CC BY
25
ACTION OF PREILLUMINATION, DITHIOTHREITOL AND ASCORBATE ON PHOTOENERGETIC REACTIONS IN CHLOROPLASTS WITH DIFFERENT ATP SYNTHESIS ACTIVITY
E.M. Bassarskaya, V.F. Gavrilenko
The physiological and biochemical regulation mechanisms of photoenergetic processes were studied in chloroplasts of two wheat cultivars with different ATP synthesis activity. Separate and joint action of light, dithiothreitol and ascorbate were investigated. Inhibition of the photophos-phorylation, proton gradient forming, electron transport and Ca2+-ATPase activity of CFi were determinate under preliminary illumination without exogenous electron acceptors, ADP and Pi. It decreased in the presence of dithiothreitol and ascorbate. The obtained data suggest that preil-lumination cause conformational modifications and changing in functional activity of the energy transforming systems components. These processes can be the result of SH-groups reduction in CFq—CFi complex subunits by reactive oxygen species formed in electron transport chain.
УДК 576.535.5:576.32/36
ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ДОНОРА ОКСИДА АЗОТА 3-НИТРО-4-ФЕНИЛФУРОКСАНА ПРИ ДЕЙСТВИИ НА КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ
Е.Ю. Плотников, К.В. Фрезе, А.Я. Коц, Ю.В. Хропов!, И.В. Овчинников, Н.Н. Махова
(кафедра физиологии микроорганизмов,
лаборатория химии ферментов биологического факультета МГУ;
лаборатория азотсодержащих соединений Института органической химии РАН, Москва)
Регуляция процесса клеточной гибели (апопто-за) является одной из центральных проблем биологии клетки, поскольку регулирует гомеостаз всей клеточной популяции многоклеточного организма. Известно, что запуск программы, ведущей к смерти клетки, может осуществляться как специфическими сигналами (например, цитокинами или гормонами), так и неспецифическими, такими как радиация, повышение температуры или действие окислителей. В развитии апоптотического процесса участвует множество сигнальных молекул, многие из которых регулируют и другие важные функции организма.
К физиологическим факторам, способным запускать в клетках апоптотическую программу, относится оксид азота (N0) — одна из ключевых сигнальных молекул, регулирующих функции сердечно-сосудистой, нервной и иммунной систем организма (Брюне и др., 1998). В организме оксид азота вырабатывается специальным ферментом (Горрен, Майер, 1998), тогда как в экспериментах и медицине используются препараты-доноры экзогенного N0.
К числу перспективных доноров NO и потенциальных лекарственных препаратов относятся гетероциклические азотсодержащие соединения, в частности производные 1,2,5-оксадиазол-2-окси-да (фуроксана), которые являются спонтанными или тиолзависимыми донорами оксида азота. Они генерируют NO при реакции с тиолами (Feelisch et al., 1992; Medana et al., 1994) или другими нук-леофилами (Sorba et al., 1997). Фуроксаны представляют собой высокоактивные вазодилятаторы и стимуляторы рГЦ (Ferioli et al., 1995). Эти соединения активируют рГЦ, ингибируют агрегацию тромбоцитов и генерируют NO. Однако для всесторонней характеристики фармакологических свойств этих биологически активных соединений необходимо исследование других видов активности, проявляемых соединениями фуроксанового ряда, в частности цитотоксической и апоптогенной.
Целью данной работы было изучение in vitro цитотоксического действия нового биологически активного соединения — донора экзогенного NO 3-нитро-4-фенилфуроксана (3NPF) и факторов, влияющих на устойчивость к нему. В качестве
контроля использовался 4-нитро-3-фенилфуроксан (4NPF), обладающий сходной с 3NPF реакционной способностью, но не генерирующий NO при взаимодействии с тиолами. В работе использовалась экспериментальная модель индукции апоптоза в клетках культивируемой опухолевой линии HeLa. В число задач работы входило выявление влияния экспрессии антиапоптотического гена bcl-2 на индукцию клеточной гибели оксидом азота и доказательство апоптотического характера гибели клетки.
Методы исследования
Эксперименты проводились на клетках линий HeLa и HeLa/Bcl-2, несущей трансген bcl-2. Клетки культивировали в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки в полистироловых флаконах для культуры клеток при 37° в инкубаторе с влажной атмосферой, содержащей 5%-ю СО2.
Обработка клеток проводилась инкубацией с различными концентрациями веществ (3NPF и 4NPF) в течение 2 ч в среде без сыворотки при 37° в атмосфере 5%-й CO2, при этом к контрольным культурам вещества не добавлялись.
В первой серии опытов оценивалась цитоток-сичность веществ с использованием стандартного метода колориметрического MTT-теста (восстановление дегидрогеназами жизнеспособных клеток бесцветного бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразоля до окрашенного продукта — формазана). Реакцию учитывали на многоканальном фотометре при длине волны 540 нм.
Для прижизненного окрашивания ядерного хроматина клеток с целью выявления апоптоти-ческих изменений использовался флуоресцентный краситель Hoechst 33342. Он специфически связывается с клеточной ДНК, накапливаясь преимущественно в ядре. Клетки обрабатывали веществами (3NPF и 4NPF — оба в концентрации 50 мкМ) в течение 2 ч, затем препараты промывали средой без сыворотки и инкубировали в среде с Hoechst 33342 (конечная концентрация 5 мг/мл) в течение 30 минут при 37° (по методике McGahon et al., 1995). После этого клетки промывали и фиксировали в 4%-м формалине. Этот препарат использовали для флуоресцентной микроскопии, получая изображение клеток в видимом свете и флуоресценцию Hoechst 33342, связавшегося с ядерной ДНК клеток.
Результаты и обсуждение
При определении цитотоксичности ЗКРБ и 4КРБ с помощью МТТ-теста было выявлено (рис. 1, А), что оба соединения проявляют токсичность по отношению к клеткам НеЬа, но при этом токсичность ЗКРБ на 20% выше, чем у 4КРБ, в диапазоне концентраций от 5 мкМ до 20 мкМ. На рис. 1, Б видно, что 50%-е снижение жизнеспособности клеток составляет для линии НеЬа 5 мкМ при обработке ЗКРБ и 20 мкМ при обработке 4КРБ. Поскольку известно, что из этих веществ только ЗКРБ способен генерировать N0, то можно сделать вывод, что гибель клеток в этом случае обусловлена именно N0 (или его производными). Цитотоксичность 4NPF, вероятно, обусловлена его реакциями с тиолами клетки. Поскольку при этом происходит арилирование 8Н-групп различных соединений клеток, например, функционально важных белков, то можно предположить, что такие модификации могут привести к потере их активности. Разница между токсичностью 3NPF и 4NPF показывает, что основным действующим началом З-нитро-4-фенилфуроксана является именно оксид азота.
В этих опытах также установлено, что экспрессия антиапоптотического белка Вс1-2 в клетках НеЬа приводит к существенному повышению их резистентности к оксиду азота (рис. 2, А) по сравнению с родительской линией, не несущей трансгена. Это выражается в том, что не наблюдается снижения жизнеспособности клеток НеЬа/Ьс1-2 в диапазоне концентраций до 60 мкМ включительно, тогда как у клеток НеЬа в этом интервале жизнеспособность снижается почти на 60%. На рис. 2, Б видно, что экспрессия белка Вс1-2 защищает и от цитотоксичности 4NPF, при этом снижение жизнеспособности клеток НеЬа достигает 50% по сравнению с клетками НеЬа/Ьс1-2.
В литературе хорошо описан антиапоптотиче-ский эффект белка Вс1-2, защищающего клетки
Рис. 1. Цитотоксическое действие 3NPF и 4NPF на клетки HeLa. МТТ-тест
различных линий от гибели при действии апоп-тогенов. В наших экспериментах также показан ярко выраженный защитный эффект белка Вс1-2. Его сверхэкспрессия в клетках НеЬа повышает их жизнеспособность в среднем на 50%, причем как
Рис. 2. Защитный эффект Bcl-2 при цитотоксическом действии 3NPF (А) и 4NPF (Б).
МТТ-тест
действием 3NPF, следовательно, именно оксид азота являлся в данном случае инициатором апопто-тических изменений. Данный эксперимент также подтвердил защитные свойства Вс1-2, поскольку апоптотические изменения проявлялись в клетках
НеЬа/Ьс1-2 значительно слабее.
Апоптотические изменения в клетках при обработке донором оксида азота были также подтверждены по изменению асимметрии клеточной мембраны. При этом происходит экспозиция фос-фатидилсерина на внешней поверхности мембраны. Это явление широко используется для детектирования клеток, уходящих в апоптоз. Меченный ФИТЦом аннек-син V специфично связывается с фосфатидилсерином на поверхности клеток и по интенсивности свечения
в случае 3NPF, так и в случае 4NPF. Таким образом, Bcl-2 обладает протективным действием и при действии на клетки неспецифических стрессорных факторов.
В эксперименте с флуоресцентным красителем Hoechst 33342 была выявлена конденсация ядерного хроматина (рис. 3) в клетках HeLa после обработки 3NPF (50 мкМ), но не 4NPF (50 мкМ). Также обнаружено (рис. 3), что в клетках линии HeLa/bcl-2 характерная для апоптоза конденсация хроматина в ядрах клеток при обработке 3NPF (50 мкМ) выражена значительно слабее, чем в клетках HeLa. При обработке клеток HeLa/bcl-2 контрольным веществом 4NPF (50 мкМ) подобные апо-птотические изменения вообще не наблюдаются. Конденсация и изменение морфологии ядра происходило только под
Рис. 3. Морфология ядер клеток линии HeLa и HeLa/Bcl-2 при окраске ДНК витальным флуоресцентным красителем Hoechst 33342. Инкубация с 50 мкМ 3NPF или 4NPF 2 ч
Рис. 4. Изменение распределения фосфатидилсерина в мембране клеток НеЬа при апоптозе, вызванном донором оксида азота 3NPF. Окрашивание аннексином V, меченным ФИТЦ.
Инкубация с 50 мкМ 3NPF 2 ч
клеток можно судить о степени апоптотических изменений в их цитоплазматической мембране. В данном эксперименте было показано, что при обработке клеток донором оксида азота 3NPF происходит увеличение количества фосфатидилсери-на в наружном слое плазматической мембраны (рис. 4). В то же время при обработке 4NPF подобные изменения выражены в меньшей степени.
Выводы
В работе было показано цитотоксическое действие in vitro производных фуроксана — донора
оксида азота 3-нитро-4-фенилфуроксана и 4-нит-ро-3-фенилфуроксана. По цитологическим (конденсация ядер) и биохимическим (экспозиция фос-фатидилсерина) признакам гибель клеток при действии донора оксида азота можно охарактеризовать как апоптоз. Также продемонстрировано защитное действие экспрессии в клетках протоонкогена Ьс1-2 при действии исследуемых соединений. Причем наряду со специфической антиапоптотической активностью Ьс1-2 в случае гибели клеток при действии оксида азота показано и общее протективное действие Ьс1-2 при неспецифической цитотоксич-ности 4-нитро-3-фенилфуроксана.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Брюне Б., Сандау К., фон Кнетен А. 1998. Апоптотическая гибель клеток и оксид азота: активирующие и антагонистические сигнальные пути // Биохимия. 63. 966—975.
Горрен А.К.Ф., Майер Б. 1998. Универсальная и комплексная энзимология синтазы оксида азота // Биохимия. 63. 870—880.
Feelisch M., Schonafinger K., No-a c k E . 1992. Thiol-mediated generation of nitric oxide accounts for the vasodilator action of furoxans // Biochem. Pharmacol. 44. 1149—1157.
Ferioli R., Folco G.C., Ferretti C., Gasco A.M., Medana C., Fruttero R., Civelli M . , Gasco A. 1995. A new class of fu-roxan derivatives as NO donors: mechanism of action and biological activity // Brit. J. Pharm. 114. 816—820.
Medana C., Ermondi G., Fruttero R., Di Stilo A., Ferretti C., Gasco A. 1994. Furoxans as nitric oxide donors. 4-Phenyl-3-furoxancarbo-nitrile: thiol-mediated nitric oxide release and biological evaluation // J. Med. Chem. 37. 4412-4416.
McGahon A.J., Martin S.J., Bissonnet-te R.P., Mahboubi A., Shi Y., Mogil R.J., Nishioka W.K., Green D.R. 1995. The end of the (cell) line: methods for the study of apoptosis in vitro // Methods in cell biology. 46. 153—185.
Sorba G., Medana C., Fruttero R., Cena C., Di Stilo A., Galli U. , Gasco A. 1997. Water soluble furoxan derivatives as NO prodrugs // J. Med. Chem. 40. 463—469.
Поступила в редакцию 4.11.04
PHENYLFUROXANON ON CULTURED TUMOR CELLS
E.Y. Plotnikov, K.V. Freze, A.Y. Kots, Y.V. Khropov,
I.V. Ovchinnikov, N.N. Makhova
We investigated an action of the new nitric oxide (NO) donor 3-nitro-4-phenylfuroxan and factor, that could influence on NO-resistance of the cells. In this work we used the tumor cells line HeLa. It was show that two furoxan derivatives, 3-nitro-4-phenylfuroxan and 4-nitro-3-phenylfuroxan had cytotoxic effect on these cells. 4-nitro-3-phenylfuroxan don't produce NO and its toxicity was 20% lower than toxicity of the 3-nitro-4-phenylfuroxan.Cell death caused by NO-donor occurs by apoptotic pathway, that was demonstrated by two distinct methods. Expression of the prooncogene bcl-2 in HeLa cells increased a resistance of the cells to cytotoxic action of NO-donor.
