CC BY
16
ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ КСЕНОГЕННОГО КОНСЕРВИРОВАННОГО ЭПОКСИДНЫМИ СОЕДИНЕН В КАЧЕСТВЕ СШИВАЮЩИХ АГЕНТОВ
DOI: 10.17691/stm2021.13.4.03 УДК 616.11:547.441 Поступила 17.05.2021 г.
Н.А. Бондаренко, к.б.н., научный сотрудник лаборатории клеточных технологий1; старший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий Института экспериментальной биологии и медицины2;
М.А. Суровцева, к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий1; старший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий Института экспериментальной биологии и медицины2;
А.П. Лыков, к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории клеточных технологий1; старший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий Института экспериментальной биологии и медицины2; И.И. Ким, к.м.н., научный сотрудник лаборатории клеточных технологий1; старший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий Института экспериментальной биологии и медицины2;
И.Ю. Журавлева, д.м.н., профессор, директор Института экспериментальной биологии и медицины2; О.В. Повещенко, д.м.н., зав. лабораторией клеточных технологий1; зав. лабораторией клеточных технологий Института экспериментальной биологии и медицины2
1 Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии — филиал Федерального исследовательского центра Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, ул. Тимакова, 2, Новосибирск, 630117; Национальный медицинский исследовательский центр им. академика Е.Н. Мешалкина Минздрава РФ, ул. Речкуновская, 15, Новосибирск, 630055
Цель исследования — оценить цитотоксическое влияние ксеноперикардиального биоматериала, обработанного ди- и пента-эпоксидами, на культуры клеток in vitro.
Материалы и методы. Использованы образцы бычьего и свиного перикарда. Для консервации применяли три различных режима: 1) 0,625% раствор глутарового альдегида с двукратной сменой раствора на 2-е и 7-е сутки; 2) 5% раствор диглицидило-вого эфира этиленгликоля со сменой раствора на 2-е сутки; 3) 5% раствор диглицидилового эфира этиленгликоля в течение 10 дней, затем 2% раствор пентаэпоксида в течение 10 дней. Цитотоксичность биоматериала оценивали методом экстракции. Для определения цитотоксичности использовали клетки линии EA.hy926, мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК), фибробласты. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-теста, уровень апоптоза и некроза в культурах клеток — по окраске акридиновым оранжевым и этидиумом бромидом после культивирования с экстрактами ксеноперикарда с различными режимами консервации.
Результаты. Установлено, что наибольшее токсическое влияние на культуры клеток оказывают экстракты бычьего и свиного перикардов, консервированных глутаровым альдегидом: жизнеспособность клеток снижается на 20-33%. Экстракты ксенопери-карда, консервированного ди- и пентаэпоксидными соединениями, не оказывают токсического влияния на эндотелиальные клетки,
Для контактов: Бондаренко Наталья Анатольевна, e-mail: bond802888@yandex.ru
ММСК, фибробласты, поскольку жизнеспособность клеток снижается не более чем на 15%. Наименьший уровень апоптоза и некроза отмечается в культурах клеток под влиянием экстрактов перикардов, консервированных диэпоксидными и пентаэпоксидными соединениями.
Заключение. По оценке цитотоксичности, определению уровня апоптоза и некроза в культурах клеток установлено, что бычий и свиной перикарды, обработанные ди- и пентаэпоксидами, не оказывают цитотоксического влияния на культуру эндотелиальных клеток линии EA.hy926, ММСК, фибробластов in vitro. В то же время глутаровый альдегид в сравнении с ди- и пентаэпоксидами оказывает токсическое влияние на клетки.
Ключевые слова: ксеноперикард; глутаровый альдегид; диэпоксидные соединения; пентаэпоксидные соединения; эндотели-альные клетки; мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки; фибробласты.
Как цитировать: Bondarenko N.A., Surovtseva M.A., Lykov А.Р., Kim I.I., Zhuravleva I.Yu., Poveschenko O.V. Cytotoxicity of xenogeneic pericardium preserved by epoxy cross-linking agents. Sovremennye tehnologii v medicine 2021; 13(4): 27-35, https://doi. org/10.17691/stm2021.13.4.03
English
Cytotoxicity of Xenogeneic Pericardium Preserved by Epoxy Cross-Linking Agents
N.A. Bondarenko, PhD, Researcher, Cell Technology Laboratory1; Senior Researcher, Cell Technology Laboratory, Institute of Experimental Biology and Medicine2;
M.A. Surovtseva, MD, PhD, Senior Researcher, Cell Technology Laboratory1; Senior Researcher, Cell Technology Laboratory, Institute of Experimental Biology and Medicine2; А.^ Lykov, MD, PhD, Leading Researcher, Cell Technology Laboratory1; Senior Researcher, Cell Technology Laboratory, Institute of Experimental Biology and Medicine2;
I.I. Kim, MD, PhD, Researcher, Cell Technology Laboratory1; Senior Researcher, Cell Technology Laboratory, Institute of Experimental Biology and Medicine2;
I.Yu. Zhuravleva, MD, DSc, Professor, Director of the Institute of Experimental Biology and Medicine2;
ОМ. Poveschenko, MD, DSc, Head of the Cell Technology Laboratory1; Head of the Cell Technology Laboratory,
Institute of Experimental Biology and Medicine2
1Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology — Branch of the Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, 2 Timakova St., Novosibirsk, 630117, Russia;
2Meshalkin National Medical Research Center, Ministry of Health of the Russian Federation, 15 Rechkunovskaya St., Novosibirsk, 630055, Russia
The aim of the study was to assess the cytotoxic effect of xenopericardial biomaterial treated with di- and pentaepoxides on the cell cultures in vitro.
Materials and Methods. Samples of bovine and porcine pericardium were used in the work. Three different modes were employed for preservation: 1) 0.625% solution of glutaraldehyde (GA) and a two-fold change on days 2 and 7; 2) 5% solution of ethylene glycol diglycidyl ether (EGDE) changed on day 2; 3) 5% EGDE solution for 10 days, then 2% pentaepoxide solution also for 10 days. The cytotoxicity of the biomaterial was assessed by the extraction method. To determine the cytotoxicity of the biomaterial, EA.hy926 cells, multipotent mesenchymal stem cells (MMSCs), and fibroblasts were used. Cell viability was determined by the MTT test. The level of apoptosis and necrosis in the cell cultures was assessed by staining with acridine orange and ethidium bromide after cultivation with xenopericardial extracts employing different modes of preservation.
Results. Extracts of bovine and porcine pericardium preserved with GA have been found to have the greatest toxic effect on the cell cultures showing 20-33% reduction of cell viability. Extracts from bovine and porcine pericardium preserved with di- and pentaepoxy compounds do not have a toxic effect on endothelial cells, MMSCs, and fibroblasts since cell viability reduction is by no more than 15%. The lowest level of apoptosis and necrosis is observed in the cell cultures under the influence of extracts from the pericardium, preserved with diepoxide and pentaepoxide compounds.
Conclusion. According to the MTT test for cytotoxicity and determination of the level of apoptosis and necrosis in cell cultures, bovine and porcine pericardia treated with di- and pentaepoxides have been established to have no cytotoxic effect on the culture of endothelial EA.hy926 cells, MMSCs, fibroblasts in vitro, whereas GA, in comparison with di- and pentaepoxides, has a toxic impact on the cells.
Key words: xenopericardium; glutaraldehyde; diepoxide compounds; pentaepoxide compounds; endothelial cells; multipotent mesenchymal stem cells; fibroblasts.
Введение
Поиск новых материалов для реконструктивно-вос-становительной хирургии занимает важное место в биомедицинских исследованиях. В кардиохирургии для протезирования и пластики клапанов сердца и крупных магистральных сосудов широко применяется ксеноперикард (бычий и свиной). При изготовлении биопротезов из ксеноперикарда в качестве сшивающего агента часто используется глутаровый альдегид (ГА), который вызывает поперечную сшивку коллагена ксеноперикарда, обеспечивая его устойчивость к биодеградации и длительное функционирование в организме пациента. Однако было показано [1], что ГА-обработанные биопротезы могут подвергаться кальцификации в организме реципиента. Причем существует зависимость скорости и интенсивности каль-цификации от возраста пациентов: у молодых пациентов процесс протекает быстрее.
Для профилактики кальцификации биопротезов предлагаются различные агенты, такие как а-аминоолеиновая кислота, октандиол и т.д. В 1987 г С. Nojiri с соавт. [2] предложили использовать для поперечной сшивки перикарда эпоксидные соединения. В экспериментальных и клинических работах было показано, что биопротезы, обработанные диглициди-ловым эфиром этиленгликоля (ДЭЭ), обладают устойчивостью к кальцификации, гидрофильностью, низкой цитотоксичностью и стерильностью [3, 4].
Обработанный диэпоксидом биоматериал не является мутагенным и имеет хорошие функциональные характеристики [5]. Диэпоксидные соединения обеспечивают увеличение плотности сшивки, улучшение механических характеристик и биологической стабильности биоматериала [6]. Доказано, что полифункциональные эпоксидные соединения (обладающие несколькими эпоксидными группами) по сравнению с бифункциональными усиливают эти эффекты [7]. Все эпоксидные консерванты блокируют кальцифика-цию коллагена, хотя в отношении эластина таких однозначных результатов не получено. Ткань перикарда вне зависимости от видовой принадлежности является полностью коллагеновым материалом, что позволяет с высокой степенью вероятности прогнозировать отсутствие кальцификации в изготовленных из него биопротезах при использовании ДЭЭ в качестве консерванта.
Одним из полифункциональных эпоксидных соединений является 1,2,3,4,6-пента-0-{1-[2-(глицидилокси) этокси]этил}^-глюкопираноза (пентаэпоксид, ПЭ), содержащий в молекуле 5 реакционно-способных эпоксидных групп. Впервые он был синтезирован в Институте химии им. А. Фаворского Сибирского отделения РАН (Иркутск, Россия) в 1985 г. Оценка цитоток-сичности биопротезных материалов, консервированных с использованием ПЭ, освещена лишь в одной работе и в отношении одного вида клеток [8].
Цель исследования — оценка цитотоксического влияния ксеноперикардиального биоматериала, обра-
ботанного ди- и пентаэпоксидами, на культуры различных клеток in vitro.
Материалы и методы
Биоматериалы. Бычий перикард (БП) и свиной перикард (СП) забирали от здоровых животных на мясокомбинате, очищали образцы от соединительной ткани, несколько раз промывали 0,9% раствором хлорида натрия и разделяли на три равные части для дальнейшей консервации. Консервацию проводили при комнатной температуре в течение 6 ч после забора материала. Для консервации использовали три различных материала:
1) группа ГА: 0,625% раствор глутарового альдегида (Sigma-Aldrich, США); 0,1 М фосфатный буфер; рН=7,4; в течение 21 сут с двукратной сменой раствора — на 2-е и 7-е сутки;
2) группа ДЭЭ: 5% раствор диглицидилового эфира этиленгликоля; чистота — 97% (Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова Сибирского отделения РАН); 0,1 М фосфатный буфер; рН=7,4; в течение 14 сут со сменой раствора на 2-е сутки;
3) группа ДЭЭ + ПЭ: 5% раствор диглицидилового эфира этиленгликоля в течение 10 сут, затем 2% раствор пентаэпоксида (Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского Сибирского отделения РАН); 0,1 М фосфатный буфер, рН=7,4; в течение 10 сут.
Культуры клеток. Эндотелиальные клетки линии EA.hy926 были любезно предоставлены Dr. C.J. Edgel (Университет Каролины, США). Их культивировали в питательной среде DMEM/F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС; Hydone Laboratories Inc., США), 40 мкг/мл гентамицина сульфата («ДАЛЬХИМФАРМ», Россия) и 2 ммоль L-глутамина (ICN, США) в СО2-инкубаторе при 37°С и 5% СО2 до образования конфлюэнтного монослоя.
Культуру мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК) получали из адгезивных мононуклеаров костного мозга от пациентов с ише-мической болезнью сердца, давших информированное согласие, согласно протоколу, утвержденному Этическим комитетом Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфо-логии — филиала Федерального исследовательского центра Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН. Культура клеток фибробластов ФЭЧ-16-2 была приобретена в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (Новосибирская область). ММСК и фибробласты культивировали в питательной среде ДМЕМ с добавлением 10% ЭТС, 2 ммоль L-глутамина и 40 мкг/мл гентамицина. В работе использовали клетки 3-5 пассажей.
Оценка цитотоксичности биоматериала. Токсичность биоматериала оценивали методом экстракции
°
£
ю
о £
н о
Ж
>
СП
я
и
■8 м с
г
>
Ё1 1
§
» К
к
£ I
р I
-I
со а
К
5
-а
Р
Ш
а §
в
г §
Жизнеспособность клеток, % от контроля
ГА-БП 24 ч ГА-БП 72 ч ДЭЭ-БП 24 ч ДЭЭ-БП 72 ч ДЭЭ + ПЭ-БП 24 ч ДЭЭ + ПЭ-БП 72 ч ГА-СП 24 ч ГА-СП 72 ч ДЭЭ-СП 24 ч ДЭЭ-СП 72 ч ДЭЭ + ПЭ-СП 24 ч ДЭЭ + ПЭ-СП 72 ч
0
1
о
О) "О ш
"О
0 ш 0)
1 I
сг
"О н
Л -о о ^ О -1 "О
0) =1
* Е
< ф
=1 « О К
^ О
я
155
о
"О ¿о
ш к5
О)
-С ^
Гз о» Е и
Ш о ь
Ш н и X р
ь! X
(1> о £
(1> 3 зе
+ О о
л> с
0) 0 1 X о о X
X и X о о "О л □ о "О н
£ и Я и и о
ы X п> X ч и я о
о г ■С
□ 5 о
о о о
о СП я
о —1 и о
сп > и ■ - ■ ~1 о
i =1
аз о
i i
S I
- о
ti ^
Ol "g 03 g
m q
I S
=1 о
lío ^ S-3
<£> „ CD
oí ть 1 > jd
CD I
О
i =г
i
g-8 О CD
CO О 03 H
=1 CD
CD
S H
^ о
ТЗ О
q
о ш
5
о ТЗ CD ti
03
"О vi
< О 20
Ь PI
5 i s
; ai u
¡ q 1
^ z g
. аз g И
Ю pe о
-t^ Ч =1
■ H
-<= — О
I СО
Ш 03 03
. ТЗ CD
S "С!
ti аз
CD i
ТЗ S
05 =, ÍS1
03
"" JL
S ê
Ю X
о S ° о
T> s tr
-ÍT e-i —
-si S
M i
x M
=1 ai
о
ш о
CD 5
ID СГ
® о
% g
03
О CD
О =1
CQ S ■< i
-е-
CD I
I
^ CD
S О cd ai
s i
® ю
"O I
03 I
o H
i I
аз 03 i
s i
S I
t
o
ai X
Й ® S тз
¡2 s К)
75 ai
тз тз
s о
3 1
§ ь
§ 3-
о
Ш X
_Q_ CD
-er ТЗ
О CD ТЗ
? К
ш ^
8 ° о в
™ CD I
Ш
г. 05 > i СЛ S
¿ S
I §
CD СО
s
ш S
75 ш
о s ТЗ
ТЗ о
03 ш
5 оз
аз
i S s H CD
03 ТЗ
СО S
0 X
1 CD
M
03
О t Ш 03
CD
03 i
i CD
s H
CD s
СО m
О) >
i
I со
о ю
X I CD
СГ
CD S
^ S
i о
03
I
E s
q -8-
tr s
CD Ol
ТЗ
о
О Ol
i i
s 03
X о
CD H
О tr
H
CD
CD о
^
s
_i
О CD
СГ
pe; о
i CD
аз CD
I
0 s =1 s ТЗ о
-g "S
■S о
CD 75
1 03
Ii
аз ^ ai
J= 03
73 s
S CD
co-1
О
С) 03
f к
со x s
0
1 о
i аз
о о
75 >< О =1 H S (D т; X ТЗ 03 III О 03 s
3 s s
S I 03
H
ai s: О ° Щ
О о ¡
s
СГ
о
0 ш
q
g §
E
1 ^
I 73
s о
o q
ю о
^ §
X
Ci) CD
T3 03
q T3 О Ш ш q „ CD
2, о
СП ТЗ ТЗ о
s ^
£ Ш
S "g 1 I
03 ■ i 03
-, M
О X
ai 5
о g
S i го
С" Kl
"i о
§ s
03 ^
Т §
ТЗ =1 s
5Í -I
■е cd
ТЗ
0 s
[Г
ш
03
1
ТЗ 03
о
H ш о
ТЗ
о
S 0)]3 ш
Q ср
q °
CD О ТЗ
сз\
03
о
ю
CJ 03
сз\ .
-в- О
CD С3\
ТЗ ТЗ
® s
S сз\ -в-1
S CD
О 03
? s
=■ i £ I
03 ТЗ g i !» § (i) я
ТЗ
03 Tri
ц о
Z О)
-1 s
q з=.
g 0)
s Ci)
ь +
s =1
о Cl)
о C3\
o tr
о X C3\ СГ
O CD
03
01 -S
СГ tl
5 ш
i -Ц
о
=1 s 73 -1 Щ ó
q q
о ^ § Ю
CD О
СГ -1-
— о
CO
Ci) CO
Ы
q ¿л
M
о
I ^
03 s
5 >
tl =Г
CD ><
I CO
s К)
аз cd
¥ ?
I §
Я 8 s a\ s
I t
О CD p5
CT s X
Q 5
His
q 3=,
25 í (i
о I CD ч<
СП s
P CO ~ 05
0
a\ о
ТЗ I 03 о „
01 s ТЗ
Q CD S
ш "g f
i ° ^ z q "
X F i
7-1 0)
о
-1- ТЗ
о
о S
03
H X
=1 со
ТЗ
s s
У о
<
H H
о
s s
о
CD H
i s
s CD
аз X
I 03
s i
CD s
Cl) 03
I
о 03
ш
- II
0 -S
a\ о "О
03
01 -г
° 1 03 Ä I CD I
О =1
3 ° 3=1-8
О) 03
Cl) ™
S CD I
3=1 i
Cl) 5 ?"
=■ N a) q
" T3 T3 0)
(V) CD
Ci) s I
ел оз
3 m -, ^ ro
> *< _s.
CO I
С ю CD -a CD v<- О
03 t g
> 3 03
1 i S1
Ol ï i
=■ i S
" CD t s ?
a\ ^ E о S
Q ш OJ
—I -Г
i а 8
-с " 2,
8 ° I
S -g1 о s Ш q
to a\ I о
oí -I " ï ffl i s I CD
¡sä
Oit;
"О
о
to ^
?
Ы H 0-
O
T3
T3
0
CD
1
CD T3 A
о
H S CD о
11 5 Ш
S î
03 g £ —1 I о 03 -
•!<0 s- t H о
Ii
s 8 ^
03 О
аз Q
о СЛ ТЗ 03
CD
аз
ь -5 ^ g ä ш
^ "Р I
о
ТЗ ш ^ ^
О 0) OI i i
g s I
-3 о iE
Ö" -п О
Е о О 1 о ^
q 8 "g
CD I О CD О =1
s "о
g-ê s
3 g 8 -g 8 g ^ 03 ï
Ц =1
X CD
=1
о о
8 СГ
о
I
z
CD CD
s t
CD
s
CD
D
0
1
□ -с S
i ТЗ g pi
1
03 CD
0 S
01 ТЗ 03 со CD аз.
=1 Ш
ТЗ =1
CD ТЗ
s °
О —1
H ТЗ
03 03
8 I
? I
03 I
CD "О
03 о i о s о
ТЗ 03
о
X
q
03 X
I
s s
8 8
CD 03
o\
О
03
О CD
s T3
q i
s s
t I
s о
CD
S О
03 P¡
03
О ■
о 5 q
CD Й ^ Ш
-s
g Ш
1 *
m ® 03 ш
Ci °
О О
0 _
1 о
ц о
^ s
0 й о -О 03 о
1 g^1 s § 8
0 о OlJ ш
03 E
ш s л
^ CD
аз со тз ь ш го
s Ol со CD Ю
m CD »HS
lïM < Î W 5 tr X
1 s ь
Jf -
-< g s
00 S =1
1 8"g
о
СЛ
о о
03 03 =!. i
N 5 CD S сл' "О с/3 о
m 33
-С ш
CD 03
Q ^
Зз S S
TI Cl) 03 ТЗ
I S О 03
Sí Sí s о
en s о
H
еч X M
о и о
s s
Рис. 2. Оценка токсического влияния ксеноперикарда, обработанного консервантами ГА, ДЭЭ, ДЭЭ + ПЭ, на жизнеспособность ММСК
* — р=0,003 при сравнении внутри группы через 24 и 72 ч; # — р<0,01 между группой ГА и подобными эпоксиконсервированными группами
110
105
о 100
о
£
95
90
£ 85
80
* 75
70
—I-1-1-Г-1-1-1-1-1-1-1-1-1-Г-
I
|*# #
¡Т'
У
*# т # И!
■ median ■25-75% 1тлп-тах
шш шшшшооо ООО
-
< <
--о о о о о о с с ч ч + +
о о
0 т
ЧД ЧД
< < & & & &
О О С С
ч ч + +
о о
0 т
*
составила 110 и 105%, через 3 сут — 107 и 102% соответственно.
Жизнеспособность клеток ЕА.1пу926 под влиянием экстракта от СП, обработанного ГА (группа ГА-СП), через 1 сут составила 98%, тогда как в группах ДЭЭ-СП и ДЭЭ + ПЭ-СП — 101 и 99% соответственно. Эта тенденция сохранялась в целом и через 3 сут эксперимента. Следует отметить, однако, что цитотоксичность при обработке свиного перикарда ДЭЭ + ПЭ была статистически значимо (р=0,002) выше по сравнению с экстрактом БП, обработанным тем же методом: жизнеспособность клеток ЕА.1пу926 в этих группах через 72 ч составила 88 и 102% соответственно.
Гораздо меньшие различия цитотоксичности в зависимости от способа обработки биоматериалов наблюдали в культуре ММСК. Статистически значимо более высокая жизнеспособность ММСК через 1 сут была выявлена только в группе ДЭЭ-БП (рис. 2). Жизнеспособность ММСК через 3 сут эксперимента в группах ДЭЭ-БП и ДЭЭ + ПЭ-БП была статистически значимо (р=0,01) выше — 90 и 88% соответственно по сравнению с группой ГА-БП — 78%. Различий по жизнеспособности ММСК между группами ГА-СП, ДЭЭ-СП и ДЭЭ + ПЭ-СП в 1-е сутки не наблюдали.
Через 72 ч жизнеспособность ММСК в группе ГА-СП (75%) была статистически значимо (р=0,01) ниже по сравнению с группами ДЭЭ-СП и ДЭЭ + ПЭ-СП: жизнеспособность клеток в этих группах составила 81%. К 3-м суткам наблюдения жизнеспособность ММСК в группах ГА-БП, ГА-СП, ДЭЭ-СП и ДЭЭ-БП была статистически значимо (р=0,003) ниже в сравнении с 1-ми сутками, в то время как в группах
ДЭЭ + ПЭ-СП и ДЭЭ + ПЭ-БП жизнеспособность в эти сутки была сопоставимой.
При изучении влияния экстрактов перикардов на жизнеспособность фибробластов было установлено, что в группе ГА-БП через 1 сут наблюдения жизнеспособность клеток была статистически значимо (р=0,01) ниже (66%), чем в группах ДЭЭ (84%) и ДЭЭ + ПЭ (91%), однако к 3-м суткам эти различия нивелировались (рис. 3).
При воздействии экстрактов ГА-СП и ДЭЭ-СП жизнеспособность фибробластов в 1-е сутки была выше (р=0,01) по сравнению с соответствующими группами БП. Под влиянием экстракта ДЭЭ + ПЭ-СП жизнеспособность фибробластов составила 78% и была статистически значимо (р=0,02) ниже, чем в группе ДЭЭ-СП (96%). В 1-е сутки эксперимента в группе ДЭЭ-БП жизнеспособность фибробластов составила 84%, что статистически значимо ниже по сравнению с группой ДЭЭ + ПЭ-БП (91%). К 3-м суткам наблюдения жизнеспособность фибробластов практически выравнивается во всех группах вне зависимости от видовой принадлежности перикарда и использованных для его обработки сшивающих агентов.
Следующим этапом работы было изучение влияния экстрактов разных образцов ксеноперикарда на уровень апоптоза и некроза клеток ЕА.1пу926, ММСК и фибробластов. В группах ГА-БП и ГА-СП выявлено статистически значимо большее (р=0,003) количество нежизнеспособных клеток, окрашенных этидиумом бромидом в красный цвет, по сравнению с контролем и другими группами: как через 24 ч, так и через 72 ч наблюдения (рис. 4).
130
[Б 120
о £
о 110
^ 100
g
5 90
80
о
70
CD
* 60
50
р=0,001
р=0,001
Т
# +#
+ 0
0
■ median
■ 25-75% Imin-max
i= LÛ
À
1=1=1=1=1=1=1=1=1=1=1= LÛLÛLÛLÛ LÛQOOOOO
itcooîoîc^ititcocococo
l-CDCDI=l=1-1-CDCDI=l=
^ ^ + +
CD CD CD CD
CD CD CD CD
ci ci ci ci
Рис. 3. Оценка токсического влияния экстрактов ксенопери-карда, обработанного консервантами ГА, ДЭЭ и ДЭЭ + ПЭ, на жизнеспособность фибробластов
* — р=0,01 при сравнении внутри группы через 24 и 72 ч; # — р<0,01 между группой ГА и эпоксиконсер-вированными группами; + — между группами ДЭЭ и ДЭЭ + ПЭ
др а
р е
ч
.о ш
24 ч
ГА ДЭЭ ДЭЭ+ПЭ
□ □ п
Рис. 4. Окраска акридиновым оранжевым + этидиумом бромидом эндотелиальных клеток линии EA.hy926 после добавления экстрактов БП и СП, обработанных различными консервантами
Зеленый цвет — живые клетки, красный цвет — клетки в стадии некроза; *200
др а
р е
о н и в
о
#
////////////ш^^^
32 СТМ i 2021 i том 13 i №4 Н.А. Бондаренко, М.А. Суровцева, А.П. Лыков, И.И. Ким, И.Ю. Журавлева, О.В. Повещенко
Уровень апоптоза и некроза в клетках ЕА^у926, фибробластах, ММСК под влиянием экстрактов перикарда, обработанных консервантами ГА, ДЭЭ, ДЭЭ + ПЭ, % (Ме [01; Q3])
Клетки Контроль Группы
ГА-БП ГА-СП ДЭЭ-БП ДЭЭ-СП ДЭЭ+ПЭ-БП ДЭЭ+ПЭ-СП
1-е сутки
А Н А Н А Н А Н А Н А Н А Н
0 0 21,5 [6,0; 13,0 [4,0; 1,1 [1,1; 2,2 [1,1; 4,2 [0; 0 [0; 0 [0; 0 [0; 0 [0; 0 [0; 0,8 [0,4; 0 [0;
ЕА,Иу926 83,0]*# 23,0]#л* 1,4] 1,4]# 15,0] 1,5]* 1,0] 4,0] 1,9] 0,74] 1,9] 0,4]
3-и сутки
3,7 [3,3; 9,2 [2,7; 0,5 [0,4; 5,2 [2,3; 9,2 [5,8; 10,0 [5,5; 3,3 [2,6; 0 [0; 1,4 [0,4; 0,8 [0; 0,7 [0,6; 2,3 [2,1; 1,7 [0,4; 0 [0;
5,4]* 16,0]* 0,9]л 6,0]# 11,0]*#л 20,0]*# 3,6] 0,6]* 4,2]* 2,3]* 1,0]# 5,4]*+ 3,0] 0,4]
1-е сутки
0 0 5,1 [3,2; 1,0 [0; 1,0 [0,7; 0 2,6 [1,1; 0 0 [0; 0 [0; 1,1 [0; 0 0,6 [0,4; 0,4 [0;
Фибро- 5,3]л 5,0] 1,1]л 17,0]+ 0,4] 0,6] 2,2] 0,6] 0,6]
бласты 3-и сутки
1,7 [1,6; 0 2,0 [0; 28,6 [9,9; 1,2 [0; 6,6 [4,0; 1,8 [1,0; 2,3 [1,6; 0,5 [0,3; 0 [0; 2 [0,9; 0,1 [0; 1,8 [0,6; 0,2 [0;
1,9]* 5,0] 69,0]*# 1,6] 6,6]*# 3,0]+ 2,3]*# 0,9]+ 0,5]+ 3,0] 0,4] 5,2]* 0,4]
1-е сутки
0 [0; 0 0 [0; 1,6 [1,1; 0 [0; 1,4 [1,2; 0 1,6 [1,1; 0,4 [0,1; 1,5 [0,9; 0 0,8 [0,7; 0,1 [0; 1,6 [1,5;
ММСК 2,9] 0,3] 2,5] 0,3] 1,6] 2,2] 0,7] 1,9] 0,9] 0,5] 1,8]
3-и сутки
0,3 [0; 0 [0; 1,8 [1,2; 2,1 [1,0; 0,8 [0,6; 2,9 [2,5; 1,6 [0,5; 0,9 [0,8; 1,5 [1,4; 1,5 [1,4; 1,2 [0; 0,8 [0,3; 0,6 [0,3; 1,1 [0,9;
0,7] 1,6]* 2,4]*л 2,9]# 1,2]л 3,3]*#л 1,9]* 1,1] 1,8]* 1,8] 2,4]* 0,9] 1,6] 2,3]
Примечания: А — апоптоз; Н — некроз; ГА — глутаровый альдегид; ДЭЭ — диглицидиловый эфир этиленгликоля; ДЭЭ + ПЭ — диглицидиловый эфир этиленгликоля и пентаэпоксид; БП — бычий перикард; СП — свиной перикард. Статистическая значимость различий: * — р=0,001 при сравнении значений группы через 24 и 72 ч; # — р<0,03 между подобными группами ГА и ДЭЭ; + — р=0,02 между группами ДЭЭ и ДЭЭ + ПЭ бычьего и свиного перикардов; л — р=0,01 между группами контроля и ГА-БП, контроля и ГА-СП.
Наименьшие статистически значимые различия значений по уровню апоптоза и некроза в клетках ЕА.1пу926 наблюдали в группах ДЭЭ + ПЭ-БП и ДЭЭ-СП в 1-е сутки наблюдения (см. таблицу). Через 72 ч наибольший среди всех групп уровень апоптоза и некроза был выявлен в группе ГА-СП. Что касается ци-тотоксического эффекта эпоксиобработанного БП на клетки ЕА.1пу926, то через 3 сут наблюдения уровень апоптоза был ниже в группе ДЭЭ + ПЭ по сравнению с группой ДЭЭ.
При изучении влияния различных экстрактов на фибробласты установлено, что уровень апоптоза в них через 1 сут статистически значимо (р=0,02) выше в группах ГА-БП и ГА-СП по сравнению с контролем. Кроме того, в группе ДЭЭ-БП уровень апоптоза в фибробластах был статистически значимо (р=0,02) выше в сравнении с группой ДЭЭ-СП как через 24 ч, так и через 72 ч наблюдения. Статистически значимые различия по уровню апоптоза в остальных группах в эти сроки не наблюдались. При этом группы не имели статистически значимых различий по уровню некроза в фибробластах в 1-е сутки. Уровень некроза в группе ГА-БП был статистически значи-
мо выше (р=0,03) в сравнении с группами ДЭЭ-БП и ДЭЭ + ПЭ-БП. В группе ГА-СП уровень некроза в фибробластах также был статистически значимо выше (р=0,02) при сравнении с группами ДЭЭ-СП и ДЭЭ + ПЭ-СП. При сравнении групп во временном интервале установлено, что к 3-м суткам уровень апоптоза в фибробластах статистически значимо (р=0,001) возрастает в группах контроля, ДЭЭ + ПЭ-БП и ДЭЭ + ПЭ-СП, а уровень некроза увеличивается в группах ГА-БП и ГА-СП.
Культура ММСК оказалась более устойчивой к влиянию экстрактов ксеноперикардов. В 1-е сутки наблюдения уровень апоптоза ММСК в контроле и опытных группах был сопоставим. К 3-м суткам он статистически значимо (р=0,01) увеличивается в группах ГА-БП и ГА-СП по сравнению с контролем. Уровень некроза ММСК в 1-е сутки эксперимента статистически значимо (р=0,007) возрастал в группах ГА-БП и ГА-СП по сравнению с контролем. К 3-м суткам уровень некроза в ММСК статистически значимо (р=0,02) увеличился в группе ГА-СП по сравнению с контролем, группами ГА-БП, ДЭЭ-СП и ДЭЭ + ПЭ-СП. Наименьший уровень апоптоза отмечался в
ММСК в группе ДЭЭ + ПЭ-СП в сравнении с другими консервантами.
Обсуждение
В данном исследовании поведена оценка цито-токсического эффекта экстрактов образцов БП и СП, консервированных ГА, ДЭЭ и ДЭЭ + ПЭ, на клетки ЕА.1пу926, ММСК, фибробласты. Результаты показали, что экстракты БП и СП, обработанные ГА, уменьшают жизнеспособность клеток ЕА.1пу926, ММСК и фибробластов. Это позволяет утверждать, что такие экстракты обладают цитотоксическим воздействием на все типы изученных клеток. Необходимо отметить, что оба вида перикарда, обработанных ГА, оказывают сопоставимый цитотоксический эффект на клетки ЕА.1пу926 и ММСК, в то время как на фибробласты экстракты БП оказывают большее токсическое влияние, чем экстракты СП, в первые 24 ч. Цитотоксический эффект БП и СП, обработанных ГА, связан как со свободным ГА, остающимся в биоматериале после отмывки, так и с альдегидными группами, которые остаются несвязанными из-за маскирующего эффекта при ковалентном связывании сшивающего агента с биоматериалом [11-14].
Установлено, что экстракты БП и СП, консервированные ДЭЭ и комбинацией ди- и пентаэпоксидного соединений, не оказывают значительного токсического влияния на клетки ЕА.1пу926, ММСК и фибробласты, поскольку жизнеспособность этих клеток под действием ди- и пентаэпоксидных сшивающих агентов сохраняется на уровне контроля или в среднем снижается на 15%.
Для идентификации механизмов цитотоксического эффекта экстрактов БП и СП был исследован уровень некроза и апоптоза в культурах клеток. Наименьший уровень апоптоза и некроза отмечали в клетках под влиянием экстрактов биоматериала, консервированного эпоксидными соединениями. Полученные нами данные согласуются с данными авторов [11], которые показали, что сшивание коллагеновых материалов эпоксидами приводит к более низкой цитотоксичности, чем их обработка ГА.
Экстракты БП и СП, консервированные ГА, по сравнению с ди- и пентаэпоксидами снижают жизнеспособность культур клеток. Так, к концу срока наблюдения уровень апоптоза под влиянием экстракта БП, обработанного ГА, выше, чем в других группах. Полученные данные о влиянии ГА на уровень апоп-тоза и некроза в клетках также согласуются с результатами предыдущих исследований [14, 15], в которых показано, что в составе ГА обнаруживаются не только ковалентно связанные с тканью альдегиды, но и адсорбированные альдегиды, особенно способствующие снижению жизнеспособности эндотелиальных клеток. Необходимо отметить, что уровень некроза в фибробластах под влиянием ГА увеличился в несколько раз. Полученные нами данные согласуются
с результатами исследования, в котором установлено наличие прямой цитотоксичности ГА на фибробласты in vitro, а также токсичности экстракта БП, обработанного ГА, по данным МТТ-теста [14].
Заключение
По результатам оценки цитотоксичности, определению уровня апоптоза и некроза установлено, что бычий и свиной перикарды, обработанные ди- и пен-таэпоксидами, в условиях in vitro не обладают или обладают крайне низкой цитотоксичностью в отношении эндотелиальных клеток линии EA.hy926, муль-типотентных мезенхимальных стволовых клеток и фибробластов, в то время как глутаровый альдегид оказывает выраженный цитотоксический эффект
Финансирование исследования. Работа выполнена по темам государственного задания №0200592019-0046 и №121032300337-5.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литература/References
1. Alperi А., Hernandez-Vaquero D., Pascual I., Diaz R., Silva I., Alvarez-Cabo R., Avanzas P., Moris C. Aortic valve replacement in young patients: should the biological prosthesis be recommended over the mechanical? Ann Transl Med 2018; 6(10): 183, https://doi.org/10.21037/atm. 2018.02.21.
2. Nojiri C., Okano T., Grainger D., Park K.D., Nakahama S., Suzuki K., Kim S.W. Evaluation of nonthrombogenic polymers in a new rabbit A-A shunt model. ASAIO Trans 1987; 33(3): 596-601.
3. Nishi C., Nakajima N., Ikada Y. In vitro evaluation of cytotoxicity of diepoxy compounds used for biomaterial modification. J Biomed Mater Res 1995; 29(7): 829-834, https://doi.org/10.1002/jbm.820290707.
4. Sung H.W., Hsu H.L., Hsu C.S. Effects of various chemical sterilization methods on the crosslinking and enzymatic degradation characteristics of an epoxy-fixed biological tissue. J Biomed Mater Res 1997; 37(3): 376-383, https://doi.org/10.1002/(sici)1097-4636(19971205)37:3<376:: aid-jbm8>3.0.co;2-i.
5. Lohre J.M., Baclig L., Wickham E., Guida S., Farley J., Thyagarajan K., Tu R., Quijano R.C. Evaluation of epoxy ether fixed bovine arterial grafts for mutagenic potential. ASAIO J 1993; 39(2): 106-113.
6. Trofimov B.A., Zhuravleva I.Yu., Oparina L.A., Sukhikh A.S., Vysotskaya O.V., Borisov V.V., Gusarova N.K. Penta-O-{1-[2-(glycidyloxy)ethoxy]ethyl}-D-glucopyranose: synthesis and application for the preservation of cardiovascular bioprostheses. Russ Chem Bull 2015; 64: 1451-1457, https:// doi.org/10.1007/s11172-015-1031-2.
7. Sung H.W., Hsu C.S., Wang S.P., Hsu H.L. Degradation potential of biological tissues fixed with various fixatives: an in vitro study. J Biomed Mater Res 1997; 35(2): 147-155, https://doi.org/10.1002/(sici)1097-4636(199705)35:2<147::aid-jbm2>3.0.co;2-n.
8. Zhuravleva I.Y., Karpova E.V., Oparina L.A.,
//////////////////////^^^^
34 СТМ I 2021 I том 13 j №4 Н.А. Бондаренко, М.А. Суровцева, А.П. Лыков, И.И. Ким, И.Ю. Журавлева, О.В. Повещенко
Poveschenko O.V., Surovtseva M.A., Titov A.T., Ksenofontov A.L., Vasilieva M.B., Kuznetsova E.V., Bogachev-Prokophiev A.V., Trofimov B.A. Cross-linking method using pentaepoxide for improving bovine and porcine bioprosthetic pericardia: a multiparametric assessment study. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2021; 118: 111473, https://doi.org/10.1016/j. msec.2020.111473.
9. Guo G., Jin L., Jin W., Chen L., Lei Y., Wang Y. Radical polymerization-crosslinking method for improving extracellular matrix stability in bioprosthetic heart valves with reduced potential for calcification and inflammatory response. Acta Biomater 2018; 82: 44-55, https://doi.org/10.1016/j. actbio.2018.10.017.
10. Ribble D., Goldstein N.B., Norris D.A., Shellman Y.G. A simple technique for quantifying apoptosis in 96-well plates. BMC Biotechnology 2005; 5: 12, https://doi.org/10.1186/1472-6750-5-12.
11. Elagin V., Kuznetsova D., Grebenik E., Zolotov D.A., Istranov L., Zharikova T., Istranova E., Polozova A., Reunov D., Kurkov A., Shekhter A., Gafarova E.R., Asadchikov V., Borisov S.M., Dmitriev R.I., Zagaynova A., Timashev P. Multiparametric optical bioimaging reveals the fate of epoxy
crosslinked biomeshes in the mouse subcutaneous implantation model. Front Bioeng Biotechnol 2020; 8: 107, https://doi. org/10.3389/fbioe.2020.00107.
12. Kim S.S., Lim S.H., Cho S.W., Gwak S.J., Hong Y.S., Chang B.C., Park M.H., Song K.W., Choi C.Y., Kim B.S. Tissue engineering of heart valves by recellularization of glutaraldehyde-fixed porcine valves using bone marrow-derived cells. Exp Mol Med 2006; 38(3): 273-283, https://doi. org/10.1038/emm.2006.33.
13. Siddiqui R.F., Abraham J.R., Butany J. Bioprosthetic heart valves: modes of failure. Histopathology 2009; 55(2): 135-144, https://doi.org/10.1111/j.1365-2559.2008.03190.x.
14. Umashankar P.R., Mohanan P.V., Kumari T.V. Glutaraldehyde treatment elicits toxic response compared to decellularization in bovine pericardium. Toxicol Int 2012; 19(1): 51-58, https://doi.org/10.4103/0971-6580.94513.
15. Lopez-Moya M., Melgar-Lesmes P., Kolandaivelu K., de la Torre Hernández J.M., Edelman E.R., Balcells M. Optimizing glutaraldehyde-fixed tissue heart valves with chondroitin sulfate hydrogel for endothelialization and shielding against deterioration. Biomacromolecules 2018; 19(4): 12341244, https://doi.org/10.1021/acs.biomac.8b00077.
