CC BY
161
Ш ПР
ПРЕПАРАТЫ
Туберкулезные аллергены - препараты для специфической диагностики туберкулеза
Леви Д.Т.*, Наконечная А.В.*, Обухов Ю.И.*, Рухамина М.Л.*, Александрова Н.В.*, Альварес Фигероа М.В.**
*Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского
применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва **Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии»
Роспотребнадзора Российской Федерации, Москва
Tubercular allergens - preparations for the specific tuberculosis diagnosis
Levi D.T.,* Nakonechnaya A.V.,* Obuchov Yu.I.,* Ruchamina M.L.,* Aleksandrova N.V.,* Alvarez Figueroa M.V.**
*Federal State Budgetary Institution «Scientific Center on Expertise of Medicinal Application Products»
of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow
**Federal Budget Institution of Science «Central Research Institute of Epidemiology» of the Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-being Surveillance of the Russian Federation, Moscow
Внутрикожная проба Манту с туберкулином на протяжении 100 лет остается одним из наиболее широко распространенных методов диагностики туберкулеза у детей в мире. Проба Манту обладает рядом очевидных достоинств: четкое дозирование, простота постановки и учета результатов реакции и дешевизна препарата. Однако пробе с туберкулином, состоящим из большого количества антигенов, присущ и ряд недостатков. Наиболее значимыми из них является положительный ответ как у инфицированных, так и иммунизированных БЦЖ лиц, наличие определенного числа ложных реакций. Расшифровка генома M. tuberculosis, осуществленная более 15 лет назад, позволила установить гены, кодирующие белки ESAT-6 и CFP-10, делеция которых произошла в M. bovis BCG. Отечественные ученые разработали новый рекомбинантный препарат Диаскинтест® - комплексный синтезированный гибридный белокESAT6-CFP10, полученный путем трансфекции в штамм E. coli DLT1279 клона pQE30-ESAT6-CFP10. Клинические испытания этого препарата и пятилетние постмаркетинговые исследования позволили установить, что Диаскинтест® обладает высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет дифференцировать поствакцинальную и инфекционную ГЗТ. В настоящее время наряду с туберкулиновой пробой Манту для диагностики и дифференциальной диагностики туберкулеза у детей используется диаскин-тест - внутрикожная проба с препаратом Диаскинтест®, аллерген туберкулезный рекомбинантный в стандартном разведении.
Ключевые слова: туберкулез, диагностика, посвакцинальная и инфекционная ГЗТ, туберкулин, Диаскинтест®, реком-бинантные антигены.
Библиографическое описание: Леви Д.Т., Обухов Ю.И., Рухамина М.Л., Александрова Н.В., Наконечная А.В. Использование аллергенов туберкулезных для исследования антигенов вирулентности у штаммов Mycobacterium bovis // Биопрепараты. 2013. № 4. С. 10-17.
For 100 years the intraskin Mantoux test (tuberculin injection) has remained one of the most widely used methods for the diagnosis of childhood tuberculosis in the world. Despite all positive features (accurate dosing, ease of use and consideration of results, low price), tuberculin test, which contains multiple antigens, suffer from certain drawbacks. The most significant of them are the positive results - in both infected and BCG-vaccinated populations and the occurrence of a certain number of false-positive reactions. Mapping of the M. tuberculosis genome, which was accomplished more than 15 years ago, allowed the determination of ESAT-6 and CFP-10 protein-coding genes, a deletion of which occurred in M.bovis BCG. Russian scientists have developed an innovate recombinant preparation Diaskintest® - complex synthetic hybrid protein ESAT6-CFP10, acquired by transfection of pQE30-ESAT6-CFP10 clone into E.coli DLT 1279 strain. During clinical trials and 5 years of postmarketing research it was shown, that Diaskintest® possesses high sensitivity and specificity, which allow to differentiate between postvaccinal and infective delayed type hypersensitivity. At present, the diaskin-test (an intraskin test with Diaskintest® preparation (standard dilution of tuberculine recombinant allergen)) is used for diagnosis and differential diagnosis of children tuberculosis along with tuberculine Mantoux test. Keywords: tuberculosis, diagnostics, postvaccinal and infective delayed type hypersensitivity, tuberculin, Diaskintest®, recombinant antigenes.
Bibliographic description: Levi D.T., Nakonechnaya A.V., Obuchov Yu.I., Ruchamina M.L., Aleksandrova N.V., Alvarez Figueroa M.V. Tubercular allergens - preparations for the specific tuberculosis diagnosis // Biopreparation (Biopharmaceuticals). 2013. № 4. P. 10-17.
( Обзор
Review
Для корреспонденции:
Леви Д.Т. - главный эксперт Управления экспертизы противобактериальных МИБП
ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России
Адрес: ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России
119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41
e-mail: Levi [email protected]
Статья поступила 20.09.2013 г, принята к печати 05.11.2013 г
1. Туберкулины - гетерогенные препараты из микобактерий
Впервые туберкулин был получен в 1890 г Робертом Кохом, который установил важнейший факт - реакция на туберкулин наблюдается у больных туберкулезом или у лиц, контактировавших с такими больными. Р. Кох предполагал использовать туберкулин в терапевтических целях. Первый туберкулин получил название АТК (альттуберкулин Коха). Однако наличие в конечном продукте белков мясного глицеринового бульона, на котором выращивают микобактерии при производстве АТК, приводило к неспецифической сенсибилизации организма и являлось причиной неспецифических реакций на туберкулин, а подкожное введение туберкулина в лечебных целях часто вызывало сильную негативную реакцию у больных туберкулезом.
В 1907 г. К. Пирке подтвердил специфичность туберкулина в отношении туберкулеза, предложил накожный метод применения препарата и обратил внимание на то, что с возрастом количество положительных реакций на туберкулин возрастает, достигая 90% у вполне здоровых людей или у переболевших туберкулезом. К. Пирке ввел в медицинскую практику понятие «аллергия и скарификационная кожная проба». В 1908 г Ч. Манту и Ф. Мендель одновременно предложили вну-трикожное введение туберкулина, что позволило, измеряя образующуюся папулу, улучшить оценку результатов реакции. Тест получил название «проба Манту» [1].
Туберкулин, полученный с использованием для выращивания микобактерий туберкулеза (МБТ) синтетической среды, был назван ОТ - старый туберкулин (old tuberculin) или АТ (альттуберкулин). В настоящее время в нашей стране его не применяют. В мире в основном используют очищенный туберкулин PPD (purified protein derívate) - очищенный дериват туберкулина, впервые разработанный Seibert F. в 1934 году из осажденных сульфатом аммония фильтратов культур M. tuberculosis, инактивированных нагреванием [3]. Следует отметить, что принятое в отечественной литературе сокращенное название этого вида очищенного туберкулина «ППД» является условным, так как представляет собой перевод первых букв латинской аббревиатуры, а не русского обозначения препарата. В России очищенный туберкулин ППД получен в 1939 г. М.А. Линниковой путем осаждения фильтратов инактивированных культур микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов трихлоруксусной кислотой (ТХУ) [2]. Туберкулин ППД-Л (Л - Линниковой) широко применяется до настоящего времени [4].
Очередная большая партия очищенного туберкулина PPD-S (S - Seibert) была стандартизована и предложена в 1939 г. в качестве стандарта очищенного туберкулина [5]. Первый международный стандарт очищенного туберкулина, содержавший 50000 между-
народных туберкулиновых единиц (TU) в ампуле, утвержден в 1951 г., а в 1952 г. было определено, что туберкулиновая единица ППД млекопитающих содержится в 0,028 мкг PPD-S. Этот туберкулин используется как Международный стандарт очищенного туберкулина до настоящего времени, в ампуле PPD-T (маркировка ампул после новой фасовки) содержится 5000 TU.
Несмотря на наличие международного стандарта очищенного туберкулина, процесс стандартизации туберкулинов представляет известные трудности, так как активность препаратов зависит от используемых штаммов и в значительной мере от способа выделения туберкулина. Это четко прослеживается при использовании различных моделей испытания. Так, 1 ТЕ (туберкулиновых единиц) активности второго национального стандарта содержится в 0,000015 мг порошка ОСО ППД-Л-2 независимо от используемой модели, если сравнение проводится относительно ОСО ППД-Л-1. При определении активности ППД-Л-2 относительно международного стандарта PPD-S на морских свинках, сенсибилизированных российской вакциной БЦЖ, 1 TU ОСО ППД-Л-2 содержится в 0,000003 мг, на сеси-билизированных датской вакциной БЦЖ - в 0,00004 мг, на сенсибилизированных инактивированными МБТ -в 0,00002 мг, а на больных туберкулезом людях - в 0,000015 мг порошка ППД-Л-2 [1].
Термин «туберкулин» используется во всем мире для обозначения препаратов из видов микобактерий, входящих в M. tuberculosis complex. Другие виды микобактерий также способны сенсибилизировать организм человека. Среди этих микобактерий с различной степенью патогенности для человека, которые принято называть атипичными или нетуберкулезными, есть виды, имеющие как целый ряд общих с микобактериями туберкулеза антигенов, так и менее значительное их количество (это более характерно для сапрофитных микобактерий). Наличие этих антигенов является причиной перекрестных реакций на туберкулин у лиц, сенсибилизированных нетуберкулезными микобактериями. Препараты из атипичных микобактерий M. Magnusson [6] предложил называть сенситинами. Ряд исследователей полагает, что название элиситин более подходит для этих препаратов, так как они могут лишь реализовать реакцию туберкулинового типа, а не сенсибилизировать организм. В нашей стране также были разработаны такие препараты [7]. Однако сенситины не нашли широкого применения в связи с незначительной ролью атипичных микобактерий в патологии микобактерио-зов на фоне высокой заболеваемости туберкулезом в нашей стране и недостаточной специфичностью сен-ситинов [8]. Основной компонент туберкулина - тубер-кулопротеин является смесью антигенов и антигенных детерминант микобактерий с молекулярной массой от нескольких сотен до 200 кДа. Содержание белка в зависимости от метода осаждения колеблется от 50%
(ППД, осажденные ТХУ) до 95% (ППД, осажденные сульфатом аммония).
Несмотря на название «очищенный дериват протеина», туберкулин ППД так же содержит полисахариды, липиды, небольшое количество примесей нуклеиновых кислот и неорганических веществ.
В 1973-1975 годах S. Kuwabara [9] сообщил о получении кристаллического туберкулина и опубликовал данные об аминокислотной последовательности триплетов этого препарата. Он подверг гидролизу низкомолекулярные (9700 Да) белки из убитых нагреванием клеток мико-бактерий туберкулеза и выявил значительное число пептидов. Один из них состоял из 6 аминокислот и обладал туберкулиновой активностью. В 1980 г J. Savrda [10] последовательно синтезировал этот пептид. Однако синтетический пептид был лишен туберкулиновой активности.
Туберкулинодиагностика - совокупность диагностических тестов для определения специфической сенсибилизации организма к микобактериям туберкулеза с использованием туберкулина. В современных условиях туберкулинодиагностика является основным методом раннего выявления туберкулеза у детей и подростков. Ее также широко используют для отбора контингентов для вакцинации и ревакцинации БЦЖ, оценки результативности противотуберкулезных прививок, для проведения эпидемиологического анализа инфицирования населения микобактериями.
При инфицировании микобактериями или вакцинации БЦЖ организм отвечает определенной иммунологической реакцией и становится чувствительным к последующему введению антигенов микобактерий, т.е. приобретает сенсибилизацию к ним. Эта чувствительность носит замедленный характер (специфическая реакция проявляется спустя определенное время: 24-72 ч). Туберкулин обладает высокой чувствительностью, выявляя гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) даже при использовании очень больших разведений препарата. Туберкулин ППД является неполным антигеном - гап-теном, при введении он не сенсибилизирует организм человека. Препараты туберкулина ППД вводят в организм человека накожно, внутрикожно и подкожно. Путь введения зависит от вида туберкулиновой пробы. Воспалительная реакция у больных туберкулезом возникает не только в месте введения туберкулина, но и вокруг туберкулезных очагов. При разрушении сенсибилизированных клеток выделяются активные цитокины, обладающие пи-рогенными свойствами. Пик реакции ГЗТ приходится на 48-72 ч, когда ее неспецифический компонент сводится до минимума, а специфический достигает максимума.
Интенсивность реакции на туберкулин зависит от многих факторов (специфической сенсибилизации организма, его реактивности и др.). У практически здоровых детей, инфицированных МБТ, туберкулиновые реакции обычно менее выражены, чем у больных активными формами туберкулеза. У больных туберкулезом детей чувствительность к туберкулину более высокая, чем у больных туберкулезом взрослых. При тяжелых формах туберкулеза (менингит, милиарный туберкулез, казеоз-ная пневмония) нередко выявляют низкую чувствительность к туберкулину вследствие выраженного угнетения реактивности организма. Некоторым формам туберкулеза (туберкулез глаз, кожи) чаще сопутствует высокая чувствительность к туберкулину [11].
На туберкулиновую пробу может отмечаться общая или очаговая реакции. Общая реакция проявляется в виде ухудшения самочувствия, повышения температуры тела, головных болей, артралгий, изменений в анализах крови (моноцитопения, диспротеинемия, незначительное увеличение скорости оседания эритроцитов и др.). Общая реакция чаще развивается при подкожном введении туберкулина или при многократном превышении дозы препарата, введенного внутрикожно. Очаговая реакция развивается у больных в очаге специфического поражения - в туберкулезных очагах различной локализации. При легочном туберкулезе она может проявляться кровохарканьем, усилением кашля, увеличением количества мокроты, увеличением перифокального воспаления вокруг туберкулезных очагов. Очаговая реакция более выражена при подкожном введении туберкулина.
Туберкулинодиагностику подразделяют на массовую и индивидуальную. Для индивидуальной туберкулино-диагностики, которую проводят только в специализированных медицинских учреждениях, используют последовательные десятикратные разведения очищенного туберкулина, лиофилизата (в ампуле 50000 ТЕ). Применение разведений очищенного туберкулина, лиофили-зата вне противотуберкулезных учреждений запрещено Приказом МЗ РФ № 109 от 2003 г. [12].
Для массовой туберкулинодиагностики используют только пробу Манту с 2 ТЕ аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении (очищенный туберкулин в стандартном разведении). Пробу Манту с 2 ТЕ проводят всем детям и подросткам, вакцинированным БЦЖ, 1 раз в год. Первую пробу Манту ребенок должен получить в 12-месячном возрасте. Детям, не вакцинированным БЦЖ, пробу Манту проводят с 6-месячного возраста 1 раз в 6 мес. до получения ребенком прививки БЦЖ, в дальнейшем - по общепринятой методике 1 раз в год. Не вакцинированным детям старше 2 месяцев перед вакцинацией БЦЖ ставят пробу Манту, чтобы исключить вакцинацию инфицированного ребенка и таким образом возможный сингенный эффект.
Изучение результатов туберкулинодиагностики у детей и подростков показало зависимость интенсивности ответных реакций на 2 ТЕ ППД-Л от целого ряда факторов, что следует учитывать при оценке результатов. Многими авторами подтверждена прямая корреляция интенсивности реакции на пробу Манту и величины поствакцинального знака БЦЖ. У детей, родившихся с массой тела 4 кг и больше, чувствительность к туберкулину выше; грудное вскармливание дольше 11 месяцев также влечет за собой более высокие реакции на 2 ТЕ (возможно, это связано с низким содержанием железа в молоке). Глистные инвазии, пищевая аллергия, острые заболевания органов дыхания повышают чувствительность к туберкулину. У пациента с группой крови 11(А) чаще выявляют высокую чувствительность к туберкулину, что коррелирует с предрасположенностью больных туберкулезом легких с такой же группой крови к экссу-дативному типу морфологических реакций. В условиях экзогенной суперинфекции, при гипертиреозах, аллергии, вирусном гепатите, гриппе, ожирении, сопутствующих инфекционных заболеваниях, хронических очагах инфекции, на фоне введения некоторых белковых препаратов, приеме тиреоидина туберкулиновые реакции усиливаются. Известно, что положительный результат
( Обзор
Review
пробы Манту может быть обусловлен инфицированием нетуберкулезными микобактериями. На чувствительность к туберкулину оказывают влияние прививки против детских инфекций (АКДС, АДС-М, коревая, паротитная вакцины). Именно поэтому постановку туберкулиновых проб планируют до проведения профилактических прививок против детских инфекций, которые можно делать в день учета пробы Манту, если размеры ответных реакций на туберкулин не требуют вмешательства специалистов.
Вторая половина XX века ознаменовалась интенсивным развитием генетики, генной инженерии, иммунологии, молекулярной биологии, что в частности, позволило исследовать механизм туберкулиновых реакций. В результате инфицирования организма микобакте-риями происходит накопление зрелых CD4 T-клеток (Thl-сенсибилизированные лимфоциты). При повторном введении антигена (туберкулина) происходит его презентация на поверхности макрофагов. Зрелые CD4 T-клетки, распознав антиген, начинают продукцию набора цитокинов, в частности, гамма-интерферона - небольших пептидных информационных молекул, которые являются регуляторами межклеточных и межсистемных взаимодействий, образующих очаг воспаления в зоне проникновения антигена. Эта реакция проходит по типу ГЗТ. Чем больше притянутых к антигену сенсибилизированных лимфоцитов, тем больше очаг воспаления. Происходит также повышение сосудистой проницаемости, приводящее к эритеме и отеку.
Положительная реакция на туберкулин почти всегда свидетельствует о сенсибилизации макроорганизма микобактериями (инфекция или вакцинация). Однако возможна пассивная передача туберкулиновой чувствительности несенсибилизированному лицу живыми лим-фоидными клетками [13] или лимфокинами - продуктами лимфоцитов, полученными от туберкулинположительных доноров [14]. Отмечено, что иногда на туберкулин или составные части растворителя - буферные соли, консервант, твин-80 возникают реакции немедленного типа. Однако некоторые авторы отрицают возможность реакций на растворитель.
Взамен туберкулиновой пробы Манту предлагалось множество как внутрикожных, так накожных и подкожных туберкулиновых тестов. Ряд из них имел определенные преимущества перед пробой Манту - незначительную болезненность, скорость постановки проб. Но значительный процент отрицательных реакций у инфицированных лиц и отсутствие возможности дозировать туберкулин нивелируют преимущества этих реакций перед точно дозированной пробой Манту [15].
Для обследования больших контингентов предложен безыгольный инъектор. Это, пожалуй, самый простой метод выполнения внутрикожного туберкулинового теста. Однако и он не лишен определенных недостатков, одним из которых является отсутствие уверенности в количестве введенного в кожу туберкулина [16].
В любой человеческой популяции имеются индивидуумы, у которых туберкулиновая гиперчувствительность не развивается даже после неоднократного введения вакцины БЦЖ [17, 18]. W. Bullock [19] полагал, что иммунологический дефект у таких туберкулинотрицатель-ных лиц является причиной неспособности адаптационных механизмов защитной реакции хозяина отвечать на антигены, выделяемые активно размножающимися
микобактериями в месте введения БЦЖ. Причины отсутствия ответной реакции полностью не выяснены, тем более, что у таких лиц обычно отмечается нормальный ответ на другие иммуногены. Имеются четкие эпидемиологические данные о том, что эти люди более чувствительны к последующему заражению вирулентными микобактериями туберкулеза, чем люди с нормальным иммунологическим ответом на вакцинацию. Генетически предопределенный дефект иммунного ответа приводит к неспособности отвечать на антигены микобактерий. Впервые генетическое предопределение чувствительности к туберкулезу описал много лет назад М. Lurie [20], используя для исследований инбредных кроликов. Изучению генетического фактора, контролирующего ответ на антигены микобактерий, роли HLA-DR комплекса гистосовместимости и других факторов уделяли внимание многие исследователи как у нас, так и за рубежом [21-23].
Отрицательные результаты реакции Манту могут отмечаться и в преаллергической фазе (4-8 недель) под влиянием многочисленных воздействий: вирусные и бактериальные инфекции, профилактические прививки [24]. Вакцинация против кори приводит в 2/3 случаев к временной инверсии положительной реакции на туберкулин в отрицательную. Весной размеры реакции на туберкулин больше, чем осенью. Введение иммуноглобулина, переливание крови, гормональные, иммунодепрессив-ные и химиотерапевтические средства, саркоидоз, онкологические заболевания, острые формы туберкулеза ослабляют реакцию или делают ее отрицательной. Низкий уровень чувствительности к туберкулину может быть следствием низкой дозы антигена, плохого питания [24]. Психические заболевания и стрессовые состояния, хирургическое вмешательство, роды, возрастной фактор также влияют на результаты туберкулиновых проб [25]. Лица белой расы по данным D.R. Nash с соавт. [26] реагируют на туберкулин менее выраженными реакциями, чем люди, принадлежащие к другим расам.
Отмечена достаточно высокая частота потенцирующего действия кожной туберкулиновой пробы на результат последующих проб при использовании низких доз препарата, так называемый бустер-эффект. Этот эффект заключается в том, что через неделю - полтора года после первого, чаще отрицательного, результата туберкулинового теста появляется положительная или увеличенная в размере реакция на повторное введение препарата. Проявляется бустер-эффект только у сенсибилизированных лиц, он описан также у детей, чья гиперчувствительность к туберкулину была ослаблена в течение многих лет. По одной из версий бустер-эффект возникает, когда количество Т-клеток памяти недостаточно при первой инъекции, после которой их пролиферация вызывает более сильную реакцию при второй пробе. Ряд авторов считает, что бустер-эффект является причиной высокого уровня туберкулиновых конверсий, при этом сам по себе туберкулин, являясь гаптеном, не обладает сенсибилизирующими свойствами [27].
Известно, что реакция на туберкулиновую пробу не позволяет различить ГЗТ на туберкулезную инфекцию и прививку БЦЖ. На размер туберкулиновой реакции влияет массивность заражения, а также способность микроба к размножению. Аттенуированные штаммы быстрее выводятся из организма. Поэтому при ограниченной
способности БЦЖ размножаться в организме человека, реакция на туберкулин у привитых через год ослабевает, а затем с годами затухает. В вопросе длительности сохранения поствакцинальной чувствительности к туберкулину и ее интенсивности нет единого мнения. По данным одних авторов поствакцинальная чувствительность к туберкулину сохраняется 5 лет. По мнению других - ее можно обнаружить спустя 12-15 лет, увеличив дозу аллергена до 100 ТЕ [15]. При инфицировании микобактериями туберкулеза иммунизированных лиц диаметр реакции на туберкулин увеличивается.
Наряду с трудностями туберкулинодиагностики, связанными с перекрестной туберкулиновой чувствительностью, потенцирующим действием предыдущей пробы, анергией и др., существует вариабельность в выполнении пробы и учете результатов [28, 29]. S.D. Chaparas et al. [29], изучая вариабельность пробы Манту в двойном слепом исследовании, получил совпадение результатов 2 тестов (на один и тот же предварительно закодированный препарат) у 69,7%. У 17,8% обследованных зарегистрированы положительные результаты на пробы со «Стандартом» и отрицательные с «Дубликатом». Такие разноречивые результаты исследования, в котором изучали один и тот же препарат в двойном тесте, поднимают важную проблему туберкулинодиагностики - вариабельность пробы Манту. Аналогичные исследования, проводимые ранее другими авторами [30, 31], также выявили некоторую вариабельность туберкулиновой пробы. Однако колебания находились в пределах стандартной ошибки.
Ряд авторов [32] считает, что проба Манту утрачивает свое диагностическое значение. Snell [33] показал, что 7 из 23 больных с «положительными мазками» мокроты имели реакции на туберкулин менее 5 мм. Иными словами, 39% больных активными формами туберкулеза могли быть не выявлены при туберкулинодиагностике. Применение пробы Манту для диагностики туберкулеза у взрослых в определенной мере ограничено. В последнее десятилетие пробы с туберкулином in vivo, интенсивно вытесняются тестами in vitro, которые основаны на выявлении гамма-интерферона, выделяемого у инфицированных или больных туберкулезом лиц сенсибилизированными CD4 T-клетками под действием специфических синтетических антигенов M. tuberculosis (IGRA: ELISPOT, QFT и др.). Однако для выполнения этих высокоспецифичных тестов необходим забор крови, чаще из вены. Кроме того, высокая стоимость таких тест-систем ограничивает их применение высокоразвитыми странами и использование для массового скрининга [34-36].
2. Диаскинтест®- аллерген туберкулезный рекомбинантный
Более шести десятилетий прошлого столетия предпринимались многочисленные попытки выделить специфичный антиген M. tuberculosis, способный вызывать реакции у людей при постановке кожного теста только в том случае, если они инфицированы тем видом мико-бактерий, из которых приготовлен диагностический препарат. Однако попытки разделить видоспецифические и межвидовые антигены не имели успеха. С этой точки зрения в странах, где используется массовая вакцинация БЦЖ, продолжает оставаться актуальным вопрос диффе-
ренцирования поствакцинальной и инфекционной чувствительности к туберкулину.
Возможность получить более специфичный, чем туберкулин, туберкулезный аллерген тесно связана с расшифровкой генома M. tuberculosis. Первыми в 1996 г. существование специфичных для M. tuberculosis участков генома продемонстрировали G.G. Mahairas c соавт. [37]. Применив вычитательную геномику для сравнения вирулентных M. tuberculosis и M. bovis с аттенуирован-ной БЦЖ, они обнаружили в вакцинном штамме делецию трех геномных участков, обозначенных RD1, RD2 и RD3. Впоследствии выявлено, что у 84% клинических изолятов M. tuberculosis также отсутствует участок RD3, а делеция участка RD2 обнаружена не во всех субштаммах БЦЖ. В отличие от этих двух, геномный участок RD1, размером 9,5 кб, не был выявлен ни в одном субштамме БЦЖ, но обнаружен во всех протестированных лабораторных штаммах и клинических изолятах M. tuberculosis. В этой области кодируется синтез двух секреторных белков ESAT-6 (early secreted antigenic target) и CFP-10 (culture filtrate protein). Возможность использования рекомбинантных белков ESAT-6 и CFP-10 для определения туберкулезной инфекции была детально изучена в экспериментах, проведенных в США, Германии, Дании и других странах [38-41]. Эти исследования показали, что с помощью вышеуказанных пептидов, используя их в различных тестах, можно установить инфицирование микобактериями туберкулеза. В дальнейшем были расшифрованы геномы других видов микобактерий, что показало высокую консервативность геномов комплекса M. tuberculosis, куда входит также M. bovis, M. africanum, M. microti и др. Тождественность их полногеномной ДНК составила 99,9% [42-44]. Реакции у вакцинированных БЦЖ животных при введении ESAT-6 или CFP-10 отсутствовали. В лаборатории биотехнологии НИИ молекулярной медицины ММА им И.М. Сеченова совместно с ЗАО «Мастерклон» был разработан новый рекомбинантный туберкулезный аллерген для кожного теста, получивший название Диа-скинтест®. Этот препарат представляет собой рекомбинантный белок. Для клонирования генов ESAT-6 и CFP-10 использован плазмидный вектор pQE30 (Qiagen) позволяющий экспрессировать белки с добавлением 6 гисти-диновых оснований на конце, что облегчает выделение рекомбинантного белка HIS. Амплификация генов ESAT-6 или CFP-10 из штамма M. tuberculosis H37Rv c последующей обработкой рестриктазами и клонированием в сайты плазмидного вектора pQE30 позволили получить плазми-ду pQE30-ESAT6-CFP10, которая после трансфекции в штамм E. coli DLT 1279 обеспечивала синтез гибридного белка ESAT6-CFP10 [45, 46].
Доклинические и клинические испытания препарата проводили в НИИ молекулярной медицины и НИИ фтизи-опульмонологии ММА им. И.М. Сеченова, ФГУН Государственном институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича, НИИ туберкулеза РАМН, Московском городском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом, ФГУ Санкт-Петербургском НИИ фтизиопульмонологии. Доклинические испытания препарата Диаскинтест® аллерген туберкулезный рекомбинантный на мышах, морских свинках, кроликах проводили, используя концентрат аллергена и его различные разведения. Показано, что препарат не токсичен при испытании как в остром, так
( Обзор
Review
и хроническом опыте, не вызывает шоковую реакцию у туберкулезных морских свинок при его введении (специфическая безвредность), апирогенен, эндотоксины в препарате отсутствуют (Д.Т. Леви, М.Л. Рухамина [47]). Специфическая активность рекомбинантного аллергена сопоставима с активностью туберкулина, установлена линейная зависимость ответной реакции от логарифма дозы препарата, что дает возможность достаточно стандартно определять специфическую активность препарата относительно референс-препарата на животных, зараженных M. tuberculosis. Диаскинтест® высоко специфичен при испытании на вакцинированных БЦЖ морских свинках: реакции на внутрикожное введение препарата в дозах, эквивалентных 2, 5, 125 или 500 ТЕ, были отрицательные во всех проведенных опытах. Как и туберкулин, рекомбинантный аллерген не обладает сенсибилизирующими свойствами, т.е. эти белки являются гаптенами, что позволяет неоднократное использование препарата у одного лица. При проведении доклинических исследований установлено, что сенсибилизация организма животного только живыми микобактериями туберкулеза индуцирует ГЗТ к Диаскинтесту®, в то время как ГЗТ к туберкулину возможно получить, сенсибилизируя морских свинок как живыми, так и инактивированными микобактериями. Это обстоятельство позволяет надеяться, что препарат Диаскинтест® применим для определения активности туберкулезного процесса и оценки адекватности проводимого лечения [47]. Клинические испытания Диаскин-теста® позволили подтвердить безопасность препарата и установить дозу 0,2 мкг в 0,1 мл как дозу адекватную 2 ТЕ очищенного туберкулина в стандартном разведении, используемую для массовой туберкулинодиагностики при пробе Манту [47]. На основании всех этих данных Диаскинтест® был зарегистрирован в России в 2008 году как препарат для внутрикожного теста с целью диагностики туберкулеза. Постмаркетинговые исследования продолжаются практически до настоящего времени. Их цель - уточнить сферу применения препарата [48, 49]. Изучалось использование препарата с целью скрининга и диагностики различных проявлений туберкулезной инфекции у детей и подростков (В.А. Аксенова с соавт., Л.В. Слогодская с соавт., И.Ф. Довгалюк, А.А. Старшинова [47]), диагностики туберкулеза у детей из семейного очага, у детей и подростков, состоящих в контакте с больными туберкулезом, в группах повышенного риска заболевания (Т.И. Морозова; И.А. Мокина, В.М. Жукова [47]), для диагностики туберкулеза у больных ВИЧ-инфекцией (Л.В. Слогодская с соавт. [47]). Эти исследования показали успешное применение препарата для дифференциальной диагностики постинфекционной и поствакцинальной аллергии у детей с положительными результатами пробы Манту из групп диспансерного учета (В.А. Аксенова [47]) и при диагностике осложнений после вакцинации БЦЖ (Т.А. Севостьянова с соавт. [47]). Специальные исследования, проведенные с целью оценки клинико-экономи-ческих показателей препарата Диаскинтест®, позволили установить, что препарат обладает высокой чувствительностью и специфичностью, пригоден для широкомасштабного производства и массового применения, требует минимального лабораторного обеспечения и обучения персонала (Б.Л. Медников [47]).
На сегодняшний день есть немало данных о наличии «латентной» (дремлющей) туберкулезной инфекции, но
есть и факты, не позволяющие полностью подтвердить такое положение. Это теория, а на практике целый ряд тестов (в том числе и диаскин-тест и гамма-интерферо-новые тесты) может свидетельствовать о персистирова-нии микобактерий туберкулеза в организме. Эти тесты с определенной долей вероятности позволяют спрогнозировать риск манифестного туберкулеза. В таких случаях может быть рекомендовано проводить химиотерапию не только изониазидом, но и несколькими комбинациями противотуберкулезных препаратов. Иными словами, речь идет скорее о лечении не выявленного обычными методами туберкулеза (В.И. Литвинов [47]). В сравнительном испытании установлена высокая чувствительность и согласованность кожного диаскин-теста и квантифероно-вого теста in vitro. При этом, как считают авторы, Диаскинтест® лишен ряда недостатков тестов in vitro: высокой стоимости тест-системы, специального оборудования и квалифицированного персонала для работы с ним, времени трудозатрат, необходимости забора крови у пациента [47, 50]. Результаты постмаркетинговой оценки использования Диаскинтеста® для обследования медико-биологической и социальной групп риска по туберкулезу среди взрослых свидетельствуют о том, что помимо уже отработанных показаний к применению, препарат может быть использован для диагностики латентной туберкулезной инфекции и отбора пациентов для превентивной терапии. Известно, что на туберкулин дети реагируют большими по размеру реакциями, чем взрослые, поэтому не вызывают удивления случаи отрицательных реакций на Диаскинтест® у больных туберкулезом взрослых. Поэтому некоторые исследователи считают, что Диакин-тест® нашел свою нишу как диагностический препарат при использовании у детей, но его роль у взрослых недостаточно исследована. Исследования продолжаются.
Заключение
Диагностика туберкулеза с использованием аллергенов туберкулезных основана на том, что при инфицировании или вакцинации микобактериями организм отвечает определенной иммунологической реакцией и становится чувствительным к последующему введению антигенов микобактерий, то есть приобретает сенсибилизацию к ним. Эта чувствительность носит замедленный характер и получила название ГЗТ. Для диагностики туберкулеза используется 2 туберкулезных аллергена: туберкулин, предложенный Р. Кохом более 100 лет назад (АТК), усовершенствованный F. Seibert с сотрудниками в 1934 г. (очищенный туберкулин ППД) и новый - аллерген туберкулезный рекомбинантный.
Внутрикожная проба Манту с туберкулином почти на протяжении 100 лет оставалась одним из наиболее широкораспространенных методов диагностики туберкулеза в мире. Проба Манту обладает рядом очевидных достоинств: это - прежде всего четкое дозирование препарата, простота постановки и учета результатов реакции и дешевизна препарата. Однако туберкулиновой пробе присущи и ряд недостатков, которые связаны с тем, что туберкулин представляет собой очень большой (сотни) набор антигенов, что ограничивает его специфичность. Наиболее значимым из них является положительный ответ не только у инфицированных, но и у иммунизированных БЦЖ лиц, наличие ложноположительных реакций.
Это создает известные трудности в постановке диагноза и приводит к тому, что значительное число детей и подростков с поствакцинальной аллергией направляется к фтизиатру на обследование. Большинство из них берут под наблюдение в различные группы диспансерного учета, в результате которого нередкими являются случаи необоснованной превентивной химиотерапии.
Расшифровка генома M. tuberculosis, осуществленная более 15 лет назад, показала, с одной стороны, 99,9%-ную тождественность ДНК штаммов комплекса мико-бактерий туберкулеза. С другой - M. bovis BCG (все известные субштаммы) имеет делецию геномного участка RD1. Это открытие позволило широко использовать различные генно-инженерные методы получения синтетических высокоспецифичных антигенов. Отечественные ученые разработали новый рекомбинантный препарат -комплексный синтезированный гибридный белок ESAT6 -CFP10, полученный путем трансфекции в штамм E. coli DLT 1279 клона pQE30-ESAT6-CFP10. Рекомби-нантный аллерген получил назвение Диаскинтест®, а внутрикожная проба с ним - диаскин-тест (сокращенно ДСТ). Проведенные доклинические исследования показали высокую специфичность препарата - морские свинки, вакцинированные БЦЖ, не реагируют на его введение. Не меньший интерес представляют данные о том, что на диаскин-тест положительно реагируют только животные, сенсибилизированные живыми микобактериями туберкулезного комплекса.
Клинические и постмаркетинговые наблюдения выявили высокую специфичность и чувствительность препарата в случаях заражения микобактериями туберкулеза, развития туберкулезного процесса, наблюдений в процессе лечения и излечения, а также при решении вопроса о природе поствакцинальной или инфекционной ГЗТ. Постепенно Диаскинтест® все больше завоевывает свою нишу в диагностике туберкулеза и дифференциальной диагностике поствакцинальных осложнений. Однако как любой диагностический препарат Диаскинтест® имеет свои положительные и отрицательные стороны, которые пока ограничивают его применение и требуют проведения дальнейших исследований. Так, в ряде случаев, у лиц с установленным диагнозом туберкулез при постановке пробы с Диаскинтестом® отмечаются отрицательные или слишком пышные реакции с альтерацией ткани. Возможно, необходима дальнейшая корректировка дозы препарата в зависимости от назначения диаскин-теста, так же как это имеет место для индивидуальной и массовой туберкулинодиагностики.
Литература
1. Леви Д. Т. Современные препараты туберкулина -методы получения, контроля, стандартизации и применения: дис.... докт. мед. наук. М. 1987.
2. Лянда-Геллер Б. А. Получение высокоочищенных фракций очищенного сухого туберкулина, ее химическая и биологическая характеристика//Проблемы туберкулеза. 1963. № 9. С. 67.
3. Seibert F. B., Du FourE. Purified protein derivative, its isolation from old tuberculin and fractionation of resi-due//Amer. Rev. Tuberc. 1940. V. 41. P. 57-70.
4. ПоддубнаяЛ. В., Шилова Е. П., Егошина И. Ю., Шаку-ро Ж. В. Диагностика активности туберкулезной инфекции у детей//Туберкулез и болезни легких. 2013. № 9. С. 16-19.
5. Seibert F. B., Glen J. T. Tuberculin purified protein derivative: Preparation and analysis of a large quantity for standard//Amer. Rev. Tuberc. 1941. V. 44. P. 9-25.
6. Magnusson M. Das tuberculin Herstellung, reinigung, standardisierung und chemischer aufbau/Infektions -Krankheiten und ihre erreger. VEB Gustav Fischer Verlag. Jena. 1967. Band. 4. Teil 11.
7. Яблокова Т. Б., Леви Д. Т. Сравнительное изучение аллергических реакций методом внутрикожных проб со стандартным туберкулином и сенситинами//Труды XXI Международная конференция по туберкулезу. М. 1972.
8. Литвинов В. И., Макарова М. В., Краснова М.А. Нетуберкулезные микобактерии. М. МНПЦБТ, 2008.
9. Kuwabara S. Amino acid sequence of tuberculin-active protein from Mycobacterium tuberculosis//Biol. Chem.
1975. V. 250. P. 2563-2568.
10. Savrda J. Synthesis and biological assays of a peptide from a tuberculin-active protein//Infect. Immunol. 1980. V. 30. P. 686-693.
11. АвербахМ. М., Рабухин А. Е., Борзенко А. С., Гер-герт В. Я. Новые туберкулино-провокационные тесты в выявлении скрытой активности туберкулезного про-цесса^Проблемы туберкулеза. 1977. № 2. С. 26-28.
12. Приказ Минздрава РФ № 109 от 21.03.2003 г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации».
13. Литвинов В. И., АвербахМ. М., ГергертВ. Я., Клюев В. А., Мороз А. М., Колодяжная Н. С. Повышенная чувствительность замедленного типа в противотуберкулезном иммунитете//Иммунология и иммунопатология туберкулеза/Под ред. Авербаха М. М. М.
1976. С. 50-72.
14. Клюев В. А. Перенос повышенной чувствительности замедленного типа и устойчивости к туберкулезу: дис. . канд. мед. наук. М., 1972.
15. Митинская Л. А. Туберкулез у детей. М. 2004.
16. Маслаускене Т. П. Опыт применения безыгольных инъекторов для массовой туберкулинодиагности-ки//Проблемы туберкулеза. 1978. № 2. С. 6-9.
17. Van Eden W., De Vries R. R. P., Stanford J. L. et.al. HLA-DR3 associated genetic control of response to multiple skin test with new tuberculins//Clin. Exp. Immunol. 1983. V. 52. P. 287-292.
18. Аксенова В. А., Леви Д. Т. Туберкулезные вакцины// Вакцины и вакцинация: национальное руководство/ Под ред. Зверева В. В. М., 2011, гл. 18., C. 371-412.
19. Bullock W. E. Anergy and infection//Adv. Internal. Med. 1975. V. 21. P. 149-173.
20. Lurie M. B., Abramson S., Heppleston A. G. On the response of genetically resistant and susceptible rabbits to the qualitative inhalation of human-type tubercle bacilli and the nature of resistance to tuberculosis//Exp. Med. 1952. V. 95. P. 119-134.
21. Авербах М. М., Мороз А. М., Литвинов В. И. и др. Естественная резистентность к туберкулезу и некоторые
( Обзор
Review
вопросы иммуногенетики//Иммунология и иммунопатология туберкулеза. М. 1976. С. 106-116.
22. Туберкулез. Патогенез, защита, контроль/Под ред. Блюма Барри Р. М.: Медицина, 2002.
23. Поспелов А. Л., Гергерт В. Я., Лепеха Л. Н., Егоров Е. Е., ВишняковаХ. С., Бочарова И. В. Эффективность применения сингенной и аллогенной трансплантации мезенхимальных стволовых клеток в терапии инфицированных микобактериями туберкулеза мышей//Туберкулез и болезни легких. 2013. № 8. С. 28-33.
24. Аксенова В. А., ЛевиД. Т., Клевно Н. И. Туберкулез у детей и подростков. М.: ГЭОТАР-Медиа., 2007.
25. Слогодская Л. В. Кожные иммунологические пробы при туберкулезе - история и современность//Тубер-кулез и болезни легких. 2013. № 5. С. 39-46.
26. Nash D. R., Douglass J. E. Anergy in active pulmonary tuberculosis//Chest. 1980. V. 77. P. 32-37.
27. Menzies D. Interpretation of repeated Tuberculin test. Boosting, conversion, and reversion//Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1999. V. 159. № 1. P. 15 -21.
28. Horowitz O. The necessity of training Mantoux readers//WHO (TB) Tech. Inform. 1966. 48.
29. Chaparal S. D., Vac. Vandiviere H., Melvin J. et.al. Tuberculin test: Variability with the Mantoux procedure//Am. Rev. Resp. Dis. 1985. V. 132. № 1. P. 175-177.
30. Гинзбург Е. А. Туберкулинодиагностика в современных эпидемиологических условиях: дис.... докт. мед. наук. М. 1965.
31. Guld J., Bentzon M. W., BleikerM. A. et.al. Standardization of a new batch of purified tuberculin (PPD) intended for International use//Bull WHO. 1958. V. 19. P. 845-951.
32. Мейснер А. Ф., Стахеева Л. Б., Киселевич О. К. Вакцинация БЦЖ и плановая туберкулинодиагностика у московских детей // Российский педиатрический журнал. 2010. № 3. С. 11-14.
33. Snell N. J. A comparison of Mantoux and tuberculin Tine testing in a chest Unit//Tubercle. 1979. V. 60. P. 99-104.
34. Мордовская Л. И., Владимирский М. А., Аксенова В. А., Ефремов Е. Е., Игнашенкова Г. И., Власик Т. Н. Индукция -интерферона в образцах цельной крови in vitro - тест для определения туберкулезного инфицирования детей и подростков//Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2009. № 6. С. 19-24.
35. De Kantor IN. Diagnosis of latent tuberculosis infection in BCG-vaccinated subjects in China//Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2011. V. 15. P. 1510-1515.
36. Winthrop K. L., NyendakM., Calvet H. et.al. Interferon-y release assays for diagnosing mycobacterium tuberculosis infection in renal dialysis patients//Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 2008. V. 3 (5). P. 1357-1363.
37. Mahairas G. G., Sabo P. J., HickeyM. J., Singh D. S. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis// J. Bacteriol. 1996. V. 178 (5). P. 1274-1282.
38. Arend S. M., Ottenhoff T. H. et.al. Uncommon presentation of tuberculosis the potential value a novel diagnostic assay based on the Mycobacterium tuberculosis-specific antigens ESAT-6 and CFP-10//Int. J. Tub. Lung. Dis.
2001. V. 5. № 7. P. 680-686.
39. Doherty TM., DemissieA., Olobo J., WoldayD., Andersen P. Immune Responses to the Mycobacterium tuberculosis-specific antigen ESAT-6 signal subclinical infection among Contacts of tuberculosis patients//J. Clin. Microbiol. 2002. V. 40 (2). P. 704-706.
40. Ferrara G., Losi M., D 'Amiro R. et.al. Use in routine clinical practice of two commercial blood tests for diagnosis of infection with Mycobacterium tuberculosis: prospective study//Lancet. 2006. V. 367, № 9519. P. 1328-1334.
41. Ravn P., MunkM. E., Andersen A. B. et.al. Prospective evaluation of a whole-blood test using Mycobacterium tuberculosis-specific antigens ESAT-6 and CFP-10 for diagnosis of active tuberculosis//Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005. V. 12 (4). P. 491-496.
42. Camus J. C., Pryor M. J., Mdigue C., Cole S. T. Reannotation of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv//Microbiology. 2002. V. 148, № 10. P. 2967-2973.
43. Fleischmann R. D., Alland D., Eisen J. A. et.al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains//J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 5479-5490.
44. Fraser C. M., Eisen J. A., Fleischmann R. D. et.al. Comparative genomics and understanding of microbial biology//Emerg. Infect. Dis. 2000. V. 6. P. 505-512.
45. Киселев В. И., Северин Е. С., Перельман М. И., Пальцев М. А. Новые биотехнологические решения в диагностике и профилактике туберкулезной инфек-ции//Вестник НИИ молекулярной медицины. 2005. Вып. 5. С. 37-45.
46. Киселев В. И., Барановский П. М., Рудых И. В., Шустер А. М., Мартьянов В. А., Медников Б.Л., Демин А. В., Александров А. Н., Мушкин А. Ю., Леви Д. Т., СлогоцкаяЛ. В., Овсянкина Е. С., Медуницын Н. В., Литвинов В. И., Перельман М. И., Пальцев М. А. Клинические исследования нового кожного теста «ДИА-СКИНТЕСТ» для диагностики туберкулеза//Пробле-мы туберкулеза и болезней легких. 2009. № 2. С. 11-17.
47. Кожная проба с препаратом «ДИАСКИНТЕСТ» - новые возможности идентификации туберкулезной инфекции/Под ред. Пальцева М. А. М., 2011.
48. Леви, Д. Т., Позднякова А. С., БабченокИ. В. Диа-скинтест® в диагностике и дифференциальной диагностике туберкулезной инфекции//Пульмонология. 2010. Вып. 5. С. 51-55.
49. Овсянкина Е. С., Губкина М. Ф., Ершова Н. Г., Кобу-лашвили М. Г. Опыт применения нового кожного теста (Диаскинтеста®) для диагностики туберкулеза органов дыхания у детей и подростков в туберкулезном отделении/туберкулез и болезни легких. 2010. № 1. С. 16-19.
50. Слогоцкая Л. В., Иванова Д. А., Кочетков Я. А., Куликовская Н. В., Ванеева Т. В., Филиппов А. В. Сравнительные результаты кожного теста с препаратом, содержащим рекомбинантный белок CFP- 10-ESAT-6, и лабораторного теста QuantiFERON - GT/Туберкулез и болезни легких. 2012. № 10. C.1-6.
