CC BY
22
УДК 616-77.619.616-145
КАЛЬЦИФИКАЦИЯ ЭЛАСТИН-СОДЕРЖАЩИХ КСЕНОГЕННЫХ БИОМАТЕРИАЛОВ: ВЛИЯНИЕ КОНСЕРВАНТОВ И БИСФОСФОНАТОВ
Ирина Юрьевна ЖУРАВЛЕВА1, Мария Борисовна ВАСИЛЬЕВА1, Татьяна Павловна ТИМЧЕНКО1, Елена Викторовна КУЗНЕЦОВА1, Юлия Федоровна ПОЛИЕНКО2-3, Наталия Романовна НИЧАЙ1,
Игорь Алексеевич ГРИГОРЬЕВ12, Александр Владимирович БОГАЧЕВ-ПРОКОФЬЕВ1
1 Национальный медицинский исследовательский центр им. академика Е.Н. Мешалкина Минздрава России
630055, г. Новосибирск, ул. Речкуновская, 15
2 Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН 630090, г. Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 9
3 Новосибирский государственный университет 630090, г.Новосибирск, ул. Пирогова, 2
Цель исследования - гистологическая оценка ранних стадий процесса кальцификации стенок свиной аорты и бычьей яремной вены, консервированных глутаровым альдегидом и диглицидиловым эфиром этиленгликоля и модифицированных аминосодержащими бисфосфоновыми соединениями, в экспериментальной модели подкожной имплантации крысам. Материал и методы. Подкожная имплантация образцов биоматериала крысам на 10, 20 и 30 суток с последующим изучением кальциевых депозитов методом световой микроскопии при окраске по фон Косса. Результаты. Основными субстратами кальцификации ксеноаортальной и ксеновеноз-ной стенок являются эластин и гладкомышечные клетки. Накопление кальция в аорте не зависит от базовой консервации. Обработка диэпоксидом тормозит кальцификацию ксеновены до 30 суток эксперимента. Антикальциевый эффект иммобилизованных бисфосфонатов (памидроновой и 2-(2'-карбоксиэтил-амино)этилиден-1,1-бисфосфоновой кислот) варьирует в зависимости от микроструктуры биоматериалов, способа базовой консервации и химической структуры бисфосфоната.
Ключевые слова: кардиоваскулярные ксенопротезы, глутаральдегид, диэпоксид, антикальциевая обработка, бисфосфонаты, эластин-содержащие ткани.
В составе биопротезов для реконструктивных операций на сердце используют различные материалы: корень свиной аорты, свиной и бычий перикард, клапан-содержащую бычью яремную вену [5]. Все они различны по своей видовой и тканевой принадлежности и, соответственно, -по микроструктуре, составу и соотношению бел-
ков, клеточных компонентов и т.д. Традиционно все ксеногенные материалы для кардиохирургии в процессе изготовления протеза подвергаются поперечной сшивке глутаровым альдегидом (ГА). Хорошо известно, однако, что ГА-обработанные ксеноматериалы после имплантации в организм легко подвергаются кальцификации с выражен-
Журавлева И.Ю. - д.м.н., проф., зав. лабораторией биопротезирования Центра новых технологий, e-mail: [email protected]
Васильева М.Б. - к.м.н., научный сотрудник лаборатории экспериментальной хирургии и морфологии Центра новых технологий, e-mail: [email protected]
Тимченко Т.П. - младший научный сотрудник лаборатории биопротезирования Центра новых технологий, e-mail: [email protected]
Кузнецова Е.В. - стажер исследователь лаборатории биопротезирования Центра новых технологий, e-mail: [email protected]
Полиенко Ю.Ф. - к.х.н., старший научный сотрудник лаборатории азотистых соединений, старший научный сотрудник лаборатории химии свободных радикалов, e-mail: [email protected] Ничай Н.Р. - к.м.н., врач-сердечно-сосудистый хирург кардиохирургического отделения врожденных пороков сердца, e-mail: [email protected]
Григорьев И.А. - д.х.н., проф., зав. лабораторией азотистых соединений; старший научный сотрудник Центра анестезиологии и реаниматологии, e-mail: [email protected]
Богачев-Прокофьев А.В. - д.м.н., руководитель Центра новых технологий, e-mail: [email protected] 28 СИБИРСКИЙ НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ, ТОМ 37, № 6, 2017
ной возрастной закономерностью: чем моложе пациент, тем быстрее и интенсивнее происходит кальциевая дисфунция биопротеза. С целью подавления кальцификации ГА-биопротезов были предложены различные стратегии: обработка спиртами для редукции резидуальных альдегидных групп, сорбция катионов трехвалентных металлов, иммобилизация бисфосфонатов [8, 17]. Наиболее радикальным подходом была замена альдегидного сшивающего агента на эпоксидные соединения, предложенная С. et а1. в 1987 г.
[18]. Следует отметить, что последнее направление не получило клинического внедрения нигде в мире, кроме России. С 1995 г. практически все отечественные клиники получили возможность использовать кардиоваскулярные биопротезы, консервированные диглицидиловым эфиром эти-ленгликоля (ДЭ) [2].
За последние 20 лет клиникой Национального медицинского исследовательского центра им. Е.Н. Мешалкина накоплен большой опыт работы с биопротезами различных моделей, консервированными как ГА, так и ДЭ. Этот опыт показывает, что стратегия замены ГА на ДЭ приводит к снижению риска кальцификации биоматериалов, состоящих преимущественно из коллагена - бычьего перикарда и створок аортального клапана свиньи. Однако элементы протезов, содержащие стенку свиной аорты, накапливают кальций одинаково интенсивно как при ГА-, так и при ДЭ-обработке [1, 12, 13]. Кальциевые дисфункции характерны и для стенки ксеновенозного кондуита СоШ^га, хотя и не являются основной проблемой при использовании этого биопротеза [19].
Процесс кальцификации свиной аортальной стенки и бычьего перикарда хорошо изучен как клинически, так и в эксперименте на мелких и крупных животных [19], тогда как в отношении стенки бычьей яремной вены такие сведения крайне скудны. Оба эти биоматериала содержат большое количество эластина, который, как известно, в незначительной степени реагирует как с альдегидными, так и с эпоксидными консервантами. Кальцификация этого белка зависит не от структуры связей, образованных при поперечной сшивке, а от наличия большого количества сайтов связывания кальция в нативном эластине. Поэтому чем выше концентрация эластина в биоматериале, тем интенсивнее он кальцинируется [9, 21]. В то же время в стенке аорты помимо эластина содержится большое количество глад-комышечных клеток и очень немного коллагена, тогда как в стенке вены коллаген является преобладающим компонентом [3]. В связи с этим можно предполагать, что эффективность различных стратегий, направленных на подавление кальци-
фикации биоматериалов, будет различна для аортальной и венозной стенок.
В настоящей работе исследовали 30-дневную динамику кальцификации данных эластин-содержащих биоматериалов при использовании альдегидного и эпоксидного сшивающих агентов и последующей иммобилизации бисфосфонатов.
Целью работы явилась гистологическая оценка ранних стадий процесса кальцификации стенок свиной аорты и бычьей яремной вены, консервированных глутаровым альдегидом и ди-глицидиловым эфиром этиленгликоля и модифицированных аминосодержащими бисфосфоновы-ми соединениями, в экспериментальной модели подкожной имплантации крысам.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Консервация биоматериалов. Стенку свиного корня аорты (зона синусов и синотубулярного сочленения) и стенку бычьей яремной вены получали из местных убойных цехов. Биоматериал забирали непосредственно после убоя животных, промывали несколько раз 0,9%-м раствором хлорида натрия и тщательно очищали от окружающей соединительной ткани. Консервацию материалов выполняли не позднее чем через 6 ч после убоя. Использовали два метода поперечной сшивки: 1) 0,625%-м раствором глутарового альдегида (0,1М фосфатный буфер, рН 7,4, при комнатной температуре в течение 21 сут) с двукратной сменой раствора - на 2-е и 7-е сут; 2) 5%-м раствором диглицидилового эфира этиленгликоля (0,1М фосфатный буфер, рН 7,4, при комнатной температуре в течение 14 сут) со сменой раствора на 2-е сут. После окончания срока консервации материал подвергали модификации бисфосфоно-выми соединениями либо немодифицированные (контрольные) образцы помещали для хранения в сложный спиртовой раствор [4].
Модификация бисфосфонатами. Для иммобилизации на ГА- и ДЭ-обработанные образцы ксеноаорты и ксеновены использовали бисфос-фоновые кислоты: памидроновую и 2-(2'-кар-боксиэтиламино)этилиден-1,1 -бисфосфоновую (КЭАБФК), синтезированные в Институте органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН (г. Новосибирск). Памидроновая кислота, содержащая в структуре первичный амин, была синтезирована по известной методике [14]; КЭАБФК, содержащая вторичный амин, впервые была синтезирована в 1992 г. [6], но ее биологические эффекты практически не изучены. Иммобилизация бисфосфонатов на биоматериале происходит за счет реакции первичных и вторичных аминов с остаточными альдегидными или эпоксидными
группами, не связавшимися с белками биоматериалов в процессе поперечной сшивки.
Модификацию биоматериала выполняли следующим образом: по окончании срока консервации образцы промывали в течение 60 мин стерильным 0,9%-м раствором NaCl с трехкратной сменой промывочного раствора через каждые 20 мин, после чего погружали в 1,2%-й водно-буферный раствор соответствующего бисфос-фоната (0,1М фосфатный буфер, рН 7,4) на 12 ч при 37 °С. По окончании экспозиции в растворе бисфосфоната образцы, предназначенные для имплантации крысам, промывали стерильным 0,9%-м раствором NaCl в течение 20 мин и помещали для хранения в сложный спиртовой раствор
[4].
Определение содержания иммобилизованных бисфосфонатов. Данное исследование основано на разности концентрации неорганического фосфора в модифицированных бисфосфоната-ми образцах и образцах, консервированных ГА и ДЭ, но не модифицированных (контрольных). Контрольные образцы отмывали от спиртового раствора в течение 20 мин и высушивали. Модифицированные бисфосфонатами образцы непосредственно по окончании модификации промывали стерильным 0,9%-м раствором NaCl в течение 4 ч при 37 °С с 3-кратной сменой промывочного раствора. Затем образцы высушивали до постоянной массы, каждый образец гидро-лизовали при 100 оС в смеси 5 мл 14М HNO3 и 0,2 мл 17M HClO4, упаривали гидролизат до влажных солей и повторно растворяли в 5 мл 10%-й HNO3. Содержание фосфора определяли на атом-но-эмиссионном спектрометре с индуктивно связанной плазмой IRIS Advantage (TJA Solution, США). Содержание иммобилизованного бисфос-фоната ([BP], мкМ/г сухой ткани) рассчитывали по формуле: [BP] = ([P]m - [P]n) / 62 х 1000; где [P]m и [P]n - содержание фосфора (мкг/мг) в модифицированном и немодифицированном материале соответственно.
Подкожная имплантация крысам. Экспериментальные протоколы выполнены в соответствии с этическими принципами, изложенными в директиве Европейского сообщества (86/609/ ЕЕС) и Хельсинкской декларации, а также в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (1977) и одобрены Этическим комитетом Национального медицинского исследовательского центра им. академика Е.Н. Мешалкина МЗ РФ.
В эксперименте использовали 20 крыс-самцов линии Wistar с массой тела 80-90 г. Под сево-флурановым ингаляционным наркозом каждому животному в стерильных условиях выполняли
6 разрезов в области спины (по 3 с каждой стороны от позвоночника); тупым способом формировали из каждого разреза подкожный карман, в который помещали образец биоматериала. Каждый разрез ушивали одним швом. Через 10, 20 и 30 сут животных эвтаназировали сверхдозой ингаляционного анестетика, образцы удаляли из подкожных карманов и фиксировали в 10%-м нейтральном формалине.
Морфологические исследования. Фиксированные в формалине образцы дегидратировали в спиртах и заливали в парафин. Из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 6 мкм. Для выявления депозитов фосфатов кальция использовали окрашивание по фон Косса. Окрашивание проводили по стандартной методике набором 04-170801 Von Kossa method for calcium (Bio-Optica, Италия). По окончании основной окраски срезы докрашивали 1%-м водным раствором эозина в течение 2 мин, дегитратировали, просветляли и заключали под покровное стекло по стандартной методике. Исследование выполняли с использованием светового микроскопа Olympus CX31 (Olympus Corp., Япония) при увеличениях х 40, х 100 и х 400. При гистологическом анализе препаратов оценивали состояние фибриллярных структур (коллагена и эластина), клеточных элементов (гладкомышечные клетки), количество и структуру отложений фосфатов кальция, их расположение по отношению к слоям аортальной и венозной стенок и тканевым элементам.
Статистическая обработка результатов. При выполнении статистического анализа результатов определения иммобилизованных бисфосфонатов использовали значения медиан и меж-квартильного размаха (25-й и 75-й процентили) в каждой серии; достоверность различий между группами определяли с использованием теста Краскела - Уоллиса. Различия между группами считали статистически значимыми приp < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты количественного определения иммобилизованных бисфосфонатов убедительно показали, что оба исследованных соединения фиксируются на биоматериале в диапазоне 1020 мкМ/г сухой ткани (таблица). Следует подчеркнуть, что для венозной стенки способ базовой консервации и химическая структура бисфос-фоната не оказывают влияния на эффективность модификации (р = 0,473), тогда как для стенки аорты содержание иммобилизованного препарата зависит от этих факторов (р < 0,00001). Так, в ГА-консервированной аортальной стенке содержание памидроната в два раза больше
Таблица
Количество иммобилизованных бисфосфонатов (мкМ/г сухой ткани) в стенках свиной аорты и бычьей яремной вены, консервированных ГА и ДЭ
Способ консервации Аорта Вена
ГА + КЭАБФК 10,89 (10,65; 11,45) 21,21 (17,26; 25,16)
ГА + памидронат 20,80 (20,61; 21,45)** 18,23 (16,94; 19,69)
ДЭ + КЭАБФК 14,68 (13,55; 15,81)# 17,74 (16,13; 20,97)
ДЭ + памидронат 19,11 (15,0; 20,32)* 17,90 (15,64; 19,68)
Примечание. Обозначены статистически значимые отличия от величин соответствующих показателей способа консервации «ГА + КЭАБФК» (* - прир < 0,005, ** - прир < 0,00001) и «ГА + памидронат» (# - прир < 0,05).
(р = 0,000009), чем КЭАБФК. В целом при использовании памидроната удается достичь большей модификации аортальной стенки, чем при использовании КЭАБФК. Это может быть связано с тем, что альдегидные группы легче реагируют с первичными аминами, которые содержатся в структуре памидроновой кислоты, нежели с вторичными, которые содержит КЭАБФК. Однако такое объяснение неприменимо к венозной стенке, где степень модификации не зависит от химической структуры бисфосфоната.
Известно, что иммобилизованные на биоматериале бисфосфонаты способны блокировать образование и рост кристаллов фосфата кальция за счет выраженной гемиадсорбции к гидроксиа-патиту. Однако не все бисфосфоновые соединения обладают равной способностью подавлять кальцификацию кардиоваскулярных имплантатов in vivo [21]. Полученные в настоящем исследова-
нии результаты демонстрируют вариабельность динамики процесса кальцификации, связанную как с микроструктурой ксеногенного материала, так и с химической структурой препаратов, использованных для поперечной сшивки и дополнительной модификации.
Так, в стенке свиной аорты уже к 10-м суткам имплантации обнаруживали выраженную кальцификацию - вне зависимости от способа базовой консервации (рис. 1, а, б). Однако в аль-дегид-обработанной ткани, наряду с крупными глыбчатыми кристаллами, наблюдали большое количество мелких пылевидных частиц фосфатов кальция; все они расположены преимущественно между волокнами эластина, в гладкомышеч-ных клетках. В эпоксиконсервированной аорте большинство кристаллов расположено вдоль эластиновых волокон и в перифибриллярном пространстве. Образцы, модифицированные бис-
Ш1 111 i
¡¡¡1 m
Рис. 1. Депозиты фосфатов кальция (коричневого цвета) в удаленных через 10 дней образцах свиной аорты, консервированных ГА (а, в, д) и ДЭ (б, г, е). в, г - модификация КЭАБФК; д, е - модификация памидроновой кислотой. Окраска по фон Косса, исходное увеличение х 100 (а, б) и х 400 (в-е)
Рис. 2. Депозиты фосфатов кальция (коричневого цвета) в удаленных через 10 дней образцах стенки ксе-новены, консервированных ГА (а, в, д) и ДЭ (б, г, е). в, г - модификация КЭАБФК; д, е - модификация памидроновой кислотой. Окраска по фон Косса, исходное увеличение х 400
фосфонатами, кальцинированы в меньшей степени, причем более эффективно блокирует каль-цификацию памидроновая кислота (рис. 1, д, е). Базовая консервация также играет роль: лишь в одном образце аорты, сшитой глутаровым альдегидом и модифицированной памидроновой кислотой, были обнаружены единичные кристаллы фосфата кальция, прочно связанные с волокнами эластина (рис. 1, д). При поперечной сшивке ДЭ бисфосфонаты на этом сроке «защищают» эластин, однако небольшое количество пылевидных частиц кальций-фосфата можно наблюдать в гладкомышечных клетках (рис. 1, г, е).
В те же сроки в стенке бычьей яремной вены, вне зависимости от метода базовой консервации, присутствуют лишь единичные вкрапления фосфатов кальция, и только в эластиновых волокнах (рис. 2, а, б). Модификация бисфосфонатами эффективно защищает на этом сроке данный вид биоматериала (рис. 2, в-е).
Через 20 дней в аортальных имплантатах, обработанных ГА и ДЭ, но не модифицированных бисфосфонатами, очевиден выраженный прогресс кальцификации, протекающий одинаково (рис. 3, а, б). На малых увеличениях отчетливо видно, что в толще tunica media пространство между эластиновыми волокнами заполнено мелкими глобулярными депозитами кальция, а некоторые эластиновые волокна тотально кальцинированы (см. рис. 3, б). На больших увеличениях можно наблюдать, что процесс распространяется
из срединного слоя к поверхностям, постепенно захватывая как эластиновые волокна, так и межфибриллярные структуры (см. рис. 3, а). В образцах, модифицированных КЭАБФК, к 20-м суткам появляются отдельные очаги кальциноза, расположенные в эластиновых волокнах и гладкомышечных клетках (рис. 3, в, г). Вкрапления кальция можно обнаружить в гладкомышечных клетках tunica media аортальной стенки, консервированной ДЭ и модифицированной памидронатом (рис. 3, е). Наиболее устойчив к кальцификации биоматериал, обработанный памидронатом после консервации ГА (рис. 3, д).
Венозная стенка демонстрирует иную картину. Кардинально отличаются от остальных серий ГА-образцы (рис. 4, а), которые содержат большое количество мелкодисперсного и крупноглобулярного кальция, расположенного во всех структурных компонентах - коллагене, эластине и гладкомышечных клетках. ДЭ-ксеновена, а также все группы биоматериала, модифицированного бисфосфонатами, не обнаруживают признаков кальцификации (рис. 4, б-е). Следует отметить, что к 20-м суткам пребывания в организме реципиента ксеновенозная стенка, обработанная по схеме «ГА + бисфосфонат», выглядит более структурно сохранной, чем образцы «ДЭ + бис-фосфонат», где отчетливо видны признаки отека, разрыхления и разволокнения коллагена, частичного лизиса эластиновых волокон и гладкомы-шечных клеток (рис. 4, г, е).
Рис. 3. Депозиты фосфатов кальция (коричневого цвета) в удаленных через 20 дней образцах свиной аорты. Обозначения те же, что и на рис. 1. Исходное увеличение х 40 (д), х 100 (б, в) и х 400 (а, г, е)
Рис. 4. Депозиты фосфатов кальция (коричневого цвета) в удаленных через 20 дней образцах стенки ксено-вены. Обозначения те же, что и на рис. 2. Исходное увеличение х 400
К 30-м суткам можно говорить о тотальном кальцинозе аортальной стенки, сшитой как ГА, так и ДЭ (рис. 5, а, б). Начальные отложения кальция прослеживаются также в образцах, обработанных по схеме «ДЭ + бисфосфонат» (вне зависимости от типа бисфосфоната) (рис. 5, г, е): здесь депозиты наиболее отчетливо прослеживаются в эластиновых волокнах, в перифибрил-лярном пространстве видны мелкие пылевидные частицы фосфатов кальция. Наиболее сохран-
ным выглядит биоматериал, консервированный ГА с дополнительной модификацией памидро-новой кислотой, где кальцинатов не обнаружено (рис. 5, д). Модификация ГА-образцов с использованием КЭАБФК не столь эффективна - к этому сроку отчетливо визуализируется рост «ядра» кальцификации в толще tunica media (рис. 5, в).
В стенке ГА-консервированной вены происходит нарастание массы кристаллов фосфата кальция. Некоторые эластиновые волокна тоталь-
- / т, Г \ и
' ' \\ > к' 141 '■■■
ч * Л ЧГ
I Г м к : 1 ■' к
Рис. 5. Депозиты фосфатов кальция (коричневого цвета) в удаленных через 30 дней образцах свиной аорты. Обозначения те же, что и на рис. 1. Исходное увеличение х 40 (в, д), х 100 (а, б) и х 400 (г, е)
Рис. 6. Депозиты фосфатов кальция (коричневого цвета) в удаленных через 30 дней образцах стенки ксено-вены. Обозначения те же, что и на рис. 2. Исходное увеличение х 400
но кальцинированы, отчетливо видна кальцификация коллагена (рис. 6, а). Образцы, консервированные ДЭ, а также все группы с дополнительной модификацией бисфосфонатами не обнаруживают кальциевых отложений (рис. 6, б-е). Необходимо отметить продолжающуюся структурную деградацию ткани: истончение эластиновых волокон, разволокнение и лизис коллагена; лишь в отдельных образцах сохраняются остатки глад-
комышечных клеток (рис. 6, в, г), отмечается массивная инфильтрация клетками реципиента (рис. 6, б).
На основании полученных результатов можно утверждать, что эластин является основным субстратом кальцификации ксеноаортальной и ксеновенозной стенок, так как именно в эластине обнаруживаются первые отложения фосфатов кальция. Прогрессирование процесса происходит
также за счет гладкомышечных клеток, известных как сильные нуклеаторы кальция [11, 15, 20]. Интенсивность кальцификации аортальной стенки не зависит от выбора агента для поперечной сшивки - процесс протекает одинаково агрессивно при консервации как ГА, так и ДЭ. В отличие от аорты стенка ксеновены, консервированная ДЭ, не подвергается кальцификации в течение 30 сут эксперимента, в то время как при консервации ГА наблюдается массивная кальцификация всех тканевых структур. Ранее нами показано, что на более поздних сроках (60 сут подкожной имплантации) кальциевые депозиты выявляются в эластиновых волокнах ДЭ-обработанной вены [3], поэтому можно предполагать, что эпоксидная консервация не только подавляет кальциноз весьма значительной коллагеновой части данного биоматериала, но и отсрочивает начало кальци-фикации ксеновенозного эластина. Хорошо известно, что биологические протезы, содержащие фрагменты корня свиной аорты, несут высокий риск развития ранней кальцификации, вне зависимости от того, были они консервированы альдегидным или эпоксидным сшивающим агентом [12, 16, 19]. Эти клинические наблюдения совпадают с экспериментальными данными [10, 21]. В то же время для ксеновенозной стенки, сшитой ГА (кондуиты Contegra, Medtronic Inc.), кальци-фикация не является ведущей проблемой, хотя и отмечается у части больных [3, 19]. Таким образом, несмотря на то, что оба исследованных биоматериала являются эластин-содержащими, их кальцификация обусловлена не только наличием эластина как такового, но и, по-видимому, различиями в аминокислотном составе структурных белков и в соотношении компонентов тканевой структуры (коллаген, эластин, гладкомышечные клетки), а также влияниями других факторов микроокружения.
До сих пор остается слабо изученным вопрос об антикальциевой активности бисфосфоновых соединений, иммобилизованных на ксеномате-риале кардиоваскулярных имплантатов. В 19801990-е годы было опубликовано несколько работ, посвященных бисфосфонатной модификации ГА-консервированных тканей, после чего, несмотря на полученные позитивные результаты, интерес к данному направлению угас. Наибольшей популярностью всегда пользовалась пами-дроновая кислота [16, 23] в силу того, что это -достаточно хорошо изученный официнальный препарат; он имеет короткую карбоновую цепь с концевой первичной аминогруппой, которая легко связывается с остаточными группами основного консерванта, всегда присутствующими в биоматериале; центральный атом углерода связан,
помимо двух фосфоновых групп, с гидроксиль-ной группой. Считается, что эта гидроксильная группа усиливает способность бисфосфонатов блокировать кристаллизацию гидроксиапатита [22]. Антикальциевое действие памидроновой кислоты было доказано при иммобилизации ее на ГА-обработанный перикард, но для аортальной стенки она была неэффективна. В связи с этим Н^. Каророй е! а1. предложили использовать для консервации аорты вещества оригинального синтеза: эпоксидное соединение - триглициди-ламин и бисфосфоновое соединение с концевой тиольной группой - 2-меркаптоэтилиден-1,1-бисфосфоновую кислоту (МАВР). Авторы доказали в эксперименте эффективность такого подхода [21]. Примечательно, что МАВР, как и использованная в данном исследовании КЭАБФК, не содержит гидроксила у центрального атома углерода [7]. Однако сочетание эпоксида и бисфосфонатов, использованное в настоящем исследовании, не привело к аналогичному позитивному результату, что еще раз подчеркивает тонкие влияния химической структуры соединений, которыми выполнена консервация и модификация, на кальций-связывающую активность биоматериалов. Максимальный эффект для аортальной стенки в сроки до 30 суток был получен нами при использовании глутарового альдегида и памидроновой кислоты; для ксеновенозной стенки эффективными оказались все методы консервации на основе базовой обработки диэпоксидом, а также оба исследованных бисфосфоната, иммобилизованные на ГА-консервированную ткань. Следует подчеркнуть, однако, что сроки эксперимента в данной работе недостаточны для того, чтобы окончательно судить о кальций-связываю-щем потенциале биоматериалов, обработанных различными методами. На основании полученных данных можно сделать заключение лишь о морфологических характеристиках и сроках начала кальцификации исследованных эластин-содержащих биоматериалов.
ВЫВОДЫ
1. Основными субстратами кальцификации ксеноаортальной и ксеновенозной стенок являются эластин и гладкомышечные клетки.
2. Замена базового консерванта - глутарового альдегида - на диэпоксид не влияет на ранние стадии кальцификации аортальной стенки, тогда как использование диэпоксида для консервации венозной стенки блокирует кальцификацию в сроки до 30 суток.
3. Антикальциевый эффект иммобилизованных бисфосфонатов - памидроновой и 2-(2'-кар-
боксиэтил-амино)этилиден-1,1-бисфосфоновой кислот варьирует в зависимости от микроструктуры биоматериалов, способа базовой консервации и химической структуры бисфосфоната.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант 16-15-10315).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. АстаповД.А., Караськов А.М., СеменоваЕ.И., Демидов Д.П. Протезирование митрального клапана биологическими протезами: непосредственные и отдаленные результаты // Хирургия. 2013. (9). 18-23.
2. Барбараш Л.С., Журавлева И.Ю. Эволюция биопротезов клапанов сердца: достижения и проблемы двух десятилетий // Комплекс. пробл. серд.-сосуд. заболеваний. 2012. (1). 4-11.
3. Журавлева И.Ю., Карпова Е.В., Кузнецова Е.В., Юношев А.С., Коробейников А.А., Тимченко Т.П., Ничай Н.Р., Сойнов И.А., Горбатых А.В. Клапаносодержащий ксеновенозный кондуит: terra incognita или tabula rasa? // Сиб. науч. мед. журн. 2016. (2). 90-101.
4. Журавлева И.Ю. Биоцидная композиция для асептического хранения консервированного протезного материала из тканей животного происхождения. Патент РФ № 2580621; Опубл. 24.11.2014.
5. Кретов Е.И., Козырь К.В., Таркова А.Р., Сер-геевичев Д.С., Коробейников А.А., Тимченко Т.П., Зубарев Д.Д., Зыков И.С., Байструков В.И. Первый опыт траскатерной имплантации прототипа нового самораскрывающегося протеза аортального клапана в эксперименте // Патол. кровообращения и кардиохирургия. 2016. 20. (4). 176-183.
6. Alfer'ev I.S., Mikhalin N.V. Reactions of vinylidenediphosphonic acid with nucleophiles. 4. Addition of amino acids, diastereotopy of phosphorus atoms in the addition products // Bull. Russ. Acad. Div. Chem. Sci. 1992. 41. (9). 1709-1711.
7. Alferiev I.S., Connolly J.M., Levy R.J. A novel mercapto-bisphosphonate as an efficient anticalcification agent for bioprosthetic tissues // J. Organo-metallic Chem. 2005. 690. 2543-2547.
8. Andreas M., Wallner S., Ruetzler K., Wiedemann D., Ehrlich M., Heinze G., Binder T., Moritz A., HiesmayrM.J., KocherA., Laufer G. Comparable long-term results for porcine and pericardial prostheses after isolated aortic valve replacement // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2015. 48. (4). 557-561.
9. Bailey M.T., Pillarisetti S., Xiao H., Vyavaha-re N.R. Role of elastin in pathologic calcification of xenograft heart valves // J. Biomed. Mater. Res. A. 2003. 66. (1). 93-102.
10. Connolly J.M., Bakay M.A., Alferiev I.S., Gorman R.C., Gorman J.H., 3rd, Kruth H.S., Ashworth P.E., Kutty J.K., Schoen F.J., Bianco R.W., Levy R.J. Triglycidyl amine crosslinking combined with ethanol inhibits bioprosthetic heart valve calcification // Ann. Thorac. Surg. 2011. 92. (3). 858-65.
11. Jorge-Herrero E., Garcia Paez J.M., Del Castillo-Olivares Ramos J.L. Tissue heart valve mineralization: Review of calcification mechanisms and strategies for prevention // J. Appl. Biomater. Biomech. 2005. 3. (2). 67-82.
12. Karaskov A., Sharifulin R., Zheleznev S., De-min I., Lenko E., Bogachev-Prokophiev A. Results of the Ross procedure in adults: a single-centre experience of 741 operations // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2016. 49. (5). e97-e104.
13. Karaskov A., Bogachev-Prokophiev A., Sharifulin R., Zheleznev S., Demin I., Pivkin A., Zhuravle-va I. Right ventricular outflow tract replacement with xenografts in Ross patients older than 60 years // Ann. Thorac. Surg. 2016. 101. (6). 2252-2259.
14. Kieczykowski G.R., Jobson R.B., Melillo D.G., Reinhold D.F., Grenda V.J., Shinkai I. Preparation of (4-amino-1-hydroxybutylidene)bisphosphonic acid sodium salt, MK217 (alendronate sodium). An improved procedure for the preparation of 1-hydroxy-1,1,-bisphosphonic acids // J. Org. Chem. 1995. 60. 83108312.
15. Liu J., Zhong S., Lan H., Meng X., Zhang H., Fan Y., Wang Y., Wang C., Wang Z. Mapping the calcification of bovine pericardium in rat model by enhanced micro-computed tomography // Biomaterials. 2014. 35. (29). 8305-8311.
16. Mery C.M., Guzmán-Pruneda F.A., De León L.E., Zhang W., Terwelp M.D., Bocchini C.E. et al. Risk factors for development of endocarditis and reintervention in patients undergoing right ventricle to pulmonary artery valved conduit placement // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2016. 151. (2). 432-439.
17. Nimni M.E., Ertl D., Villanueva J., Nimni B.S. Inhibition of ectopic calcification of glutaraldehyde crosslinked collagen and collagenous tissues by a covalently bound diphosphonate (APD) // Am. J. Cardiovasc. Pathol. 1990. 3. (3). 237-45.
18. Nojiri C., Okano T., Grainger D., Park G.K., Nakahama S., Suzuki K., Kim S.W. Evaluation of nonthrom-bogenic polymers in a new rabbit A-A shunt model // ASAIO Trans. 1987. 33. 596-601.
19. Ong K., Boone R., Gao M., Carere R., Webb J., Kiess M., Grewal J. Right ventricle to pulmonary artery conduit reoperations in patients with tetralogy of fallot or pulmonary atresia associated with ventricular septal defect // Am. J. Cardiol. 2013. 111. (11). 1638-1643.
20. Paule W.J., Bernick S., Strates B., Nimni M.E. Calcification of implanted vascular tissues associated with elastin in an experimental animal model // J. Biomed. Mater. Res. 1992. 26. (9). 1169-1177.
21. Rapoport H.S., Connolly J.M., Fulmer J., Dai N., Murti B.H., Gorman R.C., Gorman J.H., Alferiev I., Levy R.J. Mechanisms of the in vivo inhibition of calcification of bioprosthetic porcine aortic valve cusps and aortic wall with triglycidylamine/ mercapto bisphosphonate // Biomaterials. 2007. 28. (4). 690-699.
22. Van Gelder J.M., Breuer E., Schlossman A., Ornoy A., Monkkonen J., Simila J., Klenner T.,
Stadler H., Krempien B., Patlas N., Golomb G. In vitro and in vivo effects of tetrakisphosphonates on bone resorption, tumor osteolysis, ectopic calcification, and macrophages. // J. Pharm. Sci. 1997. 86. (3). 283-9.
23. Webb C.L., Schoen F.J., Levy R.J. Covalent binding of aminopropane-hydroxydiphosphonate to glutaraldehyde residues in pericardial bioprosthetic tissue: stability and calcification inhibition studies // Exp. Mol. Pathol. 1989. 50. 291-302.
CALCIFICATION OF ELASTIN-CONTAINING XENOGENIC BIOMATERIALS: INFLUENCE OF CONSERVANTS AND BISPHOSPHONATES
Irina Yurevna ZHURAVLEVA1, Mariya Borisovna VASILIEVA1, Tatyana Pavlovna TIMCHENKO1, Elena Viktorovna KUZNETSOVA1, Yuliya Fedorovna POLIENKO2-3, Nataliya Romanovna NICHAY1, Igor Alekseevich GRIGORYEV1-2, Aleksandr Vladimirovich BOGACHEV-PROKOFIEV1
1 E.Meshalkin NMRC of Minzdrav of Russia 630055, Novosibirsk, Rechkunovskaya str., 15
2 Novosibirsk Institute of Organic Chemistry n.a. N.N. Vorozhtsov of SB RAS 630090, Novosibirsk, Academician Lavrentiev av., 9
3 Novosibirsk State University 630090, Novosibirsk, Pirogov str., 2
Objective: Histological evaluation of early stages of calcification of the walls of the porcine aorta and bovine jugular veins preserved with glutaraldehyde and diglycidyl ether of ethylene glycol and modified with amino-containing bisphosphonic compounds in the experimental model of subcutaneous implantation to rats. Materials and methods: subcutaneous implantation of biomaterial samples to rats for 10, 20 and 30 days with subsequent study of calcium deposits by light microscopy using Von Kossa staining. Results: Elastin and smooth muscle cells are the main substrates for the calcification of xeno-aortic and xenovenous walls. The accumulation of calcium in the aorta does not depend on the basic preservation. Treatment with a diepoxide inhibits the calcination of xenobium up to 30 days of the experiment. The anticalcium effect of immobilized bisphosphonates-pamidron and 2- (2'-carboxyethyl-amino) ethylidene-1,1-bisphosphonic acids varies depending on the microstructure of the biomaterials, the basic preservation method and the chemical structure of the bisphosphonate.
Key words: cardiovascular xenoprosthesis, glutaraldehyde, diepoxide, anticalcium treatment, bisphosphonates, elastin-containing tissues.
Zhuravleva I.Yu. - doctor of medical sciences, professor, head of the laboratory of bioprosthetics of the center for new technologies, e-mail: [email protected]
Vasilieva M.B. - candidate of medical sciences, researcher of laboratory of experimental surgery and morphology of center for new technologies, e-mail: [email protected]
Timchenko T.P. - junior researcher of laboratory for orthotics of the center for new technologies, e-mail: [email protected]
Kuznetsova E.V. - intern researcher of laboratory for orthotics of the center for new technologies, e-mail: [email protected]
Polienko Yu.F. - candidate of chemical sciences, senior researcher laboratory of nitrogen compounds, senior researcher of the laboratory offree radical chemistry, e-mail: [email protected] Nichay N.R. - candidate of medical sciences, cardiovascular surgeon of cardiosurgical department of congenital heart diseases department, e-mail: [email protected]
Grigoriev I.A. - doctor of chemical sciences, professor, head of laboratory for nitrogen compounds, senior researcher of the center of anesthesiology and emergency medicine, e-mail: [email protected] Bogachev-Prokofiev A.V. - doctor of medical sciences, head of center of new technologies, e-mail: [email protected]
