Цитотоксическая активность т-2 токсина к перевиваемым культурам клеток эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

DOI: 10.23868/201703006

цитотоксическая Активность т-2 токсинд

к ПЕРЕВИВАЕМЫМ КУЛЬТУРАМ КЛЕТОК ЭПИТЕЛИЯ ЛЕГКОГО ЭМБРИОНА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

И.И. Идиятов 1, Л.Р. Валиуллин 1, В.В. Бирюля1, Н.Г. Шангараев 1, И.С. Рагинов 2, М.Я. Тремасов 1, М.В. Лекишвили 3, А.И. Никитин 1

1 Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности, Казань, Россия

2 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия

3 Центральный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова, Москва, Россия

Cytotoxic activity of T-2 toxin for a immortalized of cattle fetal lung epithelium cells

I.I. Idiyatov1, L.R. Valiullin 1, V.V. Biryulya 1, N.G. Shangaraev1,1.S. Raginov 2, M.I. Tremasov1, M.V. Lekishvili3, A.I. Nikitin 1

1 Federal Center of Toxicological, Radiological and Biological Safety, Kazan, Russia

2 Kazan State Medical University, Kazan, Russia

3 N.N. Priorov Central Research Institute of Traumatology and Orthopedics, Mosmw, Russia

Продуцируемый микроскопическими плесневыми грибами Т-2 токсин обладает высокой токсичностью и индуцирует апоптоз в клетках различных тканей. Цель работы — изучение цитотоксического действия Т-2 токсина на перевиваемые клетки эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота. Клетки культивировали в питательной среде, содержащей Т-2 токсин в концентрациях 6000, 3000, 2000, 1000, 500, 100, 50 и 25 нг/мл в течение 20 ч. Цитотоксическое действие Т-2 токсина оценивали по морфологическим параметрам, пролиферативной активности, выживаемости клеток. Установлено, что изменения морфологии и пролиферативной активности клеток, а также их выживаемость зависят от концентрации Т-2 токсина. Высокие дозы токсина препятствовали формированию монослоя клеток, подавляли пролиферацию, приводили к изменению их формы, фрагментации и высокому уровню гибели путем апоптоза. В дозе 100 нг/мл монослой был слабо выражен, при 50 нг/мл встречались участки со слабыми клеточными контактами. При концентрации 25 нг/мл токсин не оказывал существенного воздействия на изучаемые параметры. Данные морфологического анализа подтверждались результатами цитометрии, оценки пролиферативной и мито-тической активности, цитотоксичности.

Ключевые слова: Т-2 токсин, клетки эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота, морфология, цитоме-трия, выживаемость, пролиферация, митотическая активность, цитотоксичность.

Введение

Среди фузариотоксинов, относящихся к токсинам микроскопических грибов, Т-2 токсин обладает наиболее сильным патогенным действием [1, 2]. Поступление его в организм возможно различными путями, он легко проникает во все типы клеток, оказывает влияние на многие органы и системы, приводя к развитию общих и местных патологических реакций. Воздействие на молекулярном уровне осуществляется через ингибирование синтеза протеинов, нуклеиновых кислот, транспортной системы митохондрий, синтеза митохондриальных белков [3—5], повреждение хроматина [6], инициирование окислительных процессов, запуск апоптоза в клетках

e-mail: [email protected]

T-2 toxin produced by microscopic fungi induces apoptosis in cells of various body tissues. The purpose of this study was to assess T-2 toxin cytotoxic effect on fetal calf lung epithelium cells. Cells were cultured in a nutrient medium containing T-2 toxin at a concentration of 6000, 3000, 2000, 1000, 500, 100, 50 and 25 ng/ml for 20 hours. The cytotoxic effect of T-2 toxin was assessed by morphological parameters, proliferative activity and cell survival. It was found that the changes in morphology, proliferation, mitotic activity of cells, as well as their survival depended on the concentration of T-2 toxin. High doses of the toxin prevented the cells to form a monolayer, suppressed proliferation, led to changing of their shape, fragmentation and the high level of apoptosis. At doses of 50 and 100 ng/ml monolayer poorly occurred. At a concentration of 25 ng/ml, the toxin had no significant effect on the studied parameters. Morphological analysis was confirmed by cytometry, results of evaluation of proliferative and mitotic activity, cytotoxicity.

Keywords: T-2 toxin, fetal calf lung epithelium cells, morphology, cytometry, survival, proliferation, mitotic activity, cytotoxicity.

различных тканей [7—11]. По данным ряда авторов при пероральном [1, 12—14] или ингаляционном [15] поступлении в организм Т-2 токсина, наряду с развитием системных эффектов, отмечаются и локальные изменения в дыхательной системе. Эпителий дыхательных путей является барьером для макромолекул и инфекционных агентов и его повреждение в зависимости от степени выраженности может стать причиной развития как инфекционных заболеваний, так и острых жизнеугрожающих состояний. Таким образом, проведение исследований по выявлению характера воздействия Т-2 токсина на клетки дыхательной системы актуально. В литературе описаны эффекты Т-2 токсина на фибробласты легких У79

[7], альвеолярные макрофаги (PAM) [16], однако данных по влиянию Т-2 токсина на клетки эпителия нами не обнаружены.

Цель работы — изучение токсического действия Т-2 токсина на перевиваемые клетки эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота (ЛЭК).

Материал и методы

Клеточная культура

Работа выполнена на культуре ЛЭК, предоставленной Специализированной коллекцией перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК (ВИЭВ, Россия). Клетки культивировали в питательной среде DMEM (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Gibco, США), 0,5% цэфтриаксона (Синтез, Россия) и 0,5% L-глутамина (Gibco, США) в СО2-инкубаторе MCO-19AIC (Sanyo, Япония) при 5% СО2, 95% влажности, температуре 37°С.

Для экспериментальной контаминации клеток использовали кристаллический Т-2 токсин, синтезированный в лаборатории микотоксинов ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» А.И. Сергейчевым, который растворяли в этиловом спирте.

Идентификация Т-2 токсина

Идентификацию Т-2 токсина проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) в системе высокого разрешения HPLC-Dionex UltiMate 3000 RSLC MS/ MS Bruker ESI-(Qq) TOF maxis II System (Bruker, Германия). Хроматографическое разделение осуществляли на обратно-фазной колонке ACClaim RSLC 120 C18, 2,2 um, 120 A°, 2,1x100 mm с предколонкой VanGuard (Thermo scientific, Германия): Acquity UPLC BEN C18 1,7 um, 2,1x5,0 mm. Фракции элюировали буферными растворами: раствор А — метанол/вода (10:90) с 5 мМ формиата аммония и 0,01% муравьиной кислоты; раствор В — метанол с 5 мМ формиата аммония. Параметры МС анализа: ионный источник — электроспрей по положительным ионам; напряжение на капилляре 4500 v. Сканирование спектров проводили в двух режимах: MС и MС/MС (bbcid) в диапазоне масс 30—1000 m/z. Результаты исследования приведены на рис. 1.

Оценка токсического эффекта Т-2 токсина

на культуру клеток ЛЭК

Клеточную суспензию в концентрации 2,5x105 кл/ мл питательной среды (ПС) разливали по 200 мкл в лунки стерильного 96-луночного культурального планшета (Eppendorf AG, Германия). Т-2 токсин, растворенный в 96% этиловом спирте, вносили в количестве 6 мкл в дозах 6000; 3000; 2000; 1000; 500; 250; 100; 50 и 25 нг/мл. В качестве контрольных групп служили интактные клетки, культивированные в ПС (контроль 1), а также клетки, инкубированные в среде 6 мкл 96% этилового спирта без токсина (контроль 2). Количество повторов в каждой группе — 8. Клетки выдерживали в СО2-инкубаторе (5% СО2, 95% влажности, 37°С) в течение 20 ч.

Оценка морфологии клеток

Морфологию клеточных культур оценивали под инвертированным микроскопом Nikon Eclipse TS 100 (Япония), использовали камеру DCM 500 и программное обеспечение Scope Photo 3.0. Клеточный монослой охарактеризовывали по покрытию поверхности лунки, форме клеток, наличию погибших клеток и клеточных агрегатов.

Оценка цитотоксичности

Клетки диспергировали смесью растворов версе-на (0,02%) и трипсина (0,025%) (ПанЭко, Россия) в соотношении 1:9 и выдерживали в термостате 10—15 мин. при 37°С. Для прекращения действия трипсина и версена клетки осаждали центрифугированием в течение 2 мин. при 1500 об/мин., надо-садочную жидкость сливали, осадок перемешивали с 200 мкл питательной среды. Подсчет клеток осуществляли в камере Горяева, для определения их жизнеспособности к клеточной суспензии добавляли 200 мкл 0,5% водного раствора трипанового синего (живые клетки оставались бесцветными, мертвые окрашивались в синий цвет).

Воздействие токсина на клетки определяли по следующим параметрам: коэффициенту жизнеспособности — отношение количества живых клеток к общему количеству клеток, %; индексу пролиферации — отношение количества «выросших» клеток к исходному количеству; митотическому индексу — отношение количества митотически делящихся клеток к общему количеству клеток, %о [17]; индексу цитотоксичности по Л.П. Дьяконову — отношение количества исходных клеток к числу живых клеток к концу эксперимента [17]; цитотоксическому индексу по М.В. Тертичной — отношение количества живых клеток в тестовой группе к числу живых клеток в контроле [18, 19]; цитотоксическому индексу по Г.П. Червонской — отношение разницы между долями погибших клеток в контроле и тестовой группе к доле погибших клеток в контроле [20].

Статистический анализ

Статистическую обработку результатов осуществляли методом вариационной статистики с применением критерия достоверности по Стьюденту и программы Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение

Оценка морфологических параметров клеток является важным критерием при исследовании воздействия на клеточные популяции различных веществ. При культивировании клеток в среде, содержащей токсин в дозах 6000, 3000, 2000, 1000 и 500 нг/мл (рис. 2 и 3) большинство клеток имели измененную форму по сравнению с контролем, клетки конденсировались, уменьшались в размерах, были обособлены, монослой отсутствовал, наблюдалась фрагментация клеток, большое количество неоформленных клеточных агрегатов, дебриса и апоптозных тел. Такая морфологическая картина свидетельствует о подавлении процесса деления и высоком уровне клеточной гибели. При снижении концентрации токсина до 100 нг/мл клеточных агрегатов и дебриса становилось меньше, а клетки начинали образовывать монослой (рис. 4).

Рис. 1. Результаты высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии Т-2 токсина

Рис. 2. Клетки линии ЛЭК при культивировании в течение 20 ч. в среде йМЕМ, содержащей Т-2 токсин в дозе 6000 нг/мл:

К — специфическое сжатие клетки и конденсация хроматина; Ф — фрагментация ядра; А — фрагментация клетки на ряд апоптотических телец; Д — дебрис. Ув. х400

Рис. 3. Клетки линии ЛЭК при культивировании в течение 20 ч. в среде йМЕМ, содержащей Т-2 токсин в дозе 1000 нг/мл:

К — специфическое сжатие клетки и конденсация хроматина; Ф — фрагментация ядра; А — фрагментация клетки на ряд апоптотических телец; Д — дебрис. Ув. х400

Рис. 4. Клетки линии ЛЭК при культивировании в течение 20 ч. в среде йМЕМ, содержащей Т-2 токсин в дозе 100 нг/мл: КА — клеточные агрегаты; Фпк — фибробластоподобные клетки; М — митотически делящаяся клетка; К — специфическое сжатие клетки и конденсация хроматина; Ф — фрагментация ядра; А — фрагментация клетки на ряд апоптотических телец; Д — дебрис. Ув. х400

Рис. 5. Клетки линии ЛЭК при культивировании

в течение 20 ч. в среде йМЕМ, содержащей Т-2

токсин в дозе 25 нг/мл:

ЦПМ — цитоплазматическая мембрана;

В — вакуолизация цитоплазматической мембраны;

ЦП — цитоплазма;

Я — ядро; ЯР — ядрышко;

М — митотически делящаяся клетка. Ув. х400

При концентрации токсина 50 нг/мл, несмотря на наличие участков со слабыми клеточными контактами, монослой был достаточно хорошо выражен, а форма клеток была эпителиоподобной, большинство клеток имело выраженную цитоплаз-матическую мембрану и ядро. В лунках, содержащих Т-2 токсин в дозе 25 нг/мл (рис. 5), так же, как в контрольных лунках, клетки образовывали полный монослой, имели четко очерченную мембраной цитоплазму, ядро с ядрышками, вакуолизацию плазмолеммы. Таким образом, Т-2 токсин в дозах от 50 до 6000 нг/мл оказывал дозозависимое цитотоксическое действие на клетки эпителия легкого. Т-2 токсин в дозе 25 нг/мл не оказывал негативного влияния на клетки ЛЭК.

Гибель клеток под воздействием Т-2 токсина посредством апоптоза не зависит от происхождения и специализации клеток, что доказывают результаты исследований ряда авторов на человеческих клетках нейробластомы (КМС-32) [21], эмбриональных

стволовых клетках й3 и фибробластах 3Т3 [22], клетках карциномы толстой кишки человека и эпите-лиоцитах проксимальных почечных канальцев [23], репродуктивных клетках Лейдига ТМ-3 [10], тимо-цитах [24], хондроцитах [8].

Важным проявлением жизнеспособности клеток является их пролиферация, выражающаяся в увеличении количества клеток в культуре [25]. Культивирование клеток эпителиоцитов в среде с Т-2 токсином в дозах от 50 до 6000 нг/мл приводило к снижению их абсолютного количества, которое составляло от 8,33 до 43,53%, уменьшение количества при дозе 25 нг/мл было незначительным (2,35%) и сопоставимо с контролем 2 (1,36%). Снижение количества клеток в контроле 2 могло быть связано с действием растворителя — этилового спирта.

Для оценки степени воздействия Т-2 токсина на ЛЭК были рассчитаны коэффициент жизнеспособности (табл. 1), индекс пролиферации, митотиче-ский индекс и индекс цитотоксичности (табл. 2)

Таблица 1. Жизнеспособность клеток линии лЭК при культивировании в присутствии Т-2 токсина в течение 20 ч.

Группа Доза Т-2 токсина, нг/мл Количество живых клеток Количество погибших клеток Коэффициент жизнеспособности

ПС (контроль 1) - 600,00±17,68 108,33±10,21 85,24±1,22

ПС+С2Н5ОН (контроль 2) - 590,33±10,21 108,33±10,21 84,58±1,41

ПС+С2Н5ОН +Т-2 токсин 6000 100,00±17,68* 300,00±17,68* 25,00±4,42*

3000 183,33±10,21* 241,67±10,21* 43,12±1,21*

2000 250,00±17,68* 250,00±17,68* 50,00±3,54*

1000 291,67±10,21* 266,67±10,21* 52,24±1,61*

500 325,00±0,00* 233,33±10,21* 58,23±1,05*

100 375,00±17,68* 208,33±10,21* 64,27±1,52*

50 458,33±10,21* 191,67±10,21* 70,51±1,57*

25 583,33±10,21 108,33±10,21 84,35±1,36

* — различия с контролем статистически значимы при р<0,05.

Таблица 2. Пролиферативная активность клеток линии ЛЭК и цитотоксичность для них Т-2 токсина при культивировании в течение 20 ч.

5 >5 ^ и

Группа Доза Т-2 токсина, нг/мл Индекс пролиферации Митотический индекс, %о Индекс цитотоксичност (Червонская Г.Г Цитотоксическ индекс (Тертичная М.В Индекс цитотоксичност (Дьяконов Л.Г.)

ПС (контроль 1) - 1,83±0,11 6,46±0,13 -0,05±0,09 1,02±0,03 0,42±0,01

ПС+С2Н5ОН (контроль 2) - 1,80±0,07 6,42±0,11 -0,07±0,09 0,99±0,02 0,43±0,00

ПС+С2Н5ОН+Т-2 токсин 6000 0,60±0,00* 3,75±0,00* -4,25±0,31* 0,17±0,03* 2,61±0,48*

3000 0,70±0,07* 4,10±0,25* -2,98±0,09* 0,30±0,02* 1,37±0,07*

2000 1,00±0,00* 5,00±0,00* -2,50±0,25* 0,42±0,03* 1,01±0,07*

1000 1,23±0,04* 5,52±0,08* -2,34±0,11* 0,49±0,02* 0,86±0,03*

500 1,23±0,04* 5,52±0,08* -1,92±0,07* 0,54±0,00* 0,77±0,00*

100 1,33±0,08* 5,71±0,15* -1,50±0,11* 0,63±0,03* 0,67±0,03*

50 1,60±0,00 6,15±0,00 -1,06±0,11* 0,76±0,02* 0,55±0,01*

25 1,77±0,04 6,38±0,05 -0,10±0,09 0,97±0,02 0,43±0,00

* — различия с контролем статистически значимы при р<0,05.

Как видно из таблиц 1 и 2 коэффициент жизнеспособности, индекс пролиферации и митотический индекс клеточной линии ЛЭК зависели от дозы Т-2 токсина. Если при дозе Т-2 токсина 25 нг/мл эти показатели не отличались от контроля, то с возрастанием дозы токсина они снижались. Полученные нами данные согласуются с результатами других исследований, где в экспериментах на первичной культуре эндотелиальных клеток капилляров мозга свиньи (РВСЕС) [26], клетках кишечника человека Сасо-2 [27], первичной культуре клеток печени [28] было показано, что жизнеспособность клеток снижается в присутствии Т-токсина и это снижение зависит от дозы токсина. Кроме того, ряд авторов также доказали, что ингибирование пролиферации клеток Т-2 токсином также зависит от дозы препарата [29, 30].

Индексы цитотоксичности Т-2 токсина для клеток линии ЛЭК, рассчитанные тремя разными методами, выявили общую тенденцию повышения цитоток-сичности исследуемого вещества с увеличением его дозы (табл. 2). Вычисление показателей цитоток-сичности необходимо для определения максимально переносимой, средне летальной (1С50) и летальной доз (1С100) тестируемого вещества для культур клеток [19]. По результатам проведенного анализа концентрацию Т-2 токсина 25 нг/мл в культуральной среде можно принять за дозу, не оказывающую цитотокси-ческого действия на эпителиальные клетки легкого, и считать максимально переносимой (МПД). При концентрации токсина 1000 нг/мл индекс цитоток-сичности составил 0,50, эта доза наиболее близка к 1С50. Определить летальную дозу в нашей работе не представлялось возможным, так как индекс ци-тотоксичности в максимальной исследуемой дозе не приближался к 0.

Установленная нами зависимость цитотоксич-ности Т-токсина от дозы препарата подтверждает данные, полученные на клеточных культурах фи-бробластов десны [31], первичной культуре эпителиальных клеток проксимальных почечных канальцев (ПРТЕС) и нормальных фибробластов легких (1\1Н1_Р) [32].

Заключение

Полученные результаты и литературные данные доказывают высокую токсичность Т-2 токсина на моделях клеточных культур, при этом воздействие токсина коррелирует с его концентрацией. При культивировании перевиваемых ЛЭК в течение 20 ч. в среде йМЕМ, содержащей высокие дозы токсина (500—6000 нг/мл), отмечалось изменение формы клеток, их фрагментация, отсутствие монослоя, подавление процесса деления и высокий уровень гибели путем апоптоза. Жизнеспособность клеток снижалась на 26,35—59,58%, индекс пролиферации — на 31,67—66,67%, ми-тотическая активность — на 13,97—41,56%, т.е. цитотоксичность возрастала. При снижении концентрации Т-2 токсина до 50 нг/мл клетки начинали формировать монослой, а их форма становилась эпителиоподобной, при концентрации Т-2 токсина 25 нг/мл клетки имели правильную эпи-телиоподобную форму и образовывали полноценный монослой. Концентрация токсина 25 нг/мл не оказывала губительного воздействия на клетки: коэффициент жизнеспособности, индекс пролиферации и митотический индекс не отличались от контроля. 1С50 Т-2 токсина для эпителиальных клеток легкого составила 1000 нг/мл, максимально переносимая доза — 25 нг/мл при существующем ПДК в продуктах питания 100 нг/г. Таким образом,

поступление в организм Т-2 токсина даже на уровне предельно допустимых концентраций может стать причиной возникновения местных патологических очагов в легких, индукции патогенеза заболеваний различной природы и нарушений системного характера, что указывает на необходимость пересмотра предельно допустимой концентрации Т-2 токсина в продуктах питания.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Иванов А.В., Тремасов М.Я., Папуниди К.Х. и др. Диагностика, профилактика и лечение сочетанных отравлений животных вторичными метаболитами микроскопических грибов рода Fusarium: Методическое пособие [Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН). Казань: Издательство ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»; 2012.

2. Shephard G.S. Human health impacts and risk assessment of mycotoxins. In: Proceedings of the international workshop: Reduction of Mycotoxins in Production Chains of EU and Russia: Modern investigations and Practical Features. Moscow; 2011. p. 12-4.

3. Lattanzio V.M., Visconti A., Haidukowski M. et al. Identification and characterization of new Fusarium masked mycotoxins, T-2 and HT-2 glycosyl derivatives, in naturally contaminated wheat and oats by liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 2012; 47: 466-75.

4. Mazat J.P., Ransac S., Heiske M. et al. Mitochondrial energetic metabolism-some general principles. IUBMB Life 2013; 65: 171-9.

5. Wu Q.H., Wang X., Yang W. Oxidative stress-mediated cytotoxicity and metabolism of T-2 toxin and deoxynivalenol in animals and humans: an update. Arch. Toxicol. 2014; 88(7): 1309-26.

6. Somoskoi B., Kovacs M., Cseh S. Effects of T-2 mycotoxin on in vitro development and chromatin status of mouse embryos being in preimplantation stages. PLoS One 2014; 9(9): e108394.

7. Behm C., Follmann W., Degen G.H. Cytotoxic potency of mycotoxins in cultures of V79 lung fibroblast cells. J. Toxicol. Environ. Health A 2012; 75(19-20): 1226-31.

8. Liu J., Wang L., Guo X. et al. The role of mitochondria in T-2 toxin-induced human chondrocytes apoptosis. PLoS One 2014; 9(9): e108394.

9. Wang X., Liu Q., Ihsan A. et al. JAK/STAT pathway plays a critical role in the pro inflammatory gene expression and apoptosis of RAW264.7 cells induced by trichothecenes as DON and T-2 toxin. Toxicol. Sci. 2012; 127(2): 412-24.

10. Yuan Z., Matias F.B., Yi J.E. et al. Т-2 toxin-induced cytotoxicity and damage on TM-3 Leydig cells. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 2016; 181-182: 47-54.

11. Zhuang Z., Yang D., Huang Y. et al. Study on the apoptosis mechanism induced by T-2 toxin. PLoS One 2013; 8(12): e83105.

12. Егоров В.И. Токсикологическая оценка сочетанного воздействия дециса и Т-2 токсина на организм животных и изыскание профилактических средств [диссертация]. Казань; 2007.

13. Идиятов И.И. Сочетанное воздействие малых доз диоксина и Т-2 токсина на организм поросят и пути коррекции [диссертация]. Казань; 2013.

14. Семенов Э.И. Поиск средств профилактики смешанных ми-котоксикозов животных [диссертация]. Казань; 2006.

15. Pang V.F., Lambert R.J., Felsburg P.J. et al. Experimental T-2 toxicosis in swine following inhalation exposure: effects on pulmonary and systemic immunity, and morphologic changes. Toxicol. Pathol. 1987; 15(3): 308-19.

16. Seeboth J., Solinhac R., Oswald I.P. et al. The fungal T-2 toxin alters the activation of primary macrophages induced by TLR-agonists

Благодарности

Работа выполнена при поддержке ФГБУ «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» (Фонд содействия инновациям) в рамках выполнения Соглашения о предоставлении гранта на выполнение научно-исследовательских работ за № 10244ГУ/2015.

resulting in a decrease of the inflammatory response in the pig. Vet. Res. 2012; 43: 35.

17. Дьяконов Л.П. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии). М.: Спутник+; 2009.

18. ГОСТ Р ИСО 10993.5 99. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro. М.: ИПК Издательство стандартов; 2000.

19. Тертичная М.В. Использование клеточных культур при изучении действия Т-2 токсина: [диссертация]. Казань; 2005.

20. Червонская Г.П., Кравченко JI.T., Рунова В.Ф. и соавт. Ци-тотоксическое действие химических веществ, содержащихся в виде примесей в некоторых медицинских иммунобиологических препаратах. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол., 1988; 12: 85-90.

21. Agrawal M., Bhaskar A.S., Lakshmana Rao P.V. Involvement of mitogen-activated protein kinase pathway inT-2toxin-induced cell cycle alteration and apoptosis in human neuroblastoma cells. Mol. Neurobiol. 2015; 51(3): 1379-94.

22. Fang H., Wu Y., Guo J. et al. T-2 toxin induces apoptosis in differentiated murine embryonic stem cells through reactive oxygen species-mediated mitochondrial pathway. Apoptosis 2012; 17(8): 895-907.

23. Weidner M., Welsch T., Hubner F. Identification and apoptotic potential of T-2 toxin metabolites in human cells. J. Agric. Food. Chem. 2012; 60(22): 5676-84.

24. Islam Z., Nagase M., Yoshizawa T. et al. T-2 toxin induces thymic apoptosis in vivo in mice. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1998; 148(2): 205-14.

25. Фрешни Р. Культура животных клеток. Методы. М.: Мир; 1989.

26. Weidner M., Huwel S., Ebert F. et al. Influence of T-2 and HT-2 toxin on the blood-brain barrier in vitro: new experimental hints for neurotoxic effects. PLoS One 2013; 8(3): e60484.

27. Romero A., Ares I., Ramos E. et al. Mycotoxins modify the barrier function of Caco-2 cells through differential gene expression of specific clauinisoforms: Protective effect of illitemineralclay. Toxicology 2016; 353-354: 21-33.

28. Yang L., Yu Z., Hou J. Toxicity and oxidative stress induced by T-2 toxin and HT-2 toxin in broilers and broiler hepatocytes. Food Chem. Toxicol. 2016; 87: 128-37.

29. Bouaziz C., Bouslimi A., Kadri R. et al. The in vitro effects of zearalenone and T-2 toxins on Vero cells. Exp. Toxicol. Pathol. 2013; 65(5): 497-501.

30. Kolf-Clauw M., Sassahara M., Lucioli J. et al. The emerging mycotoxin, enniatin B1, down-modulates the gastrointestinal toxicity of T-2 toxin in vitro on intestinal epithelial cells and ex vivo on intestinal explants. Arch. Toxicol. 2013; 87(12): 2233-41.

31. Shokri F., Heidari M., Gharagozloo S. et al. In vitro inhibitory effects of antioxidants on cytotoxicity of T-2 toxin. Toxicology 2000; 146(2-3): 171-6.

32. Konigs M., Mulac D., Schwerdt G. et al.Metabolism and cytotoxic effects of T-2 toxin and its metabolites on human cells in primary culture. Toxicology 2009; 258(2-3): 106-15.

Поступила: 02.08.2016