CC BY
49
УДК 616.24-006.6-08:615.849.11] - 092.4
СФЕРОИДООБРАЗОВАНИЕ, ПРОЛИФЕРАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ, АПОПТОЗ КЛЕТОК РАКА ЛЁГКОГО ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ВИХРЕВОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ IN VITRO
© 2012 г. В.А. Порханов, Н.Г. Бахмутский, В.Н. Бодня, И.С. Поляков
Кубанский государственный медицинский университет, Kuban State Medical University,
ул., Седина, 4, г. Краснодар, 350063, Sedin St., 4, Krasnodar, 350063,
[email protected] [email protected]
Проведена оценка противоопухолевой эффективности вихревого магнитного поля, используя культуры клеток рака лёгкого, культивируемые в диффузионных камерах. Установлено, что вихревое магнитное поле снижает сфероидообразование клетками рака лёгкого. Кроме того, при воздействии магнитного поля ингибируется пролиферативная активность опухолевых клеток, митотический индекс снижается, в культуре клеток преобладают патологические митозы над нормальными, а среди фаз митозов увеличивается число мета-фаз. В спектре патологических митозов преобладают такие формы, как рассеивание хромосом и их фрагментов в метафазе, многополюсные митозы, комковатая метафаза, асимметричные митозы. Отмечено, что на фоне ингибиции пролиферативной активности индуцируется апоптоз в клетках рака лёгкого.
Ключевые слова: вихревое магнитное поле, рак лёгкого, диффузионные камеры, сфероиды, митозы, апоптоз.
The estimation of antineoplastic efficiency of a vortical magnetic field is lead, using cultures of cells of a lung cancer, cultivated in diffusion chambers in work. It is established, that the vortical magnetic field reduces processes of spheroid formation by cells of a lung cancer. Besides at influence of a magnetic field inhibits proliferative activity of tumoral cells, the mitotic index is reduced, in culture of cells prevail pathological mitoses above normal, and among phases of mitoses increases the number of metaphases. In a spectrum pathological mitoses such forms, as dispersion of chromosomes and their fragments in a metaphase, multipolar mitoses, a lumpy metaphase, asymmetric mitoses prevail. It is marked, that on a background of inhibition ofproliferative activity it is induced apoptosis in cells of a lung cancer.
Keywords: vortical magnetic field, lung cancer, diffusion chambers, spheroids, mitoses, apoptosis.
В Кубанском государственном медицинском университете разработаны способ лечения злокачественных опухолей вихревым магнитным полем (ВМП) и установки, его реализующие, - «Магнитотурботрон» и «Магус-1600». Новизна этого способа заключается в синхронном воздействии на все органы и системы больного вращающимся, плавно изменяющимся по амплитуде магнитным полем [1-3].
Единой гипотезы о механизмах влияния как магнитных полей вообще, так и ВМП в частности на опухоль пока не существует. В данной работе мы попытались оценить противоопухолевую эффективность этого способа на культурах клеток рака лёгкого (РЛ).
Материал и методы исследования
Изучение влияния ВМП на опухолевые клетки РЛ in vivo провели в 2 экспериментах на крысах-самках линии Wistar. В I эксперименте использовали 10 животных, во II - 12. В контрольной и опытной группах было равное число животных для обоих экспериментов, т.е. в первом - по 5, во втором - по 6. В экспериментах использовали крыс возрастом 16-17 недель, весом 210 + 50 г.
Влияние ВМП на опухолевые клетки РЛ человека изучали с помощью метода культивирования в диффузионных камерах (ДК) [4].
Культивирование клеток РЛ провели в I эксперименте суспензией клеток, во II - кусочками опухоли. Все работы с опухолевой тканью проводили в стерильных условиях в ближайшие 3-4 ч после выделения кусочков опухоли из операционного материала.
Морфологической формой РЛ во всех экспериментах был немелкоклеточный рак лёгкого (плоскоклеточный) (НМРЛ).
При 1-й модификации опыта опухолевые кусочки РЛ очищали от некротизированных участков, рассекали стерильными глазными ножницами на более мелкие фрагменты ткани диаметром 0,2 - 0,3 мм в стерильной чашке Петри, содержащей физиологический раствор с добавлением 10 000 ед/мл пенициллина. Затем эти кусочки повторно измельчали с помощью стерильного гомогенизатора и инкубировали при +37 °С в забуференном солевом растворе (рН 7,2), содержащем 4 мг коллагеназы, 20 мг трипсина и 10 мг ДНКазы на 20 мл инкубационной среды 199, при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Такая процедура повторялась 5-кратно по 15-20 мин. После окончания каждого цикла ферментативной обработки получали порции клеток, которые в дальнейшем объединяли. Действие ферментов инкубировали добавлением солевого раствора, содержащего 10 % человеческой сыворотки, инактивированной нагреванием. Выделенные клетки отмывали трёхкратно центрифугированием при 456 г в культуральной среде 199 и затем подсчитывали.
Подсчет концентрации клеток клеточной суспензии и их жизнеспособности осуществляли с использованием камеры Горяева после добавления раствора суправитального красителя, представляющего собой приготовленную ex tempore смесь 4 частей 0,2%-го раствора трипанового синего и одной части 4,25%-го раствора NaCl. Процент жизнеспособных (неокра-
шенных) клеток в пригодных для опытов суспензиях должен быть не ниже 80-90 %.
Для изготовления ДК применяли мембранные фильтры «Миллипор» (США) с диаметром пор 0,22 мкм. Фильтры монтировали на кольцах из тефлона большого и малого диаметра с наружными диаметрами соответственно 18 и 14 мм и шириной колец 2 мм при высоте 2 мм, пользуясь клеем БФ-6.
Клеточную суспензию, содержащую 106 опухолевых клеток в объеме до 0,1 мл, наносили с помощью микродозатора на большой фильтр. После этого монтировали собственно камеры. ДК помещали в стерильные чашки Петри, содержащие среду 199 комнатной температуры, где они находились до момента имплантации животному-реципиенту.
Под гексеналовым наркозом (100 мг/кг массы животного, внутрибрюшинно) осуществляли имплантацию камер в брюшную полость крысы (до 5 ДК).
Через сутки после введения ДК животных подвергали действию ВМП, создаваемого установкой «Магнито-турботрон-2», продолжительность воздействия составляла 10 сут. Для воздействия магнитное поле в эксперименте имело следующие параметры: индукция при максимальном значении - 3 мТ, частота вращения -6 000 об/мин, длительность периода изменения индукции от нуля до максимума и обратно до нуля (1 цикл) = 120 с. Продолжительность одноразового воздействия составляла 180 мин (90 циклов).
На 11-е сут эксперимента животных забивали под эфирным наркозом, извлекали ДК, очищали их наружную поверхность от перитонеальных клеток. Опухолевые клетки после демонтажа ДК вместе с подлежащим фильтром фиксировали в спирт-формоле в течение 20 мин, окрашивали в течение 15 мин гематоксилином Караччи, проводили через спирт возрастающей концентрации (60, 70, 80, 96, 100° по 5 мин), просветляли в ксилоле и заключали в канадский бальзам, получая тотальные цитологические препараты.
Кусочки опухолей РЛ во втором эксперименте получали из операционного материала больных Краснодарской краевой больницы. Кусочки опухолей, предназначенные для трансплантации, помещали в среду 199 с добавлением 20 % инактивированной нагреванием бычьей сыворотки. В питательную среду вносили также антибиотики (пенициллин 100 ЕД/мл и стрептомицин 100 мкг/мл) и затем доставляли из операционной в лабораторию, где из жизнеспособных участков кусочков опухоли ножницами вырезали маленькие фрагменты ткани диаметром 0,2 - 0,3 мл произвольной формы и помещали их по 2-3 на фильтр большого кольца. Готовые камеры с фрагментами опухолей помещали в свежую порцию среды 199 с бычьей сывороткой, где они находились до момента имплантации животному-реципиенту. ДК имплантировали в брюшную полость так же, как описано выше для клеточных суспензий в I эксперименте
Через сутки после введения ДК животных подвергали действию ВМП создаваемого установкой «Маг-нитотурботрон-2» при таких же параметрах поля, как и в I эксперименте.
Забой животных производили на 11-е сут под эфирным наркозом, проводка, окраска фильтров была идентичной I эксперименту.
Для оценки пролиферативной активности опухолевых клеток РЛ использовали индекс эффективности сфероидообразования (ИЭС). Его расчет осуществля-
, , „ а _ в
ли по формуле ЕУ1Ч =--100 %, где А, В - средА
нее количество сфероидов в контрольной и опытной группах. Положительные значения ИЭС соответствуют ингибиции образования сфероидов, т.е. проявлению противоопухолевого действия.
Пролиферативную активность клеточной популяции оценивали митотическим индексом (МИ), который определяли путем подсчета числа делящихся клеток в 30 случайно выбранных полях зрения при 400-кратном увеличении к общему числу проанализированных клеток и выражали в процентах.
Также было подсчитано общее число митозов, из которых были выделены в процентном соотношении нормальные и патологические. В нормальных митозах различали 4 фазы (профазу, метафазу, телофазу, анафазу). Патологические были разбиты по спектру в соответствии с классификациями, описанными в [5, 6].
Клетки с признаками апоптоза определяли визуально под микроскопом. Подсчитывали среднее количество клеток, имеющих признаки апоптоза, в 30 случайно выбранных полях зрения при 400-кратном увеличении. Апоптозный индекс рассчитывали по формуле
Количество апоптозных клеток ,
АИ =--100 % .
Общее количество клеток
Результаты исследования
В контроле при культивировании РЛ в ДК, используя суспензию клеток опухоли, нами было установлено следующее. На 11 -е сут культивирования на поверхности миллипоровых фильтров было отмечено формирование многослойных колониеподобных структур - сфероидов, состоящих из округлых или удлиненных клеток, ориентированных по спирали вокруг центра такого образования. Границы этих организованных клеточных скоплений обычно были четко очерчены. Между такими структурами, которые при малом увеличении микроскопа выглядели как правильные полусферы, располагались относительно немногочисленные изолированные эпителиоциты в монослое и единичные фибробласты.
Митозы чаще наблюдали в клетках внешних слоев опухолевых сфероидов в отличие от клеток в центре сфероидов, в которых клетки РЛ имели мелкие ядра и темную цитоплазму. В монослое пролиферирующие клетки располагались довольно равномерно, в единичных клетках отмечался апоптоз.
В монослое и сфероидах клетки РЛ были полиморфными, в основном крупными округлыми или веретенообразными, ядра нередко имели продолговатую форму, встречались двуядерные варианты и «голые ядра». Клетки были или со светлыми, бедными хроматином, или с резко гиперхромными ядрами, хроматин имел полиморфную структуру - нежную, петлисто-зернистую, крупноглыбчатую. Ядрышки -крупные, интенсивно окрашенные, их количество в некоторых клетках было увеличено - два, три и более.
В монослое митозы в опухолевых клетках наблюдали относительно равномерно.
При воздействии ВМП на опухолевые клетки суспензии РЛ, культивируемые в ДК, общая морфологическая картина значительно отличалась. Изменения
В структуре сфероидов отмечалось значительное обеднение их эпителиоцитами. Морфологически клетки выглядели так же, как и в контроле, но часто в них наблюдались дистрофические изменения, а также чаще выявляли патологические митозы; во многих клетках отмечались морфологические признаки апоптоза. Из особенностей нужно отметить появление гигантских клеток с резко выраженной гиперхромией ядра. Фиб-робласты активно делились, не отмечалось в них никаких дистрофических изменений, а также патологических митозов.
В контроле плоскоклеточного РЛ, культивируемого кусочком ткани в ДК, на 11-е сут эксплантации среди многочисленных лимфоцитоподобных клеток и макрофагов по краям эксплантата наблюдались значительные разрастания эпителиоподобных элементов в виде участков монослоя и отдельных колоний и образования множества сфероидов различной величины. Макрофаги были различного размера от крупных до мелких, овальной формы с эксцентрически расположенным ядром. В ядрах хроматин был распределен равномерно, имел мелко- или крупнопетлистый рисунок. Контуры ядер были четко очерчены.
Эпителиальные клетки были преимущественно крупными, но встречались также клетки среднего и мелкого размеров. Форма клеток РЛ была самой разнообразной - полигональной, вытянутой, лентовидной. Ядра в клетках крупные, чаще гиперхромные, но встречались и светлые. Иногда ядра имели неровные контуры и были разнообразны по форме - округлые, палочковидные. Хроматин в ядрах был распределен неравномерно, ядрышки немногочисленны, размеры их варьировали от мелких до очень крупных, часто необычной уродливой формы. Иногда пласты эпителиальных клеток были довольно обширными как в центре, так и по периферии фильтра. Митозы в эпителиальных клетках монослоя распределялись довольно равномерно как в эпителиальных скоплениях, так и в сфероидах. Митозы чаще регистрировались в клетках, располагающихся на периферии этих образований.
Рост фибробластоподобных клеток наблюдался преимущественно в центре фильтра в виде монослоя, где фибробласты образовывали небольшие островки или тяжи между эпителиальными разрастаниями и участвовали в формировании сфероидов. Сфероиды представляли собой многослойные колониеподобные структуры, состоящие преимущественно из эпителиальных клеток,
касались числа сфероидов на фильтре и их структуры. Число сфероидов снижалось, на некоторых фильтрах значительно. ИЭС при воздействии ВМП был равен 59,6 %, что говорит об угнетении пролиферативной активности опухолевых клеток (табл. 1).
1
ориентированных по спирали вокруг центра такой структуры. Границы этих организованных клеточных скоплений обычно были четко очерчены.
Воздействие ВМП значительно меняло морфологическую картину культивируемых эксплантатов плоскоклеточного РЛ на фильтре ДК.
Подсчет числа сфероидов на фильтре и его среднее значение было меньше, чем в контроле, а ИЭС был равен 56,4 %, что соответствовало ингибиции образования сфероидов (табл. 1).
В опыте изменения касались и структуры самих сфероидов. Наблюдалось значительное обеднение их эпителиальными клетками, замещение фибробласта-ми, что соответствовало так называемой фибробласт-ной селекции. Во многих участках сфероидов эпителиальные клетки были в состоянии дистрофии, мито-тическая активность снижалась, чаще выявляли патологические митозы. Иногда даже можно было наблюдать полную деструкцию сфероидов.
В монослое эпителиальные клетки по своей форме не отличались от контроля, но их скомпонованность была меньшей, часто наблюдали клетки с дистрофическими изменениями. Дистрофические изменения в клетках оценивали по разрежению структуры хроматина интерфазных ядер, уплотнению, изрезанности контуров ядерной мембраны и фрагментации ядер, уменьшению количества ядрышек в ядрах. Встречались клетки с гиперхромными ядрами, наблюдали гигантские формы раковых клеток. В некоторых клетках хроматин был сконцентрирован на ядерной оболочке в виде глыбок. Митозы в эпителиальных клетках монослоя встречались нечасто, в основном они были представлены патологическими формами.
В некоторых препаратах зона роста эпителиальных клеток вокруг трансплантата вовсе отсутствовала. Что касается роста фибробластов в зоне трансплантата, то они образовывали разрастания, состоящие из крупных клеток с длинными переплетающимися отростками. Далее по фильтру они располагались довольно равномерно, с концентрацией вокруг сфероидов. В фибробластах наблюдали митозы, патологических не встречали.
При изучении пролиферативной активности клеток РЛ, культивируемого суспензией, в контрольной группе, выявлено, что МИ был высоким при равном соотношении патологических и нормальных форм митозов (табл. 2).
Таблица
Сфероидообразование клетками РЛ в ДК при воздействии ВМП
Культивирование суспензией клеток (106 клеток) Культивирование кусочком опухоли
Число сфероидов в контроле Число сфероидов в опыте Число сфероидов в контроле Число сфероидов в опыте
30,15±7,12 12,32±5,12 26,17±0,42 11,42±0,21
p < 0,05 p < 0,05
ИЭС = 59,6 % ИЭС = 56,4 %
Соотношение фаз митозов было представлено следующим образом: метафазы преобладали над другими фазами митозов и составляли 67,48 + 1,43 %.
В опытной группе I эксперимента эпителиоциты при воздействии ВМП имели отличительные особенности в митотическом режиме по сравнению с описанной контрольной группой. Так, МИ был достоверно ниже контрольного показателя со значительным преобладанием патологических форм митозов (табл. 2).
Среди фаз митозов нарастал процент метафаз, который составлял 74,46 + 1,22.
При изучении пролиферативной активности в опухолевых клетках РЛ, культивируемого кусочком опухоли, установлено, что МИ клеток РЛ достоверно снижается при воздействии ВМП. Отмечено достоверное увеличение процентного содержания патологических митозов в опыте (табл. 2).
Таблица 2
Показатели пролиферативнои активности и апоптоза клеток РЛ при воздействии ВМП, %
Опухоль, вид культивирования МИ АИ Нормальные митозы Патологические митозы
РЛ, культивирование взвесью клеток Контроль 17,24±3,05 2,03±0,64 50,41±1,27 49,59±2,03
Опыт 10,06±2,32 5,17±0,60 27,84±1,73 72,16±0,07
p < 0,05 p < 0,05 p < 0,05 p < 0,05
РЛ, культивирование кусочком опухоли Контроль 24,31±3,97 0,78±0,11 22,08±1,09 77,92±1,09
Опыт 19,68±2,59 4,97±0,47 8,03±0,32 91,97±0,32
p < 0,05 p < 0,05 p < 0,05 p < 0,05
Исследуя соотношение фаз митозов, нужно отметить, что в клетках, подвергавшихся воздействию, отмечено преобладание метафаз над профазами и другими формами митозов. В контрольной группе профазы составляли 25,66 + 1,23 %, в опыте отмечалось их снижение до 11,12 + 1,14, при нарастании процентного содержания в опыте метафаз (метафазы в контроле - 38,18 + 4,11, в опыте - 62,03 + 7,23 %).
Наиболее часто в спектре патологических форм митозов в контрольной группе РЛ, культивируемого суспензией клеток, встречались рассеивание хромосом и их фрагментов в метафазе (25,8 %); многополюсные митозы (18,4); асимметричные митозы (15,3); трехполюсные митозы (11,8); отставание хромосом и их фрагментов в анафазе (8,2); комковатая метафаза (9,4 %).
При воздействии ВМП в этом эксперименте формы патологических митозов менялись с преобладанием грубых форм, которые могут вести к гибели клетку: рассеивание хромосом и их фрагментов в метафазе - 33,7 %; многополюсные митозы - 21,1; комковатая метафаза - 15,6; асимметричные митозы - 7,9; мосты - 6,9; отставание хромосом и их фрагментов в анафазе - 5,6 %.
Во II эксперименте была выявлена такая же картина, при воздействии ВМП в спектре патологических митозов превалировали грубые формы. В контроле спектр митозов был следующим: многополюсные митозы составляли 29,07 %; рассеивание хромосом и их фрагментов в метафазе - 18,47; асимметричный митоз - 17,94; трехгрупповая метафаза - 14,09; комковатая метафаза -10,12 %; отставание хромосом и их фрагментов в анафазе - 4,19; моноцентрические митозы - 3,84; полая метафаза - 1,40; мосты - 0,88 %.
Спектр патологических митозов в опыте выглядел так: многополюсные митозы составляли 27,37; рассеивание хромосом и их фрагментов в метафазе -26,21; комковатая метафаза - 19,54; асимметричный митоз - 4,39; моноцентрические митозы - 5,33; трех-групповая метафаза - 4,38; отставание хромосом и их фрагментов в анафазе - 4,34; полая метафаза - 3,35; мосты - 2,69; отставание хромосом и их фрагментов в метафазе - 2,40 %.
В обеих экспериментах также отмечено увеличение АИ при воздействии ВМП. Больше клеток в состоянии апоптоза было отмечено по периферии сфероидов и по краю трансплантата, хотя их можно было регистрировать и в монослое (табл. 2).
Выводы
Известно, что противоопухолевое влияние (как и проопухолевое) слабых магнитных полей, к которым относится ВМП, имеет опосредованный характер и реализуется, прежде всего, через изменения состояния различных регуляторных систем организма. Вопрос о возможности непосредственного влияния на опухолевые клетки остается открытым [7].
Сфероидообразование используют для изучения действия различных противоопухолевых факторов, так как сфероиды можно рассматривать как модель опухолевого роста in vivo [8]. Результаты исследований обычно оцениваются ИЭС, положительные значения которого указывают на ингибицию образования сфероидов, т.е. проявления противоопухолевого действия лечебных факторов. Проведенное нами исследование свидетельствует об ингибирующем действии ВМП на процессы сфероидообразования клетками РЛ в ДК.
Индуцированный апоптоз (лучевой, лекарственный, гормональный и др.) является важнейшим механизмом действия различных способов и схем противоракового лечения, показателем его эффективности, определяющем чувствительность к лечению в каждом конкретном случае [9]. Используя ВМП для воздействия на культивируемые клетки РЛ в ДК, нами были получены результаты, указывающие на индукцию апоптоза в этих клетках.
Пролиферативная активность является одним из основных показателей, определяющих течение и прогноз злокачественных новообразований. Для многих опухолей пролиферативная активность является эффективным фактором прогноза безрецидивной и обшей выживаемости. Основным показателем пролифе-ративной активности является МИ [5]. При воздействии ВМП на культивируемые клетки РЛ, использо-
ванные нами в эксперименте, получены данные о достоверном снижении МИ как показателя пролифера-тивной активности. Таким образом, снижение МИ, нарастание в митотическом режиме метафаз, патологических митозов и изменение спектра патологических митозов в сторону нарастания относительной частоты комковатых метафаз и других грубых форм патологии митоза может служить одним из объективных критериев степени повреждения клеток при воздействии ВМП.
Литература
1. Бахмутский Н.Г. Оценка противоопухолевой эффектив-
ности вихревого магнитного поля (ВМП) в экспериментальных и клинических условиях: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М., 2000. 52 с.
2. Бахмутский Н.Г.Лечение генерализованной формы
меланомы кожи вихревым магнитным полем // Рос. он-кол. журн. 2000. № 6. С. 32-35.
Поступила в редакцию_
3. Бахмутский Н.Г. Лечение метастазирующего рака мо-
лочной железы вихревым магнитным полем // Рос. он-кол. журн. 2000. № 4. С. 35-37.
4. Algire G.H., Weawer J.M., Prehu R.T. Studies on tissue
homotransplantation in mace, using diffusion chamber methods // Ann. N.Y. 1957. Vol. 7, № 5. P. 1009-1013.
5. Казанцева И.А. Патология митоза в опухолях человека.
Новосибирск, 1981. 143 с.
6. Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза. М.,
1972. 263 с.
7. Шихлярова А.И., Шейко Е.А., Пиль Э.А. Оценка проти-
воопухолевого эффекта и анализ активности дегидро-геназ лимфоцитов периферической крови крыс с опухолью С-45 при воздействии слабых инфранизкоча-стотных магнитных полей // Вопр. Онкологии. 1999. Т. 45, № 3. С. 287-291.
8. Hamilton G. Multicellular spheroids as an in vitro tumor
model // Cancer Lett. 1998. Vol. 131. P. 29-34.
9. Петухов В.И. Роль Fas-опосредованного апоптоза в реа-
лизации противоопухолевого эффекта а-интерферона при хроническом миелолейкозе // Гематол. трансфузи-ол. 2000. № 4. С. 29-33.
29 августа 2011 г
