CC BY
73
УДК / UDC 635.21:581.1:547.587.52:632.111.6
УЧАСТИЕ КОФЕЙНОЙ КИСЛОТЫ В РЕГУЛЯЦИИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ В УСЛОВИЯХ ГИПОТЕРМИИ
THE PARTICIPATION OF CAFFEIC ACID IN THE REGULATION OF PHYSIOLOGICAL PROCESSES OF POTATO PLANTS UNDER CONDITIONS OF
THE HYPOTHERMIA
Макеева И.Ю., аспирант Makeeva I.Yu., Postgraduate Student Пузина Т.И., доктор биологических наук, зав. кафедрой Puzina T.I., Doctor of Biological Sciences, Head of Department ФГБОУ ВО «Орловский государственный университет имени И.С. Тургенева», Орел, Россия Federal State Budgetary Educational Establishment of Higher Education "Orel State University named after I.S. Turgenev", Orel, Russia E-mail: [email protected]
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА
кофейная кислота, гипотермия, фотохимическая активность хлоропластов, состояние мембран, рост.
KEY WORDS
caffeic acid, hypothermia, photochemical activity of chloroplasts, the conditions of membranes, growth.
Введение. Растительный организм обладает уникальной способностью синтезировать вторичные метаболиты. Это низкомолекулярные вещества, которые характеризуются высокой физиологической активностью. Их количество чрезвычайно велико, однако физиолого-биохимическая роль разных групп данных соединений в растительном организме изучена в разной степени [1, 2]. Что касается фенольных соединений, то в основном исследователи уделяют внимание флавоноидам, которые играют важную роль в биохимической адаптации растений, обладая антиоксидантными свойствами [3]. Другие представители фенольных соединений, а именно фенилпропаноиды, изучены в меньшей степени. В последнее время появился ряд работ, касающихся изучения действия препарата «Циркон», синтезированного отечественной фирмой «НЭСТ-М» на основе гидроксикоричных кислот, являющихся представителями фенилпропаноидов [4, 5]. Следует отметить, что для выявления роли гидроксикоричных кислот в реакциях метаболизма важно использовать не их смесь, а участие отдельных представителей, так как каждый из них имеет особенности в строении и, как следствие, обладает спецификой действия. Так, большинство гидроксикоричных кислот (n-оксикоричная, феруловая, синаповая) в растительном организме находятся в связанном состоянии, тогда как кофейная кислота - в основном, в свободном виде и способна к передвижению [1]. Показано, что кофейная кислота повышает устойчивость растений к действию биотических факторов: к вирусным инфекциям у плодовых и ягодных культур [6], к мучнистой росе у пшеницы [7], к ржавчинной инфекции у ржи [8]. Лишь в единичных работах отмечается ее роль в устойчивости растений к
абиотическим факторам среды [9, 10]. В ряде работ показано действие кофейной кислоты на ростовые реакции органов растений, однако при этом отмечается ее неоднозначный эффект [11].
Цель работы состояла в исследовании действия кофейной кислоты на мембранные процессы (фотохимическую активность изолированных хлоропластов, коэффициент повреждения мембран), активность антиоксидантной системы и рост растений картофеля в условиях двухчасовой гипотермии (-2°С).
Условия, материалы и методы. Объектом исследования служили растения картофеля (Solanum tuberosum L.) сорта Жуковский ранний селекции ВНИИ КХ (Коренёво, Россия). Растения выращивали в условиях лаборатории «Регуляция роста и развития растений» Орловского госуниверситета. Для получения 21-дневных побегов возобновления клубни картофеля, вышедшие из состояния покоя, переносили из овощехранилища в условия лаборатории, где их проращивали при температуре 20±2°С в контейнерах с влажными опилками в начале в темноте, а после появления всходов на поверхности субстрата, при комнатном освещении.
Гипотермию создавали, помещая контейнеры с растениями в низкотемпературный шкаф Т 25/01 (Россия) на 2 часа при температуре -2°С, имитирующей заморозки.
Варианты опыта включали опрыскивание побегов возобновления через 15 суток после появления всходов 0.1 мМ раствором кофейной кислоты (Sigma, США). Контрольные растения опрыскивали водой. Исследования проводили через 7 суток после обработки растений.
Фотохимическую активность изолированных хлоропластов определяли по количеству восстановленного на свету феррицианида калия [12]. Среда выделения хлоропластов содержала 0.35 М NaCl и 0.05 М Трис^^-буфер (pH 8). Гомогенат фильтровали и дважды центрифугировали при 2000 и 8000 об/мин. После ресуспендирования 0.035 М NaCl суспензию хлоропластов с 0.002 М K3Fe(CN)6 помещали в бюксы. Часть бюксов выставляли на свет (интенсивность освещения 20000 лк) в специально смонтированную установку с охлаждением (18°С). Часть бюксов помещали в темноту. Экспозиция составляла 10 мин. Реакцию гасили 5% ТХУ. Оптическую плотность измеряли на КФК-3 («ЗОМЗ», Россия) при длине волны 420 нм. Степень повреждения мембран определяли по выходу электролитов по методу, описанному [13]. Для этого навеску листьев заливали 10 мл дистиллированной воды и оставляли на 4 часа при комнатной температуре, после чего определяли электропроводность на кондуктометре «Эксперт 002» («Эконикс-Эксперт», Россия). Полный выход электролитов определяли после разрушения мембран кипячением в течении 20 минут. Затем рассчитывали коэффициент повреждения мембран по формуле (1):
Т - т
КП= т--100%, (1)
100 - т0
где Ld - выход электролитов из ткани листьев растений при действии гипотермии (% от полного выхода электролитов);
Lo - выход электролитов из тканей растений в оптимальных условиях (% от полного выхода электролитов).
Содержание малонового диальдегида определяли по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой при нагревании [14]. Активность супероксиддисмутазы определяли по реакции восстановления нитросинего
тетразолия, запускаемой рибофлавином [15]. Массу органов измеряли на электронных весах ВСТ (Россия).
На рисунках представлены средние арифметические из 4-5 биологических повторностей и их стандартные ошибки. Аналитическая повторность 3-5-кратная. Достоверность результатов оценивали с помощью критерия Стьюдента, считая достоверными различия при уровне доверительной вероятности выше 0.95.
Результаты и обсуждение. Исследование фотохимической активности изолированных хлоропластов выявило некоторое различие в скорости транспорта электронов, сопряженного с нециклическим
фотофосфорилированием в присутствии кофейной кислоты (рис.1). Так, в бесстрессовых условиях кофейная кислота на 11% стимулировала фотохимическую активность хлоропластов. Больший эффект отмечен сразу же после действия 2-часовой гипотермии (-2°С). Так, восстановление феррицианида в варианте с кофейной кислотой увеличилось на 37% против контроля.
30
з го 1 1 20 ^ О
10
□ Контроль
I Кофейная кислота
Оптимальные температурные условия
2-часовая гипотермия
Рисунок 1 - Действие кофейной кислоты на фотохимическую активность
хлоропластов
Возрастание скорости световых реакций фотосинтеза при обогащении растений кофейной кислотой, возможно связано с изменением гормонального статуса. В наших предыдущих исследованиях показано, что кофейная кислота повышает уровень ауксинов [16]. Известна положительная роль данной группы фитогормонов в функционировании активных центров фотосистемы II [17]. Не исключено, что эффект кофейной кислоты на фотохимическую активность хлоропластов может быть связан и с состоянием их мембран. В этой связи было изучено влияние кофейной кислоты на целостность мембран в условиях гипотермии.
Данные рисунка 2 свидетельствуют о том, что кофейная кислота существенно снижает коэффициент повреждения мембран (в 2,5 раза), рассчитанный по утечке электролитов в условиях гипотермии.
5 п
<п о
° 0
□ Контроль
I Кофейная кислота
Рисунок 2 - Влияние кофейной кислоты на утечку электролитов через мембраны при действии гипотермии
0
О степени целостности мембран может свидетельствовать и содержание малонового диальдегида - конечного продукта перекисного окисления липидов (рис. 3). Данный показатель увеличился в условиях стресса (в 1,8 раза), однако кофейная кислота сдерживала накопление малонового диальдегида как в оптимальных, так и в стрессовых условиях (почти на 25%).
□ Контроль
I Кофейная кислота
Оптимальные температурные условия
2-часовая гипотермия
Рисунок 3 - Действие кофейной кислоты на содержание малонового
диальдегида
Протекторный эффект кофейной кислоты на состояние мембран возможно обусловлен активизацией работы антиоскидантной системы, утилизирующей активные формы кислорода в условиях стресса. Определение активности фермента супероксиддисмутазы (рис. 4) показало усиление нейтрализации супероксидрадикала при обработке кофейной кислотой. Наибольший эффект кофейной кислоты проявился в стрессовых условиях (55% против 22% по сравнению с оптимальными температурными условиями).
(U
>у
ci О О
60 п
30 -
С
□ Контроль
I Кофейная кислота
Оптимальные температурные условия
2-часовая гипотермия
Рисунок 4 - Влияние кофейной кислоты на активность супероксиддисмутазы
Кофейная кислота оказала неоднозначное действие на ростовые показатели побегов возобновления картофеля через 10 суток после действия 2-часового стресса (рис.5).
(а)
150 -
15 1
s 10 -
о
го"
о
5 -
m
□ Контроль
■ Кофейная кислота
100 -
к го
Ср
л О
50 -
Масса растения Масса корневой системы
Рисунок 5 - Действие кофейной кислоты на ростовые показатели растений через 10 суток после действия гипотермии: (а) высота побега; (б) сырая масса
0
0
0
Так, высота растений не изменилась. Возможно, это связано с тем, что в оптимальных условиях кофейная кислота не влияла на уровень гиббереллинов, ответственных за регуляцию роста растений в высоту [18]. Что касается массы растения, то выявлено ее увеличение почти на 30% по сравнению с контролем. Одновременно надо отметить, что в 1,8 раза увеличилась масса придаточных корней побегов возобновления.
Выводы. Полученные результаты показали, что кофейная кислота -представитель гидроксикоричных кислот, в условиях 2-часовой гипотермии (-2°С) сохраняет положительный эффект бесстрессовых условий на фотохимическую активность изолированных хлоропластов как за счет уменьшения деградации мембран, так и активизации работы антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы, что в конечном итоге положительно сказалось на массе растений.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Бахтенко Е.Ю., Курапов П.Б. Многообразие вторичных метаболитов высших растений. - Вологда, 2008. - 264 с.
2. Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты / Под ред. Н.В. Загоскиной. - М.: ИФР РАН, 2015. - 849 с.
3. Куркина А.В. Флавоноиды как критерий качества лекарственного сырья и препаратов фармакопейных растений // Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты / Под ред. Н.В. Загоскиной. - М.: ИФР РАН, 2012. - С. 571-577.
4. Малеванная Н.Н., Пермитина Г.В. Некоммерческое научно-производственное партнерство «Нэст М» предлагает: Регуляторы роста растений на природной основе с использованием последних достижений Российской науки // Гавриш. - № 1. - 2005. - С. 19-22.
5. Будыкина Н.П., Алексеева Т.Ф., Хилков Н.И., Малеванная Н.Н. Эффективность применения препарата циркон на картофеле и капусте цветной // Агрохимия. - 2007. - № 9. - С. 32-37.
6. Петрова А.Д., Упадышев М.Т. Хемотерапия вирусов с использованием фенолкарбоновых кислот на плодовых и ягодных культурах // Материалы докладов VII Международного симпозиума «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» / ИФР РАН. - М., 2009. - С. 207.
7. Волынец А.П., Пшеничная Л.А. Фенольные соединения злаков как фактор устойчивости к фитопатогенным грибам // Сборник тезисов VI Симпозиума по фенольным соединениям / ИФР РАН. - М., 2004. - С. 19.
8. Корытько Л.А., Мельникова Е.В. Роль свободных фенолкарбоновых кислот в некротической защитной реакции ржи к ржавчинной инфекции // Материалы докладов VII Международный Симпозиум по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты / ИФР РАН. - М., 2009. - С. 131.
9. Klein A., Keyster M., Ludidi N. Caffeic acid decreases salinity-induced root nodule superoxide radical accumulation and limits salinity-induced biomass reduction in soybean // Acta Physiologiae Plantarum - 2013. - V. 35, Is. 10. - P. 3059-3066.
10. Wan Y.Y., Zhang Y., Zhang L., Zhou Z.Q., Li X., Shi Q., Wang X.J., Bai J.G. Caffeic acid protects cucumber against chilling stress by regulating antioxidant
enzyme activity and proline and soluble sugar contents // Acta Physiologiae Plantarum. - 2015. - V. 37. - № 1. - P. 1706.
11. Волынец А.П., Башко Н.П. Росторегулирующая активность фенольных конъюгатов // Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты / Под ред. Н.В. Загоскиной, Е.Б. Бурлаковой. - М.: Научный мир, 2010. - С. 265-271.
12. Гавриленко В.Ф., Жигалова Т.В. Большой практикум по фотосинтезу. - М.: Академия, 2003. - 256 с.
13. Лукаткин А.С., Башмаков Д.И., Кипайкина Н.В. Протекторная роль обработки тидиазуроном проростков огурца при действии тяжелых металлов и охлаждения // Физиология растений. - 2003. - Т.50. - №3. - С. 346-348.
14. Лукаткин А.С., Голованова В.С. Интенсивность перекисного окисления липидов в охлажденных листьях теплолюбивых растений // Физиология растений. - 1988. - Т.35. - №4. - С. 773-780.
15. Beauchamp Ch., Fridovicl I. Superoxide Dismutase improvide Assays and Assay Applicable to Acryl amide Gels // Anal.Biochem. - 1971 - V.44. - 276-287.
16. Пузина Т.И., Макеева И.Ю. Участие кофейной кислоты в регуляции продукционного процесса картофеля Solanum tuberosum // Агрохимия. -2015. - № 6. - С. 63-68.
17. Bushman C., Lichtenthaler H.K. Hill-activity and P700 concentranion of chloroplasts isolated from Radish seedling treated with indoleacetic acid, Kinetin or gibberellic acid // Z.Naturforsch. - 1977. - V. 32 (9-10). - P. 798-802.
18. Макеева И.Ю., Пузина Т.И. Влияние кофейной кислоты на содержание фитогормонов и ростовые реакции Solanum tuberosum в зависимости от состояния тубулинового цитоскелета // IX Международный симпозиум «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» / Под ред. Н.В. Загоскиной. - М.: ИФР РАН, 2015. - С. 356-361.
