CC BY
35
УДК 577.3:581.174:633.11
ДЕЙСТВИЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО ОСВЕЩЕНИЯ, ДИТИОТРЕЙТОЛА И АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ НА ФОТОЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ХЛОРОПЛАСТОВ С РАЗЛИЧНОЙ АКТИВНОСТЬЮ СИНТЕЗА АТФ
Е.М. Бассарская, В.Ф. Гавриленко
(кафедра физиологии растений)
Проблема фотоэнергетики остается одной из важнейших в современной биологии, поскольку фотосинтез служит основным источником энергии для всех живых организмов на земле.
В последние годы достигнут большой прогресс в изучении структуры АТФ-синтазного CFq—CFj комплекса, его субъединичного состава и функционального значения отдельных субъединиц (Richter et al., 2000). На основании представлений о структурной организации энергопреобразующей системы сформулированы основные принципы ротационного механизма функционирования сопрягающего комплекса (Boyer, 1993; Hisabori et al., 1999; Capaldi, Aggeier, 2002).
Наряду с исследованием принципов организации и работы CFq—CFi комплекса большое значение имеет физиологический аспект проблемы преобразования энергии, т.е. изучение эндогенных механизмов регуляции, определяющих разный уровень энергетической эффективности работы АТФ-синтезирующей системы.
Целью данной работы являлось изучение фи-зиолого-биохимических регуляторных механизмов, определяющих высокий уровень фотофосфорили-рования. Подходом к изучению этой проблемы может быть сравнительный анализ энергопреобразу-ющих реакций у активно- и слабофосфорилирую-щих систем хлоропластов. Поэтому для исследования были выбраны два близкородственных сорта пшеницы (Саратовская 52 и Эритроспермум 8202), ранее изученные нами, которые четко и стабильно различались по основным фотоэнергетическим реакциям (Гавриленко и др., 1974; Гавриленко и др., 1985; Гавриленко, Бассарская, 1986; Гавриленко и др., 1987; Бассарская, Гавриленко, 1988).
Работа фотоэнергетического комплекса в хлоро-пластах включает серию сопряженных процессов: фотохимические реакции в реакционных центрах фотосистем, транспорт электронов в электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) переносчиков, фотопоглощение протонов и формирование трансмембранного протонного градиента (Ацн+), энергия которого используется для последующих конформа-ционных изменений и взаимодействия отдельных
субъединиц СРо—Ср1 комплекса, осуществляющего синтез АТФ из АДФ и Фн. Каждый из перечисленных процессов подчиняется собственным регуляторным закономерностям, которые объединяются в общую регуляторную систему, определяющую в итоге уровень синтеза АТФ в хлоро-пластах.
Одной из форм контроля физиологических процессов, в том числе АТФ-синтезирующих систем, является редокс-регуляция. Для исследования этой системы регуляторных взаимоотношений в данной работе нами было изучено действие трех редокс-факторов: 1) света как основного фактора, вызывающего изменения состояния компонентов ЭТЦ, ее функциональной активности и редокс состояния сопрягающих белков; 2) дитиотрейто-ла (ДТТ) — регулятора тиол-сульфидного обмена и конформационной структуры белков; 3) аскорбиновой кислоты (АК), являющейся одним из основных компонентов защиты от оксидативного стресса.
Методы исследования
Хлоропласты выделяли из 9—11-дневных проростков яровой пшеницы (ТгШсит аехНуит Ь.) трех сортов: Эритроспермум 8202, Эритроспермум 841 и Саратовская 52. Условия выращивания растений и получение суспензии хлоропластов описаны ранее (Гавриленко и др., 1974).
Суспензию свежевыделенных хлоропластов подвергали предварительной обработке светом, дитио-трейтолом или аскорбиновой кислотой в разных комбинациях. Схема опыта включала четыре варианта: 1 — темнота без ДТТ или АК (контроль), 2 — свет без ДТТ (или АК), 3 — темнота с ДТТ (или АК), 4 — свет с ДТТ (или АК). Предварительную световую обработку хлоропластов в концентрации 0,25 мг хл/мл проводили в среде, содержащей 0,35 М №С1 и 0,025 М трис-НС1 буфер, рН 8,0, без субстратов фосфорилирования (АДФ и Фн) и экзогенных акцепторов электронов. Суспензию хлоропластов делили на четыре части: первая проба не подвергалась световой предобработке и служила темновым контролем, вторая,
освещенная без добавок, характеризовала действие предварительного освещения, в третью (без освещения) и четвертую (со световой обработкой) пробы вносили ДТТ до конечной концентрации 3 мМ или АК — 0,1 мМ. Световые варианты (второй и четвертый) освещали 7 мин при температуре 4—6° на установке, используемой для определения фото-фосфорилирования, лампой накаливания (500 Вт, 220 Вт), дающей освещенность на уровне объекта 20 000 лк (0,2 ммоль фотонов/с на м2). Тем-новые (первый и третий) варианты выдерживались в темноте также при 4—6°. Затем контрольную и обработанные пробы хлоропластов переосаждали 15 мин при 1000 g и суспендировали до первоначального объема в среде выделения.
Через 10 мин во всех 4-х вариантах при повторном освещении в полной реакционной смеси проводили определение активностей циклического, нециклического фотофосфорилирования, фотопоглощения протонов и транспорта электронов по методам, описанным ранее (Гавриленко и др., 1974). Экстракцию CFj из предобработанных хлоропластов проводили по методу Strotmann с сотр. (Strotmann et al., 1973), очистку экстракта АТФазы — переосаждением сульфатом аммония и определение Са2+-АТФазной активности препаратов — по методу Степановой с сотр. (Степанова, Никифорова, 1978). Содержание неорганического фосфора определяли методом Chen с сотр. (Chen et al., 1956), концентрацию белка — методом Lowry с сотр. (Гавриленко, Жигалова, 2003), концентрацию хлорофилла — методом Arnon (Arnon, 1949). В работе представлены средние арифметические значения 3—4 биологических повторов (с двукратным определением активности в каждом повторе) со средним отклонением. В работе использованы натриевые соли АДФ и АТФ, трис/ок-симетил/-аминометан ("Reanal", Венгрия), ЭДТА, ДТТ и ФМС ("Serva", ФРГ), остальные реактивы отечественного производства.
Результаты и обсуждение
Результаты проведенных исследований показали, что предварительное кратковременное освещение изолированных хлоропластов пшеницы в отсутствие экзогенных акцепторов электронов, АДФ и Фн приводит к существенным изменениям и нарушению всех фотоэнергетических процессов в хлоропластах и, главным образом, процессов фотофосфорилирования, снижая эффективность синтеза АТФ до 40—50% от контроля. При этом наиболее резкие нарушения обнаружены у активно фосфорилирующих систем.
Анализ данных табл. 1 показывает, что опытные сорта существенно различаются по скорости синтеза АТФ. В контрольном варианте (без пред-
варительного освещения и введения ДТТ) активность циклического фотофосфорилирования с фе-назинметосульфатом (ФМС) у сорта Саратовская 52 в 1,8 раза превышала синтез АТФ хлоропластами сорта Эритроспермум 8202.
Таблица 1
Активность циклического фотофосфорилирования
хлоропластов опытных сортов в зависимости от предварительной обработки их светом и ДТТ
Вариант Эритроспермум 8202 Саратовская 52
мкмоль Фн • мг • • ЮГ1 • ч-1 % мкмоль Фн • мг • • хл-1 • ч-1 %
1. Темнота — ДТТ (контроль) 100,0 ± 9,4 100 180,4 ± 2,9 100
2. Свет - ДТТ 78,5 ± 7,6 78,5 104,5 ± 8,6 58,0
3. Темнота + ДТТ 97,6 ± 8,4 97,7 164,5 ± 4,8 91,2
4. Свет + ДТТ 82,1 ± 10,6 82,1 131,2 ±6,4 72,7
Примечание. В табл. 1—3: 1 — темнота без ДТТ, 2 — свет без ДТТ, 3 — темнота с ДТТ, 4 — свет с ДТТ.
Предварительное освещение хлоропластов существенно снижало скорость циклического фотофосфорилирования при его последующем определении в полной реакционной смеси у обоих сортов. При этом хлоропласты активно фосфо-рилирующего сорта Саратовская 52 с высокой скоростью транспорта электронов подвергались более сильной фотодеструкции (до 58% от контроля) .
В ряде работ показано, что местом, наиболее чувствительным к действию света, является вторая фотосистема (ФС II), в том числе ее донор-ная (водоокисляющий комплекс) и акцепторная (пул PQ) стороны (Nedbal et al., 1986). В результате фотоинактивации ФС II образуются: триплетное состояние хлорофилла Pggo (Telfer et al., 1994), нарушается работа водоокисляющего комплекса (Krieger et al., 1998), может активироваться хлороды-хание (Hoefnagel et al., 1998), происходит перевосстановление ряда переносчиков электронов, в том числе Qa (Melis, 1999) и общего пула пласто-хинонов. Все эти процессы приводят к образованию активных форм кислорода (}02, 02, Н2О2, ОН и др.), которые участвуют в фотоокислительном разрушении фотосинтетического аппарата. Окислению могут подвергаться также SH-группы белков тилакоидов, как встроенных в мембраны, так и растворенных в строме и люмене; Н2О2 даже в низких концентрациях (0,2 мМ) способна окислять SH-группы белков (Торчинский, 1977). В связи с этим для исследования причин обнаруженных нарушений процессов фотофосфорилирования представляло интерес использовать ДТТ в качестве за-
щитного агента от окисления 8Н-групп во время предобработки светом хлоропластов опытных сортов.
Внесение ДТТ при световой предобработке оказывало четко выраженное защитное действие, сохраняя 8Н-группы белков, их конформацион-ную структуру и функциональную активность и снижая таким образом ингибирующее действие предварительного освещения на фосфорилирую-щую активность хлоропластов (табл. 1, вариант 4). Защитная реакция ДТТ была более эффективной для хлоропластов пшеницы Саратовская 52 с более высоким уровнем исходного фотофосфори-лирования, у которых ингибирование уменьшалось на 21,7%, а у сорта Эритроспермум 8202 — на 5,6%.
Снижение скорости синтеза АТФ после предварительного освещения тилакоидных мембран может быть обусловлено: 1) снижением мембранного потенциала (А1?) (УгеёепЬещ е! а1., 1992), от которого зависит начальная, наиболее высокая скорость синтеза АТФ (Огаап, Ой, 1981); 2) изменением конформационного состояния белков мембран и сопрягающего комплекса. Предварительное освещение, как показано в ряде работ, изменяет редокс-потенциал и зарядовое состояние белков хлоропластов (Эйнор, 1972; ОоН/еу е! а1., 1983). Установлено, что снижение мембранного потенциала при действии света в отсутствие АДФ приводит к формированию менее активной конформационной структуры СР1 (К опта!-ви-ТакаЫ, 1992). О светиндуцированном конфор-мационном изменении фермента свидетельствует также обнаруженное нами положительное действие ДТТ, проявляемое только на свету (табл. 1, вариант 4).
Согласно современным представлениям, активность синтеза АТФ в каталитическом центре СРх определяется величиной Ацн+, образующимся в результате работы ЭТЦ. Анализ данных табл. 2 показывает, что предварительное освещение хлоропластов в отсутствие АДФ, Фн и акцепторов электронов заметно снижало активность фотопоглощения Н+ у обоих сортов (вариант 2), но в большей мере у сорта Саратовская 52, который в контрольном варианте отличался более высокой скоростью фотопоглощения протонов. При совместной обработке хлоропластов светом и ДТТ (вариант 4) восстановитель оказывал защитное действие, которое, так же как и при определении фото-фосфорилирования, было более выражено у высокоактивного сорта (26,9% — у Саратовской 52 и 8,9% — у Эритроспермум 8202). Большая амплитуда изменений у высокоактивных хлоропластов может быть обусловлена особенностями кон-формации их АТФ-синтазной системы и ее редокс состоянием. Более высокое содержание лег-
кореагирующих 8Н-групп в СИ] Саратовской 52 по сравнению с СРх Эритроспермум 8202 (Гав-риленко, Бассарская, 1986) могло приводить к более легкой модификации их при предобработке светом и ДТТ и, как результат этого, к более сильному ингибированию светом и эффективной "защите" ДТТ фотофосфорилирования и поглощения протонов. Возможно, различное действие предварительного освещения на активно- и слабо-фосфорилирующие системы обусловлено тем, что они исходно находились в различных конфор-мационных состояниях (Гавриленко, Бассарская, 1986).
Таблица 2
Активность фотоиндуцированного поглощения
протонов хлоропластами опытных сортов в зависимости от предварительной обработки их светом и ДТТ
Вариант Эритроспермум 8202 Саратовская 52
мкмоль Н+ • мг • • юг1 • Ю-2 % мкмоль Н+ • мг • • хл"1 • Ю-2 %
1. Темнота — ДТТ (контроль) 27,69 ± 1,93 100 36,10 ± 1,50 100
2. Свет - ДТТ 20,86 ± 1,34 75,3 22,60 ± 2,10 62,6
3. Темнота + ДТТ 25,46 ± 1,79 91,9 34,04 ± 1,55 95,3
4. Свет + ДТТ 21,61 ± 1,30 78,0 30,45 ± 1,02 84,3
В ряде работ показано, что предварительное освещение, изменяя конформационную структуру мембран (Науаих, 1998), изменяет их диэлектрические свойства и увеличивает ионную, в том числе протонную, проницаемость мембран (Угес1еп-Ьещ е! а1., 1992). Можно предположить, что наблюдаемое в наших опытах снижение активности светиндуцированного поглощения протонов после предобработки светом хлоропластов связано с усилением пассивного оттока Н+ из люмена. Присутствие ДТТ в момент освещения оказывало защитное действие, так как позволяло сохранить конформационную структуру мембранных белков (УататоК), Вазе!, 1996), в том числе белков СРо (протонного канала), содержащего в III и IV субъединицах 8Н-группы (НшсЬеоп е! а1., 2001) и СИ], е субъединица которого также содержит 8Н-груп-пу и является регулятором тока Н+ через мембрану (Сара1сИ, 5сЬи1епЬе1'ё, 2000). Снижение протонного градиента после освещения хлоропластов в среде, не содержащей экзогенных акцепторов электронов, непосредственно связано с нарушением работы ЭТЦ и связанным с этим ослаблением электрон- и протонтранспортных функций ЭТЦ.
70
Тх 60
Tg 50
с; CD
ю 40
е
30 20 10 0
100%
Результаты определения скорости нециклического потока электронов хлоропластами опытных сортов в четырех вариантах даны в табл. 3. Можно видеть, что предобработка светом снижала активность нециклического потока электронов у трех исследованных сортов. При этом ингибирование было наибольшим у сорта Саратовская 52, проявлявшего в контрольном варианте наиболее высокую активность транспорта электронов, слабее выражено у Эритроспермум 8202 и наименьшее у сорта Эритроспермум 841 с минимальной скоростью электронного потока. Ингибирование светом нециклического потока электронов было существенно ниже, чем ингибирование циклического фосфо-рилирования и фотоиндуцированного поглощения протонов. Добавление ДТТ в темноте существенно увеличивало измеряемую затем скорость потока электронов у всех сортов, особенно у слабо-активных Эритроспермум 8202 и в большей степени Эритроспермум 841. Внесение ДТТ в смесь во время световой предобработки оказывало защитное действие, снижая ингибирующее действие света на транспорт электронов у всех систем, но было более эффективным для хлоропластов Саратовской 52 (22,8% по сравнению с 7,5% у Эритроспермум 8202).
Таблица 3
Активность нециклического потока электронов хлоропластов опытных сортов в зависимости
от предварительной обработки их светом и ДТТ
100%
68,2%
63,3%
36,5°/с
70,4%
94,6%
73,8%
ь
1
Вариант Эритроспермум 841 Эритроспермум 8202 Саратовская 52
мкмоль K3Fe(CN)6 • • мг хл 1 • ч 1 мкмоль K3Fe(CN)6 • • мг хл 1 • ч 1 мкмоль K3Fe(CN)6 • • мг хл 1 • ч 1
1. Темнота — ДТТ (контроль) 147,5 ± 3,9 160,8 ± 3,1 185,5 ± 7,4
2. Свет -ДТТ 141,1 ± 6,1 137,6 ± 5,3 137,9 ± 6,4
3. Темнота + ДТТ 276,7 ±4,1 269,1 ± 10,7 284,5 ± 15,6
4. Свет + ДТТ 253,3 ± 8,2 250,5 ± 12,8 276,4 ± 14,4
Представленные результаты позволяют считать, что нарушение потока электронов в наших опытах (освещение в отсутствие экзогенных акцепторов) являлось результатом перевосстановления переносчиков ЭТЦ. При этом главное значение в регуляции процессов фосфорилирования имело изменение функциональной активности компонентов ЭТЦ, осуществляющих трансмембранный перенос протонов в люмен на уровне водоокисляющего
Са2+-АТФазная активность СТ] хлоропластов пшеницы сортов Эритроспермум 8202 (темные столбики) и Саратовская 52 (светлые столбики) в зависимости от предварительной обработки их светом и ДТТ. 1 — темнота, без ДТТ; 2 — свет, без ДТТ; 3 — темнота с ДТТ; 4 — свет с ДТТ
комплекса (Krieger et al., 1998), пула PQ, цито-хром Ьб/f комплекса (Kramer et al., 2003) и связанное с этим снижение электрохимического протонного градиента, необходимого для синтеза АТФ. Защитное действие ДТТ на активность транспорта электронов было обусловлено сохранением кон-формационной структуры переносчиков составляющих ЭТЦ.
Ранее нами было установлено, что уровень фотофосфорилирования у генетически различных сортов пшеницы определяется не только особенностями работы электрон-транспортных систем и активностью поглощения протонов, но и в значительной мере спецификой каталитических и физико-химических свойств сопрягающего фактора 1 (Гавриленко и др., 1985; Гавриленко, Бассарская, 1986; Гавриленко и др., 1987; Бассарская, Гавриленко, 1988). Изолированные и очищенные белки CFj исследуемых сортов четко различались по сопрягающей и Са2+-АТФазной активностям, электрофоретической подвижности, заряду, содержанию легкореагирующих открытых SH-групп, определяющих редокс состояние и конформацион-ную структуру ферментов. Поэтому при исследовании физиологических механизмов, определяющих высокий уровень синтеза АТФ, было важно выяснить: как изменяется каталитическая активность CFj при предварительном раздельном и совместном действии света и ДТТ.
Данные по Са2+-АТФазной активности CFj, выделенных из хлоропластов, предварительно обработанных светом и ДТТ, представлены на рисунке. Сопрягающие белки активно фосфорилирую-щего сорта Саратовская 52 в контрольном варианте проявляли в 1,7 раза более высокую активность, чем CFj слабофосфорилирующего Эритроспермум 8202.
Предварительное освещение хлоропластов приводило к снижению активности Са2+-АТФазы у обоих сортов, но при этом, в отличие от предыдущих опытов, наибольшая степень ингибиро-
вания ферментативной активности отмечена у CF] слабофосфорилирующего сорта. В данном случае происходило резкое снижение Са2+-АТФазной активности CF] у сорта Эритроспермум 8202 — до 36,5% от контроля. Это могло быть обусловлено особенностями методики активации изолированных ферментов, осуществляемой при 65° в течение 5 мин, что приводило к существенным дополнительным конформационным перестройкам CFi обоих сортов.
Свет играет ключевую роль в регуляции каталитической активности сопрягающего фактора 1 (Junesch, Graber, 1985; Schumann et al., 1985). Показано, что при освещении хлоропластов в отсутствие АДФ и Фн в CFi происходят энергозависимые конформационные перестройки с изменением функционального состояния фермента (Ко-matsu-Takaki, 1992). На каталитические свойства CF] сильно влияют локальные структурные изменения у субъединицы (Schumann et al., 1985; Са-paldi, Schulenberg, 2000). В условиях наших экспериментов перевосстановление ЭТЦ могло приводить к образованию активных форм кислорода, которые способны окислять, в том числе регуля-торные SH-группы как мембранной части — CFq, так и каталитической — CFi. Сульфгидрильным группам (цистеиновым остаткам) CFo—CFi принадлежит особая роль в регуляции каталитической активности АТФсинтазного комплекса. В норме регуляция АТФсинтазной активности хлоропластов связана с тиоредоксин-регулируемым восстановлением дисульфидной связи до SH-групп остатков цистеина отдельных субъединиц. В сопрягающем факторе 1 обнаружено (Hisabori et al., 1999) 11 цистеиновых остатков (по одному в каждой из трех а и трех ß субъединицах, четыре — в у, один — в е субъединице), непосредственно участвующих во взаимодействии у субъединицы при ее ротации с а, ß, и е субъединицами; е cys 108 контролирует АТФазную функцию фермента. Сульф-гидрильные группы участвуют также во взаимодействии субъединиц III CFo с у и между III и IV субъединицами мембранной части фермента — Fo (Hutcheon et al., 2001), обеспечивающих поток Н+ из люмена в строму. Окисление любой из этих SH-групп приводит к резкому снижению активности фермента. В условиях наших экспериментов все перечисленные изменения, происходящие вследствие его световой модификации, могли приводить к снижению АТФазной активности CFi и синтетазной активности всего сопрягающего комплекса CFq—CFi.
При освещении хлоропластов с ДТТ так же, как и в других опытах, восстановитель проявлял защитное действие. Са2+-АТФазная активность CF] сорта Эритроспермум 8202 в варианте с ДТТ почти достигала контрольного уровня. Более эффективное защитное действие ДТТ у данного сорта
определяется, по-видимому, исходным редокс-сос-тоянием фермента еще в контрольном варианте. Ранее нами было обнаружено более низкое содержание легкореагирующих SH-групп в CF] этого сорта по сравнению с белком Саратовской 52 при равном общем количестве SH-групп (Гавриленко и др., 1986).
Анализ полученных в работе результатов показал, что более выраженное ингибирование светом процессов преобразования энергии происходило в хлоропластах пшеницы с высокой скоростью электронного транспорта и могло являться результатом перевосстановления компонентов ЭТЦ, быстрого образования активных форм кислорода и оксидативного стресса. Представляло интерес исследование в опытных вариантах действия аскорбиновой кислоты (АК) как важнейшего защитного агента от оксидативного стресса у растений (Asada, 1999; Horemans et al., 2000).
Действие предварительной обработки светом хлоропластов пшеницы Саратовская 52 в присутствии и отсутствие АК представлено в табл. 4. Результаты этой серии опытов показали, что световая предобработка, ингибируя все исследованные процессы, в большей мере (более чем в 2 раза) ингибировала нециклическое фотофосфорили-рование. Резкое уменьшение значения Р/2ё (в 2 раза) указывало на разобщающее действие света. Эти данные, вместе с данными по фотоиндуци-рованному поглощению протонов хлоропластами Саратовской 52 (табл. 2, вариант 2), где ингибирование составляло около 40% по сравнению с контролем, позволяют говорить о том, что свет, являясь главным редокс-фактором, вызывающим изменение в состоянии компонентов ЭТЦ и ее функциональной активности, оказывает более выраженное действие на редокс-состояние сопрягающих белков (как мембранной протонпереносящей части — CFo, так и каталитической — CFi) энер-гопреобразующей системы хлоропластов.
Добавление АК в темноте вызывало активацию процессов, измеряемых затем в хлоропластах в стандартных условиях. Это могло быть обусловлено тем, что АК не только защищает растение от активных форм кислорода, образующихся на свету при предобработке, но и является редоке-регулятором, модулятором ферментативной активности, активатором и кофактором ряда ферментов (Horemans et al., 2000).
Внесение АК во время предобработки светом существенно снижало световое ингибирование циклического и нециклического фотофосфо-рилирования. В присутствие АК Р/2ё повышался до исходного значения. Эти данные подтверждают предполагаемый нами механизм ингибирую-щего действия предварительного освещения на фотоэнергетические процессы хлоропластов. Резкое снижение активности циклического и нецикличе-
Таблица 4
Активность циклического (I), нециклического (II) фотофосфорилирования и нециклического потока электронов (III) хлоропластов Саратовской 52 в зависимости от предварительной обработки их светом и 0,1 мМ АК
Вариант I II III Р/2е
мкмоль Фн • мт • • ЮГ1 • ч-1 мкмоль Фн • мт • • ЮГ1 • ч-1 мкмоль K3Fe(CN)6 • • мт хл 1 • ч 1
1. Темнота (контроль) — АК 140,8 ± 8,2 94,7 ± 6,9 164,4 ± 3,1 1,15
2. Свет -АК 81,3 ± 3,5 41,4 ±7,9 144,8 ± 1,6 0,57
3. Темнота + АК 183,1 ±6,0 128,8 ± 11,8 173,3 ± 2,3 1,49
4. Свет + АК 148,9 ± 12,1 88,8 ± 5,9 155,2 ± 1,9 1,14
Примечание. 1 — темнота без АК; 2 — свет без АК, 3 — темнота с АК, 4 — свет с АК.
ского фотофосфорилирования после предварительного освещения хлоропластов в отсутствие экзогенных акцепторов электронов, особенно у активно фосфорилирующего сорта Саратовская 52 с исходно высокой скоростью транспорта электронов, могло быть обусловлено быстрым перевосстановлением компонентов ЭТЦ и образованием активных форм С>2 с последующей оксидативной деградацией переносчиков, участвующих в генерации AjJjj+. Одновременно с этим происходит окисление SH-групп цистеина и других аминокислот, непосредственно участвующих в преобразовании энергии AjJjj+ в роторное движение у субъединицы и взаимодействии ее с а, ß и е субъединицами CF] и субъединицами III CFq. В результате этих процессов происходило наблюдаемое нами снижение функциональной активности каталитических центров ß субъединиц и синтеза АТФ. Защитное действие АК, которая является необходи-
мым медиатором Н2О—Н2О цикла, связано с разрушением образующихся активных форм кислорода и прежде всего Н2О2 (Asada, 1999), предохраняя таким образом энергопреобразующую систему хлоропластов от оксидативной деградации.
Результаты проведенных исследований показали, что механизмы регуляции отдельных процессов, сопряженных с синтезом АТФ (включая транспорт электронов, формирование протонного градиента, функционирование субъединиц сопрягающих белков — CFo—CFi), образуют общую сложную регуляторную систему, нарушение отдельных звеньев которой приводит к снижению общего синтеза АТФ в хлоропластах.
Высокий уровень синтеза АТФ активно фосфо-рилирующими системами обусловлен спецификой структурно-функциональной организации CFo—CFi и всего фотоэнергетического комплекса хлоропластов. Для этих систем характерны высокая скорость транспорта электронов и фотопоглощения протонов, а также продуктивное использование энергии образующегося Ajljj"1" при взаимодействии отдельных субъединиц сопрягающегося комплекса, что завершается более активным синтезом АТФ в каталитических центрах CF].
Решающая роль при этом принадлежит ре-докс-состоянию системы и соотношению SH- и S—S групп. При восстановлении дисульфидной связи система становится более конформационно подвижной и более работоспособной. Это позволяет говорить о существенном значении физиоло-го-биохимических редокс-механизмов в регуляции работы АТФсинтазы. Высокое содержание легко реагирующих SH-групп в препаратах CF] активно фосфорилирующих систем (Гавриленко, Бассарская, 1986) определяет высокоактивную конформацион-ную структуру каталитических белков сопрягающего комплекса и высокую активность сопряженных с этим реакций синтеза АТФ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Бассарская Е.М., Гавриленко В.Ф. 1988. Электрофоретический анализ сопрягающих белков (СГх), выделенных из хлоропластов пшеницы с различным уровнем фотофосфорилирования // Биол. науки. 8. 74-82.
Гавриленко В.Ф., Бассарская Е.М. 1986. АТФазная активность С Г |, изолированного из хлоропластов двух сортов пшеницы с различным уровнем фотофосфорилирования // Физиол. раст. 33. Вып. 2. 296-304.
Гавриленко В.Ф., Бассарская Е.М., Застрижная О.М. 1987. Влияние рН, концентрации Mg2+ и дитиотрейтола на реконструкцию АТФсин-тетазного комплекса хлоропластов пшеницы // Физиол. раст. 34. Вып. 2. 229—236.
Гавриленко В.Ф., Жигалова Т.В. 2003. Большой практикум по фотосинтезу / Под ред. И.П. Ермакова. М. С. 199.
Гавриленко В.Ф., Жигалова Т.В., Бассарская Е.М. 1985. Активность фотоэнергетических реакций у проростков различной по продуктивности сортов пшеницы // Физиол. и биохим. культ, раст. 17. № 3. 275-279.
Гавриленко В.Ф., Рубин Б.А., Жигалова Т.В. 1974. Фотосинтетическое фосфорили-рование изолированных хлоропластов и интенсивность фотосинтеза у проростков пшеницы различной продуктивности // С.-х. биология. 9. № 3. 345—351.
Степанова А.М., Никифорова Л.Ф. 1978. Методы биохимического анализа растений. Л. С. 62-66.
Торчинский Ю.М. 1977. Сера в белках / Отв. ред. А.Е. Браунштейн. М. С. 56.
Э й н о р Л . 1972. Изменение окислительно-восста-новительного потенциала в суспензии хлоропластов при освещении // Физиол. и биохим. культ, раст. 4. № 6. 27-34.
Arnon D. 1949. Copper enzymes in isolated chlo-roplasts. Polyphenoloxydas in Beta vulgaris // Plant Physiol. 24. N 1. 1-8.
Asada K. 1999. The water-water cycle in chlorop-lasts: Scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons // An. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50. 601-639.
В о у e г P . 1993. The binding change mechanism for ATP synthase — some probabilities and possibilities // Biochim. Biophys. Acta. 1140. N 3. 215—250.
Capaldi R., Schulenberg B. 2000. The ep-silon subunit of bacterial and chloroplast F^Fo ATPase. Structure, arrangement, and role of the e subunit in energy coupling within the complex // Biochim. Biophys. Acta. 1458. 263-269.
Capaldi R., Aggeler R. 2002. Mechanism of the FiFo-type ATP synthase, a biological rotary motor // Trends Biochem. Sci. 27. N 3. 154—160.
Chen P., Toribara Т., Warner U. 1956. Microdetermination of phosphorus // Analyt. Chem. 28. 1756-1763.
GoltzevV., DoltchinkovaV., Kantc-h e v a M . 1983. Photoinduced electrophoretic effects on thylakoid membranes of pea chloroplasts // Studia biophy-sica. 94. 57-58.
Graan Т., Ort D. 1981. Factors affecting the development of the capacity for ATP formation in isolated chloroplasts // Biochim. Biophys. Acta. 637. 447—456.
Havaux M . 1998. Carotenoids as membrane stabilizers in chloroplasts // Trends Plant Sci. 3. N 4. 147—151.
Hisabori Т., Kondoh A., Joshida M. 1999. The у subunit in chloroplast F| -ATPase can rotate in a unidirectional and counter-clockwise manner // FEBS lett. 463. N 1-2. 35-38.
Hoefnagel M., Atkin O., Wiskich J. 1998. Interdependence between chloroplasts and mitochondria in light and the dark // Biochim. Biophys. Acta. 1366. N 3. 235-255.
Horemans N . , Foyer C., Asard H. 2000. Transport and action of ascorbate at the plant plasma membrane // Trends Plant Sci. 5. N 6. 263—267.
Hutcheon M., Duncan Т., Ngai H., Cross R. 2001. Energy-driven subunit rotation at the interface between subunit a and the с oligomer in the Fq // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98. N 15. 8519-8524.
Junesch U., Graber P. 1985. The rate of ATP synthesis as a function of ApH in normal and dithio-threitol-modified chloroplasts // Biochim. Biophys. Acta. 809. 429-434.
Komatsu-Takaki M. 1992. Energy — dependent changes in the conformation of the chloroplast ATP synthase and its catalytic activity // Research in photosynthesis. Proc. IXth Inter. Congr. on Photosynthesis / Ed. N. Mu-rata. Nagoya. Japan. 2. 721—724.
Kramer D., Cruz J., Kanazawa A. 2003. Balancing the central roles of the thylakoid proton gradient // Trends Plant Sci. 8. N 1. 27—32.
Krieger A., Rutherford A., Jegers-c h o 1 d C . 1998. Thermoluminescence measurements on chloride-depleted and calcium-depleted photosystem II // Biochim. Biophys. Acta. 1364. N 1. 46—54.
M e 1 i s A . 1999. Photosystem II damage and repair cycle in chloroplasts: what modulated the rate of photoda-mage in vivo? // Trends Plant Sci. 4. N 4. 130—135.
Nedbal L., Setlikova E., Masojidek J., Setlik I. 1986. The nature of photoinhibition of isolated thylakoids // Biochim. Biophys. Acta. 848. 108—119.
Oster G., Wang H. 2000. Reverse engineering a protein: the mechanochemistry of ATP synthase // Biochim. Biophys. Acta. 1458. N 2-3. 482-510.
Richter M., Hein R., Huchzermeyer B. 2000. Important subunit interactions in the chloroplast ATPsynthase // Biochim. Biophys. Acta. 1458. N 2—3. 326-342.
Schumann J., Richter M . , McCarty R. 1985. Partial proteolis as a probe of the y subunit in activated soluble and membrane-bound chloroplast coupling factor 1 // J. Biol. Chem. 260. N 21. 11817-11823.
Strotmann H., Hesse, H., Edelmann K. 1973. Quantitative determination of coupling factor CP, of chloroplasts // Biochim. Biophys. Acta. 314. N 2. 202-210.
Telfer A., Bishop S., Phillips D., Barber J. 1994. Isolated photosynthetic reaction center of photosystem II as a sensitizer for the formation of singlet oxygen // J. Biol. Chem. 269. N 18. 13244-13253.
Vredenberg W., Shel J., Dassen H., Van Voorthuysen T. 1992. Electrogenesis and energy regulation in the photosynthetic membrane // Research in photosynthesis. Proc. IXth Inter. Congr. on Photosynthesis / Ed. N. Murata. Nagoya. Japan. 2. 681—685.
Yamamoto H., Bassi R. 1996. Carotenoids: Localization and function // Oxygenic photosynthesis: The light reactions / Ed. D. Ort. Kluwer Academic Publishers. Netherlands. P. 539-563.
Поступила в редакцию 26.04.04
ACTION OF PREILLUMINATION, DITHIOTHREITOL AND ASCORBATE ON PHOTOENERGETIC REACTIONS IN CHLOROPLASTS WITH DIFFERENT ATP SYNTHESIS ACTIVITY
E.M. Bassarskaya, V.F. Gavrilenko
The physiological and biochemical regulation mechanisms of photoenergetic processes were studied in chloroplasts of two wheat cultivars with different ATP synthesis activity. Separate and joint action of light, dithiothreitol and ascorbate were investigated. Inhibition of the photophos-phorylation, proton gradient forming, electron transport and Ca2+-ATPase activity of CFi were determinate under preliminary illumination without exogenous electron acceptors, ADP and Pi. It decreased in the presence of dithiothreitol and ascorbate. The obtained data suggest that preil-lumination cause conformational modifications and changing in functional activity of the energy transforming systems components. These processes can be the result of SH-groups reduction in CF()—CF| complex subunits by reactive oxygen species formed in electron transport chain.
УДК 576.535.5:576.32/36
ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ДОНОРА ОКСИДА АЗОТА З-НИТРО-4-ФЕНИЛФУРОКСАНА ПРИ ДЕЙСТВИИ НА КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ
Е.Ю. Плотников, К.В. Фрезе, А.Я. Коц,
Ю.В. Хропов , И.В. Овчинников, Н.Н. Махова
(кафедра физиологии микроорганизмов,
лаборатория химии ферментов биологического факультета МГУ;
лаборатория азотсодержащих соединений Института органической химии РАН, Москва)
Регуляция процесса клеточной гибели (апопто-за) является одной из центральных проблем биологии клетки, поскольку регулирует гомеостаз всей клеточной популяции многоклеточного организма. Известно, что запуск программы, ведущей к смерти клетки, может осуществляться как специфическими сигналами (например, цитокинами или гормонами), так и неспецифическими, такими как радиация, повышение температуры или действие окислителей. В развитии апоптотического процесса участвует множество сигнальных молекул, многие из которых регулируют и другие важные функции организма.
К физиологическим факторам, способным запускать в клетках апоптотическую программу, относится оксид азота (N0) — одна из ключевых сигнальных молекул, регулирующих функции сер-дечно-сосудистой, нервной и иммунной систем организма (Брюне и др., 1998). В организме оксид азота вырабатывается специальным ферментом (Горрен, Майер, 1998), тогда как в экспериментах и медицине используются препараты-доноры экзогенного N0.
К числу перспективных доноров NO и потенциальных лекарственных препаратов относятся гетероциклические азотсодержащие соединения, в частности производные 1,2,5-оксадиазол-2-окси-да (фуроксана), которые являются спонтанными или тиолзависимыми донорами оксида азота. Они генерируют NO при реакции с тиолами (Feelisch et al., 1992; Medana et al., 1994) или другими нук-леофилами (Sorba et al., 1997). Фуроксаны представляют собой высокоактивные вазодилятаторы и стимуляторы рГЦ (Ferioli et al., 1995). Эти соединения активируют рГЦ, ингибируют агрегацию тромбоцитов и генерируют NO. Однако для всесторонней характеристики фармакологических свойств этих биологически активных соединений необходимо исследование других видов активности, проявляемых соединениями фуроксанового ряда, в частности цитотоксической и апоптогенной.
Целью данной работы было изучение in vitro цитотоксического действия нового биологически активного соединения — донора экзогенного NO З-нитро-4-фенилфуроксана (3NPF) и факторов, влияющих на устойчивость к нему. В качестве
