CC BY
21
DOI: 10.23868/202205003
У МЫШЕЙ РОДА ACOMYS ПОСЛЕ ТРАВМЫ ВОССТАНАВЛИВАЕТСЯ ЭЛАСТИЧЕСКИЙ ХРЯЩ УШНОЙ РАКОВИНЫ
Поступила: 01.03.2022 Принята к печати: 05.04.2022 Опубликована on-line: 10.04.2022
А.И. Билялов1, 2, Д.Д. Филимошина1, Н.С. Филатов1, А.А. Билялова1, А.А. Титова1, Л.Р. Гатауллинна1, А.С. Плюшкина1, Е.И. Шагимарданова1, Р.В. Деев3, А.П. Киясов1, О.С. Козлова1, А.А. Несмелов1, О.А. Гусев1' 4 5
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
2 Московский клинический научный центр им. А.С. Логинова ДЗМ, Москва, Россия
3 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
4 Медицинский факультет университета Джунтендо, Токио, Япония
5 НМИЦ эндокринологии Минздрава России, Москва, Россия
ELASTIC EAR CARTILAGE OF ACOMYS MICE IS RECOVERING AFTER INJURY
A.I. Bilyalov1, 2, D.D. Filimoshina1, N.S. Filatov1, A.A. Titova1, L.R. Gataullina1, A.S. Plushkina1, E.I. Shagimardanova1, R.V. Deev3, A.P. Kiyasov1, O.S. Kozlova1, A.A. Nesmelov1, O.A. Gusev1, 4 5
1 Kazan (Volga region) federal university, Kazan, Russia
2 The Loginov Moscow Clinical Scientific Center Under the Health Department of Moscow, Moscow, Russia 31.I. Mechnikov North-Western State Medical University, Saint-Petersburg, Russia
4 Graduate School of Medicine, Juntendo University, Tokyo, Japan.
5 Endocrinology Research Centre, Moscow, Russia.
В статье представлены данные о регенерации тканей ушной раковины мышей ДсотуБ саЫппиБ (п=12), и мышей линии Ва1Ь/с (п=12). Применены две экспериментальные модели: пол-нослойный дырчатый дефект диаметром 3 мм и субтотальное удаление ушной раковины. Макрофотографирование и гистологическое исследование с применением общегистологических окрасок и выявлением эластических волокон осуществляли через 2, 5, 15, 21, 30, 60, 90 и 120 сут. Установлено, что в обоих моделях регенерация у ДсотуБ более выражена, что проявилось в полном устранении дефекта к 30-60 сут. в отличие от контроля (Ва1Ь/с) и развитии полноценной ушной раковины в случае ее хирургического удаления. Тканевой особенностью при этом стало менее выраженное посттравматическое воспаление у мышей ДсотуБ. Важной особенностью регенерации при этом является развитие хрящевого регенерата, который брал свое начало как от краев отреза предсуществовавшего хряща, так развивался в виде отдельных островков хрящевой ткани. Новообразованный хрящ характеризовался высокой клеточностью, меньшим по сравнению с исходным состоянием матрикса объемом, в структуре которого формировались эластические волокна.
Вместе с тем, следует отметить, что в течение 30-60 сут. процесс восстановления, по-видимому, не завершен, образованный тканевый регенерат вступает в фазу ремоделирования.
Ключевые слова: ДсотуБ, хрящ, хрящевая ткань, дефект, регенерация.
The article presents data on the regeneration of the auricle tissues of Acomys cahirinus mice (n=12) and Balb/c mice (n=12). Two experimental models were used: a full-thickness perforated defect with a diameter of 3 mm and subtotal removal of the auricle. Macrophotography and histological examination using general histological stains and detection of elastic fibers were performed after 2, 5, 15, 21, 30, 60, 90, and 120 days. It was found that regeneration in Acomys is more pronounced, which manifested itself in the complete elimination of the defect by 30-60 days in contrast to the control (Balb/c). A feature of this was less pronounced post-traumatic inflammation in Acomys mice. It was established the growth of a full-fledged auricle in case of its surgical removal. An important feature of regeneration in this case is the development of new cartilage tissue both from the edges of the original cartilage and developed in the form of separate islands of cartilage tissue. The newly formed cartilage was characterized by high cel-lularity, a smaller volume of the matrix, in the structure of which elastic fibers were formed.
However, it should be noted that within 30-60 days. the recovery process, apparently, is not completed, the formed tissue regenerate enters the remodeling phase.
Keywords: Acomys, cartilage, cartilage tissue, defect, regeneration.
Введение
Эластическая хрящевая ткань — это один из видов соединительной скелетной ткани, характеризующийся плотным, упругим межклеточным веществом, включающим коллагеновые и эластические волокна, которое продуцируется хондроцитами. Особенностью хряща является отсутствие в матриксе кровеносных сосудов и нервных волокон, чем объясняется его низкий регенераторный потенциал при повреждении [1]. Считается, что хондро-циты в дифференцированном состоянии не способны к миграции в область дефекта, поскольку они окружены плотным матриксом [2]. В то же время хрящ может ограничено регенерировать за счет 0044+ и С090+ клеток-предшественниц надхрящницы (камбиальный резерв), расположенных в ее внутреннем слое [3, 4].
В большинстве случаев повреждение хряща ведет к образованию волокнистой соединительной ткани, которая не обладает необходимыми биохимическими
и механическими свойствами характерными для хрящевых тканей [2].
Изучение механизмов регенерации у животных, обладающих способностями к восстановлению тканей в ходе репаративной регенерации без развития фиброза, поможет раскрыть закономерности репаративного гистогенеза [5]. Мыши рода Дсотуэ являются одними из немногих представителей класса млекопитающих, обладающие способностями к репаративной регенерации в случае обширных повреждений без развития выраженного фиброза [6].
Известной моделью для комплексной оценки репа-ративной регенерации тканей является травматизация ушной раковины [7, 8]. В этой модели помимо восстановления кожи, покрывающей ушную раковину, может быть оценена и способность регенерации эластической хрящевой ткани [7, 8].
Целью исследования стала сравнительная оценка репарационного хондрогенеза эластической хрящевой
2 cy^ 5 cy^ 15 cy^ 21 cy^ 30 cут.
Рис. 1. Дефекты ушной раковины ДсотуБ и Ва!Ь/с на различных этапах эксперимента. Макрофотосъемка
ткани у мышей Acomys и у мышей линии Balb/c в хирургическом дефекте ушной раковины.
Материал и методы
В эксперимент были включены две группы животных: самцы мышей Acomys cahirinus (n=12), и самцы мышей линии Balb/c (n=12).
Хирургическое моделирование травматизации ушной раковины диаметром 3 мм было произведено с соблюдением правил асептики, ранение было нанесено по центру ушной раковины устройством для биопсии кожи Dermo Punch (Sterylab, Италия), избегая повреждения крупных сосудов. В качестве обезболивания был использован «Zoletil 100» в расчете 7 мг на 1 кг массы тела.
Макрофотографирование
Макрофотографирование дефекта ушных раковин A. cahirinus и контрольных мышей осуществлялся на сроках: 2, 5, 15, 21 и 30 сут. Фотографирование производилась с помощью цифрового USB-микроскопа «Max-See 1000x» (J-Net, Китай).
Гистологическое исследование
Ткани забирались путем полного удаления ушной раковины в условиях наркотизации животных через 2, 5, 15, 21 и 30 сут. после проведения операции. Полученные фрагменты фиксировали в 10% нейтральном формалине на 0,2 М фосфатном буфере (рН=7,4) в течение 24 часов. Гистологическая проводка, заливка, и микротомия (толщина срезов 4 мкм), осуществлялась по стандартной методике. Препараты окрашивали обзорными красителями: гематоксилин и эозин (ЭргоПродакшн, Биовитрум, Россия), по Маллори (ЭргоПродакшн, Биовитрум, Россия), а также Орсеином (ЭргоПродакшн, Биовитрум, Россия) для визуализации эластических волокон.
Цифровые гистотопограммы получали при помощи сканера гистологических препаратов NanoZoomer S60 Digital slide scanner: (Hamamatsu, Япония) и анализировали при помощи программы NDP.view2 (Hamamatsu, Япония).
Второй эксперимент включал себя также две группы животных: самцы мышей Acomys cahirinus (n=2), и самцы мышей линии Balb/c (n=2).
После обезболивания «7о!ей! 100» в расчете 7 мг на 1 кг массы тела микрохирургическими ножницами производили полное удаление ушной раковины. Результаты оценивали аналогичным алгоритмом через 2, 3 и 4 месяца после операции.
Результаты и обсуждение
Травма ушной раковины
Макроскопические характеристики регенерации.
Состояние краев раны ушной раковины в группе А. са^ппив и группе Ва!Ь/с до 15 суток не имело значительных видимых отличий (рис. 1). Наблюдали типичные процессы некротиза-ции и воспаления краев дефекта. В течение месячного периода в контрольной группе, так и не произошло заметного восстановления раневой поверхности, только эпителизация по периферии раны. В группе Дсотуэ, спустя 3 недели после ранения вокруг дефекта образовалось кольцо белесой полупрозрачной ткани, которая в дальнейшем продолжала расти центростремительно внутрь дефекта. Такой рост наблюдали в течение всего периода наблюдения, пока не было достигнуто 100% закрытия раневого дефекта к 30 суткам после операции. Следует отметить, что заживление ушной раны было асимметричным, рост регенерата проксимальной части раны был быстрее чем дистальной. Также было отмечено образование волосяных фолликулов в восстановленной части ушной раковины в области проксимального участка (см. рис. 1).
Микроскопическая характеристика регенерации. Через 2 суток после проведения операции как в проксимальной, так и в дистальной части раны ушной раковины наблюдали развитие умеренной воспалительной реакции и в группе иглистых мышей Дсотуэ, и у мышей Ва!Ь/с.
На 5 сутки в группе Дсотуэ наблюдали скудную воспалительную инфильтрацию, полнокровные сосуды, содержащие единичные лейкоциты, множество сальных желез. В строме внеклеточно встречается бурый пигмент гемосидерин. К этому периоду раневого процесса воспалительная реакция в основном завершена.
В группе мышей Ва!Ь/с на 5 сутки в исследуемом материале в толще дермы обнаружили смешанно-клеточный воспалительный инфильтрат, состоящей преимущественно из сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитов с незначительной примесью мононуклеарных клеток (макрофагов,
2 сут.
5 сут.
Рис. 2. Проксимальный край поврежденной ушной раковины экспериментальной и контрольной группы на 2 и 5 сутки после моделирования дефекта: 1 — эластическая хрящевая ткань ушной раковины; 2 — воспалительный инфильтрат; 3 — восстановленный эпидермис. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. х 100
Ва!Ь/с А. саЫппиБ
Рис. 3. Проксимальный край поврежденной ушной раковины Ва!Ь/с и АсотуБ через 15 сут. после формирования дефекта: 1 — коллагеновые волокна дермы; 2 — бластемоподобный регенерат. Окраска: по Маллори. Ув. х100
лимфоцитов и плазмоцитов). Отечная строма содержит активные фибробласты. Микрососуды дилатированы, полнокровны и содержат маргинализированные нейтрофилы, что свидетельствует о продолжении активной экссудации.
У обоих видов животных процессы частичной или полной реэпителизация дефекта и отслоение некротизи-рованной ткани завершались к 5 дню (рис. 2).
На более поздних сроках (15 и 21 сут.) отмечали различия: у АсотуБ детектировали низкий синтез коллагеновых волокон и формирование бластемоподобного регенерата, в то время как у Ва!Ь/с наблюдали обильное формирование коллагеновых волокон в области дермы (рис. 3).
К 15 сут. после операции у мышей Ва!Ь/с в краях поврежденного хряща проксимальной и дистальной части дефекта наблюдали проявления незначительного хондрогенеза, который характеризовался накоплением неупорядоченных малодифференцированных скелето-генных клеток, вероятно являющихся предшественниками хондроцитов (прехондробласты), которые на этом этапе не демонстрирвоали признаков специфического синтеза компонентов матрикса; структурированная надхрящница отсутствует (рис. 4). Однако дальнейшие
процессы хондрогенеза у этой группы животных не получали своего развития, процесс реализуется через формирование плотной волокнистой соедитнительной ткани — рубца. Признаки хондрогенеза как на периферии, так и в центральных частях дефекта не определялись.
Через 30 сут. после проведения операции в группе мышей АсотуБ отмечали полное восстановление общей гистоархитектоники тканей ушной раковины. Были хорошо выраженные эпидермис и дерма с образованием упорядоченно расположенных пучков коллагеновых волокон и многочисленными волосяными фолликулами, сальными железами. Наблюдали и процессы репаратив-ного хондрогенеза, как со стороны края поврежденного хряща, так и в центральной части дефекта (рис. 5). Эластический хрящ прорастал в центральные части дефекта, но имел морфологические отличия от хряща неповрежденной ушной раковины. Структура, сформированная в ходе хондрогенеза, характеризовалась мелкими упорядоченными хондроцитами, небольшими хондроцитарными лакунами, сформированной надхрящницей и начальными признаками формирования эластических волокон маткрикса. Полученные данные
Рис. 4. Край поврежденного хряща мышей Ва1Ь/с на 15 сут. после формирования дефекта: А — дистальный край поврежденного хряща ушной раковины; В — проксимальный конец. Стрелкой отмечены вновь образованные хондроциты. Окраска: орсеин. Ув. х200
А
Рис. 5. Ушная раковина ДсотуБ через 30 сут. после формирования дефекта: 1, 2 — восстановленные придатки кожи; 3 — восстановленный эпидермис; 4 — новообразованная эластическая хрящевая ткань; стрелка — граница повреждения хряща (слева — неповрежденная часть). Окраска: по Маллори. Ув.: А х4, В х350, С х 100
А
1 XV-
; т
■ > ...Гч *
а» _ л.,'
* • Б
•.ж.. . V . 4 V •' \ДЧ
V- Л' - : ' ^ р V ■ / . /" г, V.
( . ? - , ■
ЬШ^ЗеШу-
\ # ¿ ч Ш/' \ , . ■ .1
Дй
.....-
'ЛгяШпШ/Шш,
V.: Ч»;
<ос
ФЗцг 5|А<г (
а. • V ч> .. «?
шЕга/Ш \ / . V о..' л- • . чм
Рис. 6. Островки хрящевого регенерата в центре дефекта ушной раковины ДсотуБ через на 30 сут. после операции: А — свободнолежащий островок хондрогенеза; Б — формирование фибрилл эластических волокон в матриксе новообразованной эластической хрящевой ткани; стрелка указывают на формирующуюся надхрящницу. Окраска: орсеин. Ув. х200
свидетельствуют о начинающейся дифференцировке хрящевого регенерата (ремоделировании). Также были обнаружены участки вновь образованного хряща, окружённого формирующейся надхрящницей, без связи с дистальным и проксимальным концом эластическом хряща ушной раковины (рис. 6).
Удаление ушной раковины
Макроскопическая характеристика регенерации.
После удаления ушной раковины в группе мышей Дсотуэ наблюдали активные процессы морфогенеза. Так, к концу 1 месяца после операции отмечали наличие плотной белесой ткани в области ранения. Через 2-3 месяца
Сразу после операции
1 месяц
2 месяц
3 месяц
Рис. 7. Динамика заживления ушной раковины АсотуБ после ее полного удаления: А — состояние ушной раковины через 2 мес. после операции; В — состояние ушной раковины через 4 мес. после операции. Макрофотосъемка
Рис. 8. Ушная раковины АсотуБ через 2 мес. после операции: А — гистотопограмма; В, С — варианты хрящевого регенерата на разных стадия хондрогенеза; красная стрелка — линия отреза ушной раковины; черные стрелки — островки хондрогенеза. Окраска: по Маллори. Ув.: А х2, В, С х 100
формируется восстановленная ушная раковина, состоящая из двух частей. Проксимальная часть является интактной и визуально не отличается от тканей неповреждённой ушной раковины, вторая — дистальная часть, покрытая волосяным покровом, представляет собой вновь образованные ткани ушной раковины (рис. 7).
В группе мышей линии Ва!Ь/с отмечали только эпи-телизацию культи ушной раковины, без ее дальнейшего роста и восстановления.
Микроскопическая оценка регенерации. Через 2 месяца после удаления ушной раковины в группе АсотуБ наблюдали схожую картину с восстановлением тканей при нанесении центрального дырчатого дефекта, а именно восстановление гистоархитектоники тканей с правильным формированием всех слоев и наличием придатков кожи, а также процессы хондрогенеза, как в проксимальной части регенерата, так и в дисталь-ной. Причем в дистальной части отмечается наличие
свободно лежащих островков хрящевых регенератов, не связанных в единый объем и не соединяющиеся с основным хрящом ушной раковины (рис 8).
К концу 4 месяца в группе мышей Acomys завершаются процессы репаративного хондрогенеза. Вновь образованная хрящевая ткань отличается от интактного хряща большим количеством межклеточного вещества и меньшим размером хондроцитарных лакун. Также отмечают отдельные островки хондрогенеза, несвязанные с основным хрящом (рис 9). Нельзя исключить, что отдельные части хрящевого регенерата были образованы путем миграции предшественников хондроцитарных клеток, либо путем дифференцировки клеток бластемной части ушной раковины.
Заключение
Таким образом, результаты эксперимента еще раз подтверждают, что мыши рода Acomys обладают повышенными способностями к регенерации и, в частности, к восстановлению тканей ушной раковины после повреждения или ее полного удаления. Причем спектр местных условий в области повреждения таков, что разрешает развитие репаративного хондрогенеза в том числе в области дефекта эластического хряща.
Следует отметить, что регенерация дефекта ушной раковины мышей Acomys является редким, но не единственным примером органотипического восстановления среди млекопитающих. Так, в работах Oh Se-Joon и соавт. (2018) описывается регенерация тканей ушной раковины голландского кролика после травматизации, однако регенерат не содержал признаки наличия
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Tuan R.S., Chen A.F., Klatt B.A. Cartilage regeneration. J.Am. Acad. Orthop. Surg. 2013; 21(5): 303-11.
2. Trengove A., Di Bella C., O'Connor A. The Challenge of Cartilage Integration: Understanding a Major Barrier to Chondral Repair. Tissue Engineer. Part B: Rev. 2022; 28(1): 114-28
3. Gvaramia D., Kern J., Jakob Y. et al. Regenerative Potential of Perichondrium: A Tissue Engineering Perspective. Tissue Engineer. Part B Rev. 2022; 28(3): 531-41.
4. Kobayashi S., Takebe T., Inui M. et al. Reconstruction of human elastic cartilage by a CD44+ CD90+ stem cell in the ear perichondrium. PNAS USA 2011; 108(35): 14479-84.
5. Iwaniak P., Dobrowolski P., Tomaszewska E. et al. The influence of dexamethasone administered prenatally on cartilage of newborn spiny mouse (Acomys cahirinus) offspring. J. Dev. Orig. Health Dis. 2016; 7(3): 298-305.
6. Maden M., Varholick J.A. Model systems for regeneration: the spiny mouse, Acomys cahirinus. Dev. (Cambridge, Eng.). 2020; 147(4): dev167718.
7. Rai M.F., Sandell L.J. Regeneration of articular cartilage in healer and non-healer mice. Matrix Biol. 2014; 39: 50-5.
эластического хряща, и только при помощи стимуляции плюрипотентными стволовыми клетками и стволовыми клетками, полученными из жировой ткани, удалось запустить процессы хондрогенеза [9]. Другим примером индукции хондрогенеза в аналогичной модели является применение гентерапевтического агента, кодирующего фактор роста для запуска в ходе раневого гистогенеза необходимых морфогенетических процессов [10].
Дальнейшие исследования в данной области позволят выявить клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе процессов регенерации и хондро-генеза. Ответы на эти вопросы могут подтолкнуть к улучшению уже имеющихся или созданию новых генно-клеточных препаратов и лекарственных препаратов, направленных на индукцию хондрогенеза в поврежденных тканях [10-12].
Благодарности
Работа выполнена в рамках Программы академического стратегического лидерства Казанского Федерального Университета (Приоритет-2030).
Авторы благодарят сотрудников кафедры патологической анатомии ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава России за участие в изготовлении препаратов.
Финансирование
Проект поддержан Российской Федерацией в лице Министерства Науки и Высшего Образования N 075-15-2021-1344).
8. Seifert A.W., Kiama S.G., Seifert M.G. et al. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature 2012; 489(7417): 561-5.
9. Oh S.J., Park H.Y., Choi K.U. et al. Auricular Cartilage Regeneration with Adipose-Derived Stem Cells in Rabbits. Mediators Inflamm. 2018; 2018: 4267158.
10. Пресняков Е.В., Рочев Е.С., Церцеил В.В. и др. Индукция хондрогенеза in vivo под влиянием гидрогелевого ген-активированного материала на основе гиалуроновой кислоты и плазмидной ДНК с геном VEGF. Гены и Клетки 2021; XVI(2): 47-53. [ Presnyakov E.V., Rochev E.S., Tserceil V.V. et al. Chondrogenesis induced in vivo by gene-activated hydrogel based on hyaluronic acid and plasmid DNA encoding VEGF. Genes & Cells 2021; 16(2): 47-53]
11. Grol M.W., Lee B.H. Gene therapy for repair and regeneration of bone and cartilage. Curr Opin Pharmacol. 2018; 40: 59-66.
12. Wasyteczko M., Sikorska W., Chwojnowski A. Review of Synthetic and Hybrid Scaffolds in Cartilage Tissue Engineering. Membranes (Basel). 2020; 10(11): 348.
