Биоорган. химия. 2018. Т. 44. С. 522-532.
42. Куджаев А.М., Андрианова А.Г., Дубовцева Е.С., Серова О.В., Ротанова Т.В. // Acta Naturae. 2017. Т. 9. № 2. С. 79-86.
43. Андрианова А.Г., Куджаев А.М., Дубовцева Е.С., Ротанова Т.В. // Биоорган. химия. 2017. Т. 43. С. 357-366.
44. Куджаев А.М., Дубовцева Е.С., Серова О.В., Андрианова
A.Г., Ротанова Т.В. // Биоорган. химия. 2016. Т. 42. С. 421-430.
45. Куджаев А.М., Андрианова А.Г., Серова О.В., Архипова
B.А., Дубовцева Е.С., Ротанова Т.В. // Биоорган. химия. 2015. Т. 41. С. 579-586.
46. Bradford M.M. // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.
47. Laemmli U.K. // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.
48. Bencini D.A., Wild J.R., O'Donovan G.A. // Anal. Biochem. 1983. V. 132. P. 254-258.
49. Castillo M.J., Nakajima K., Zimmerman M., Powers J.C. // Anal. Biochem. 1979. V. 99. P. 53-64.
50. Melnikov E.E., Andrianova A.G., Morozkin A.D., Stepnov A.A., Makhovskaya O.V., Botos I., Gustchina A., Wlodawer A., Rotanova T.V. // Acta Biochim. Pol. 2008. V. 55. P. 281-296.