CC BY
18УДК 57.085.23
Сыромятникова Д.С.
лаборант-исследователь Отдел ботанических исследований Института биологических проблем криолитозоны ЯНЦ СО РАН (г. Якутск, Россия)
Егоров А.Н.
инженер - исследователь Лаборатория медицинских биотехнологий Медицинский институт Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова
(г. Якутск, Россия)
Гольдерова А.С.
доктор медицинских наук, профессор кафедра "Организация здравоохранения и профилактическая медицина"
Медицинский институт Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова
(г. Якутск, Россия)
ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ ЭКСТРАКТА INONOTUS OBLIQUUS (PERS.) PIL. ПО ОТНОШЕНИЮ К ЛИНИИ РАКОВЫХ КЛЕТОК HELA
Аннотация: в работе получены культуры раковых клеток HeLa и здоровых фибробластов человека, проведен МТТ-анализ цитотоксичности экстракта гриба чаги. Выявлено что на степень цитотоксичности чаги влияет качество используемого сырья -применение некачественных продуктов, препаратов из чаги способно вызвать
цитотоксический эффект на нормальные клетки, при этом не вызывая такой же эффект на раковые клетки. Результаты работы и полученные данные имеют значение для дальнейших исследований в области клеточной биологии, фармакологии, а также смежных дисциплин.
Ключевые слова: HeLa, фибробласты, гриб чага, противоопухолевый эффект.
Трутовик скошенный/чага оЬ^иш (Реге.) РИ.) - паразитический
гриб отдела Базидиомицеты, растущий на берёзах. Различные препараты из чаги широко применяются в народной медицине, однако их эффективность не имеет достаточного количества научных доказательств.
По данным производителей препараты обладают следующей фармакодинамикой: регуляция метаболических процессов, повышение общей резистентности организма, общетонизирующее действие. Среди показаний для применения указаны хронический гастрит, дискинезии ЖКТ, также предлагают употреблять препараты для симптоматического лечения при онкологических заболеваниях. К примеру, препарат «Бефунгин» показан при лечении запущенных форм рака IV стадии как симптоматическое средство.
Некоторые авторы выявили цитотоксический эффект некоторых веществ, входящих в состав препаратов. В их число входят тритерпеноиды лупанового ряда: бетулин, бетулиновая и бетулоновая кислоты; также тритерпеноиды ланостанового ряда, среди которых выделяют инотодиол.
Противоопухолевая активность проявляется через цитотоксическое или цитостатическое действие. Цитостатическое действие выражается в нарушении процессов роста, развития, механизма деления клеток, что вызывает апоптоз. При этом апоптозу подвергаются в основном клетки с высоким митотическим индексом. Цитотоксическое действие заключается в повреждении компонентов клеток, которое приводит к некрозу и клеточной смерти.
Поиск и создание эффективных лекарственных противоопухолевых препаратов является актуальной задачей в современной науке. Исследование противоопухолевого эффекта 1попо^ оЬ^иш позволяет дополнить имеющиеся
данные о целебных свойствах гриба, что способствует дальнейшему изучению проблемы.
Цель ислеоания: изучение цитотоксического эффекта экстракта Inonotus obliquus на линию раковых клеток HeLa.
Материалы и методы. Для сравнения цитотоксического эффекта препарата по отношению к нормальным клеткам и клеткам HeLa были выбраны фибробласты человека. Линия раковых клеток HeLa приобретена у ООО «Биолот». Культивирование проводилось по стандартному протоколу. Выбор обусловлен тем, что нормальные фибробласты, сохраняющие на протяжении всего срока культивирования постоянный диплоидный набор хромосом и характерную морфологию, являются одной из наиболее перспективных тест-систем для биохимико-токсикологических исследований in vitro. Фибробласты были получены добровольно от пациента для научных исследований. Перед получением биоматериала у пациента Х было получено информированное согласие на взятие биоптата и его дальнейшее использование в научных целях, на публикацию научных статей. Транспортировали биоптат в неполной среде DMEM/F12 (Биолот) с 1% содержанием антибиотика-антимикотика (Glibco).
Исследуемый реагент: водный экстракт чаги. Изготовитель: ООО «ЗПК Северная Заимка». Состав: 100% отвар чаги берёзовой, полученный методом вакуумной низкотемпературной варки.
Были изготовлены растворы в разных соотношениях: 1:5 (20%), 1:10 (10%). Также использован экстракт без разведения.
Определение жизнеспособности клеток проводилось с помощью МТТ-анализа с использованием стандартного протокола для проверки процентной жизнеспособности клеток HeLa и фибробластов после обработки экстрактом чаги. Подсчёт клеток проводили на I этапе МТТ-теста с помощью камеры Горяева. Статистический анализ проводился с использованием программы SPSS 23.0 (разработчик StatSoft.Inc). Для сравнения независимых совокупностей ввиду
отсутствия признаков нормального распределения данных использовался и-критерий Манна-Уитни.
Результаты МТТ-анализа был представлен в виде следующего графика на Рис.1. Как видно на графике, на оси X отложены контрольные и опытные пробы клеток, на оси Y - оптическая плотность проб. Первые 4 графики представляют фракцию фибробластов, следующие 4 - фракцию раковых клеток HeLa.
Рис.1. Показатели оптической плотности контрольных и опытных проб.
Наибольшее отклонение от показателя контрольной пробы показала проба фибробластов с добавлением экстракта чаги в концентрации 1:1. Выявлен цитотоксический эффект экстракта чаги по отношению к фибробластам человека (Р=0,000; Р=0,003) (Табл.1). Показатели проб раковых клеток HeLa не имеют статистически значимых различий с контрольной пробой.
Таблица 1. Сравнения медиан экспериментальных групп с контрольной
Проба Соотношение экстракт чаги/общий объём раствора Статистическая значимость
Контроль фибробласты 1/1 Р=0,000
Контроль фибробласты 1/5 Р=0,003
Контроль фибробласты 1/10 Р=0,003
Контроль HeLa 1/1 Р>0,5
Контроль HeLa 1/5 Р>0,5
Контроль ИеЬа 1/10 Р>0,5
Несмотря на результаты других авторов, в которых подтверждается цитотоксичность экстракта по отношению к раковым клеткам, в данной работе данный эффект не выявлен. Полученные данные показали обратный результат -показатели проб раковых клеток HeLa не имеют статистически значимых различий с контрольной пробой (Р>0,5). После обработки клеток экстрактом чаги процентная жизнеспособность снизилась на 4,68%, 7,02% и 7,01% при концентрациях экстракта 100%, 20% и 10% соответственно. По результатам анализа было установлено, что водный экстракт чаги проявляет цитотоксичность по отношению к здоровым фибробластам (Р=0,000; Р=0,003). После обработки клеток экстрактом чаги процентная жизнеспособность снизилась на 46,97%, 25,76% и 29,79% при концентрациях экстракта 100%, 20% и 10% соответственно. Разность процентной жизнеспособности клеток HeLa и фибробластов составляет 42,29%, 18,74% и 22,78% при концентрациях экстракта 100%, 20% и 10% соответственно.
Таким образом, предположительно на степень цитотоксичности экстракта чаги влияет качество используемого сырья - применение некачественных продуктов, препаратов из чаги способно вызвать цитотоксический эффект на нормальные клетки, при этом не вызывая такой же эффект на раковые клетки. Это открывает новые перспективы для изучения биохимических и физиологических свойств чаги.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Lemieszek MK. Anticancer effects of fraction isolated from fruiting bodies of Chaga medicinal mushroom, Inonotus obliquus (Pers.:Fr.) Pilat (Aphyllophoromycetideae): in vitro studies [Electronic resource] / MK Lemieszek, E Langner, J Kaczor [et al.] / Int J Med Mushrooms. 2011;13(2): 131-43.
2. National Center for Microscopy and Imaging Research. Scanning electron micrograph of an apoptotic HeLa cell. Zeiss Merlin HR-SEM. ID 3519.
3. Баландайкин М.Э. К вопросу об изучении химической структуры и лечебных свойств Inonotus obliquus (Pers.) Pil / М.Э. Баландайкин — Текст : электронный // Химия растительного сырья. - 2013. - №2.
4. Государственная фармакопея Российской Федерации, XIV издание, Том IV - Текст : электронный. URL: https://docs.rucml.ru/feml/pharma/v 14/vol4/1385/ (дата обращения: 8.12.2022).
5. Казакова О.Б. Синтез и гепатопротекторная активность производных бетулина и диптерокарпола / О. Б. Казакова, И. Е. Смирнова, Н. И. Медведева [и др.] - Текст : электронный // Биоорганическая химия. - 2019. - Т. 45, № 6. - С. 664-672.
6. Кузнецова О.Ю. Обзор современных препаратов с биологически активными композициями березового гриба Чага / О. Ю. Кузнецова - Текст: электронный // Разработка и регистрация лекарственных средств. - 2016. - №
1(14).
Syromyatnikova D.S.
Institute for Biological Problems of Cryolithozone YSC SB RAS
(Yakutsk, Russia)
Egorov A.N.
North-Eastern Federal University. M.K. Ammosova (Yakutsk, Russia)
Golderova A.S.
North-Eastern Federal University. M.K. Ammosova (Yakutsk, Russia)
CYTOTOXICITY OF THE EXTRACT OF INONOTUS OBLIQUUS (PERS.)
PIL. IN RELATION TO THE HELA CANCER CELL LINE
Abstract: in the work, cultures of HeLa cancer cells and healthy human fibroblasts were obtained, and an MTT analysis of the cytotoxicity of the chaga fungus extract was carried out. It was revealed that the degree of chaga cytotoxicity is affected by the quality of the raw materials used -the use of low-quality products, preparations from chaga can cause a cytotoxic effect on normal cells, while not causing the same effect on cancer cells. The results of the work and the data obtained are important for further research in the field of cell biology, pharmacology, as well as related disciplines.
Keywords: HeLa, fibroblasts, chaga mushroom, antitumor effect.
