CC BY
122
УДК 616.9-07-092-037
ЦИТОКИНЫ РАННЕЙ ФАЗЫ ВОСПАЛЕНИЯ У БОЛЬНЫХ ОСТРОЙ РЕСПИРАТОРНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
Ю.В. ИВАНОВ1 М.В. ШИПИЛОВ2 В.В. ИВАНОВ3
Клиническая больница №83 Федерального медико-биологического агентства России, г. Москва
Смоленский государственный университет
3) Консультативно-диагностическая поликлиника №1, г. Смоленск
e-mail: med_infect@land.ru
Исследована концентрация белков ранней фазы воспаления: интерферона-а (1РЫ-а) и интерлейкина-8 (1Ь-8) - в сыворотке крови 96 больных острыми респираторными вирусными инфекциями методом иммуноферментного анализа. Контролем служила кровь здоровых доноров. Определено повышение 1РЫ-а в остром периоде гриппа рНШ1 (среднетяжёлого и тяжелого течения), среднетяжелых форм парагриппа и респираторно-синцитиальной вирусной инфекции, а ^-8 - в остром периоде аденовирусной инфекции (среднетяжёлой формы) и при тяжелом течении гриппа рНШ1. Только тяжёлое течение гриппа рНШ1 характеризовалось одновременным повышением 1РЫ-а и 1Ь-8 (причём повышение 1Ь-8 было многократным). Полученные результаты были использованы при создании экспертной системы "Экспресс-диагностика и прогноз течения ОРВИ".
Ключевые слова: интерферон-а, интерлейкин-8, грипп, парагрипп, аденовирусная инфекция, респираторно-синцитиальная вирусная инфекция.
Введение. Интерферон-а (1КЫ-а) и Интерлейкин-8 (1Ь-8) являются регуляторными белками, активно участвующими преимущественно в начальном этапе воспалительного процесса. Они относятся к тем цитокинам, которые "запускают" каскад цитокиновых реакций, обеспечивающих адекватный врождённый неспецифический локальный и системный ответ на внедрение чужеродного агента. Повышенная продукция ГРЫ-а иммунокомпетентными клетками в месте воспаления происходит практически сразу после внедрения вируса (уже через 30-40 минут), а повышенная концентрация данного цитокина в периферической крови определяется через 2-8 часов с начала запуска инфекционного процесса [1, 3].
Основная функция белков ранней фазы состоит в клеточной активации [1, 3-5]. Так, ГРЫ-а является наиболее мощным из цитокинов активатором макрофагов. К тому же, он активирует КК-клетки и подавляет пролиферацию Т- и В-лимфоцитов. Основная роль 1Ь-8 состоит в хемотаксическом и активирующем воздействии, прежде всего, на нейтрофилы: в дегрануляции и стимуляции лейкоцитов, усилении миграции фагоцитов в место внедрения чужеродного микроорганизма, следующих по градиенту концентрации сигнала в направлении к его источнику, и стимуляции фагоцитоза, а также в усилении иммунокомпетентными клетками синтеза молекул адгезии [4, 5]. Как и другие про- и противовоспалительные цитокины, данные белки являются важнейшим звеном биологической мультисистемы - "цитокиновой сети", необходимой организму для осуществления межклеточных взаимодействий, что является основой поддержания клеточного гомеостаза [1, 3].
Хотя продукция белков-регуляторов в зоне воспаления осуществляется многочисленными клетками организма, не обязательно относящимися к иммунокомпетентным, более интенсивная продукция 1РЫ-а происходит активированными макрофагами, а 1Ь-8, помимо макрофагов, - нейтрофилами [5]. Так как при попадании в общий (системный) кровоток 1РЫ-а и 1Ь-8, как и любые другие цитокины, быстро разрушаются и/или связываются с соответствующими рецепторами, их высокий уровень в периферической крови определяется, преимущественно, при тяжёлых инфекционных заболеваниях (сепсисе, тяжёлом течении пневмонии, инфекции новорождённых и др.) с достаточно большой зоной поражения. Например, установленную прямую корреляцию между тяжестью течения и уровнем 1Ь-8 (с более высокими значениями у больных с неблагоприятным исходом) было рекомендовано использовать в качестве дополнительного прогностического критерия течения сепсиса [10].
Повышение уровня IFN-a в остром периоде со снижением до нормы в периоде реконвалесценции характеризует патогенез многих острых вирусных инфекций, в том числе и острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) [5]. Исследования уровня IL-8 в различных биологических жидкостях больных ОРВИ также проводились, но они были неполными и разнонаправленными. Так, повышенный уровень IL-8 в плазме крови и носоглоточной слизи был обнаружен у детей раннего возраста с тяжёлым течением респираторно-синцитиальной вирусной инфекции (РС-инфекции); причем этот высокий уровень IL-8 в плазме крови прямо коррелировал с тяжестью заболевания [7]. В недавнем исследовании больных гриппом pH1Ni достоверное повышение, оказавшееся значительным (в 8,2 раза), уровня IL-8 в сыворотке крови по сравнению с контрольной группой было определено именно у больных с тяжёлым течением заболевания. Этот повышенный показатель был статистически значимо выше, чем уровень IL-8 у больных со среднетяжёлым течением заболевания [8]. Другими исследователями [9] была определена повышенная концентрация IL-8 у больных с тяжёлым течением гриппа pH1Ni, характеризующимся развитием острого респираторного дистресс-синдрома. У больных же со среднетяжёлым течением гриппа pH1Ni уровень IL-8 достоверно не отличался от нормы, что дало авторам основание предположить, что хемокин IL-8 наиболее активно участвует в реализации системной воспалительной реакции, обусловленной гиперпродукцией провоспалительных цитокинов эффекторными клетками крови, именно при тяжёлом течении заболевания и - наряду с другими цитокинами (в частности, IL-6 и фактором некроза опухоли-a), уровень которых был повышен как при среднетяжёлой, так и тяжёлой формах, - также может являться ярким маркером тяжелого течения гриппа A/H1N1 [8, 9].
Однако в доступной нам литературе не оказалось работ, исследующих данные белки у больных ОРВИ различной этиологии (наиболее часто встречающихся в популяции) в сопоставлении друг с другом.
Цель настоящей работы - изучение динамики уровня белков ранней фазы воспаления (IFN-a и IL-8) у больных ОРВИ с определением возможной их патогенетической и прогностической роли.
Материалы и методы исследования. Обследовано 86 больных средней тяжести в возрасте 15-54 лет: гриппом pH1Ni (n=i8), гриппом A/H3N2 (n=17), аденовирусной инфекцией (п=17), парагриппом (n=2i) и РС-инфекцией (n=13). Отдельную группу (n=io) составили больные с тяжёлым течением pH1Ni и летальным исходом в возрасте 19-61 лет. Кровь забирали в остром периоде (1-2 день болезни) и периоде реконвалесценции (на 7-9 день болезни). Диагноз подтверждали с помощью метода полимеразной цепной реакции или реакции непрямой гемагглютинации (выявлением специфических антител с ростом их титра в 4 и более раз). Уровень цитокинов определяли в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа коммерческими тест-системами ЗАО "Вектор-Бест" (Россия).
Результаты клинических и лабораторных исследований были внесены в специально разработанные карты индивидуального обследования пациентов с последующим представлением в виде электронных таблиц Microsoft Excel 2007. Статистическая обработка результатов исследований была проведена с использованием пакета StatGraphics 15.0.
Нормальность распределения вариационных рядов (соответствие закону Гаусса) проверяли с помощью критериев согласия Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Вилкса, одного из самых мощных критериев нормальности. При выполнении гипотезы нормальности распределения в качестве точечной оценки характеристики центра группирования значений случайной величины использовали выборочное среднее (Mo) [2]. В случае нормального распределения каждой из выборок межгрупповые различия выявляли при помощи t-критерия Стьюдента и точного критерия Фишера для сравнения дисперсий. При не выполнении гипотезы нормальности распределения в качестве точечной оценки характеристики центра группирования значений случайной величины использовали медиану - показатель наименее подверженный влиянию со стороны индивидуальных колебаний признака. В таком случае выборки между собой сравнивали с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни -рангового критерия, хорошо приспособленного для анализа малых выборок и
робастного к виду закона их распределения, а также двухвыборочного критерия Колмогорова-Смирнова [2]. Уровень значимости при проверке всех статистических гипотез - р<0,05 (доверительная вероятность >0.95).
Контролем служила кровь 17 здоровых доноров в возрасте 19-40 лет, у которых медиана и диапазон значений 1Ш-а составили 0,85 (0-8,6) пг/мл, а 1Ь-8 - 8,3 (0,2250) пг/мл. Полученные нами значения контрольной группы лиц согласуются со средними показателями, полученными при обследовании сыворотки крови 68 здоровых доноров фирмой-производителем тест-систем "Вектор-Бест": 1ЕЫ-а - 0-5 пг/мл, 1Ь-8 2 пг/мл (0-10 пг/мл).
Результаты. Сравнительная характеристика динамики концентрации исследуемых цитокинов в остром периоде и периоде ранней реконвалесценции в сыворотке крови больных ОРВИ представлена в табл. 1.
Таблица 1
Сравнительная характеристика уровня цитокинов и ^-8)
у больных ОРВИ
Группы больных ОРВИ в зависимости от этиологии Медиана цитокина (диапазон значений), пг/мл
Период Цитокин Острый период Реконвалесценция
Грипп рНШ1 (среднетяжёлое течение) ШЫ-а 13,2 (0-82,6)*, п = 17 2,1 (0-13,7)*, п = 17
1Ь-8 10,2 (4,5-28,9)*, п = 15 14,1 (1,2-250), п = 14
Грипп рНШ1 (тяжёлое течение /умершие/) ШЫ-а 8,55 (0-500)*, п = 10 -
1Ь-8 104,5 (12,7-250)*, п = 10 -
Грипп Л/Н3Ы2 ШЫ-а 0,55 (0-31,1)**, п= 14 1,4 (0-19,5), п = 13
1Ь-8 14,55 (1,4-201,9)*, п= 14 5,85 (1,9-93,4), п = 12
Аденовирусная инфекция ШЫ-а 5,8 (0-148), п = 17 2,95 (0-51,6), п = 12
1Ь-8 51,6 (3,6-250)*, п = 17 11,85 (1,9-250), п = 12
Парагрипп ШЫ-а 9,05 (0-193,7)*, п = 18 2,25 (0-44,9), п = 16
1Ь-8 10,8 (2,0-250)*, п = 20 23,6 (4,3-111,2), п = 16
РС-инфекция ШЫ-а 4,95 (0,2-49,0)*, п = 12 2,7 (0-11,7), п = 13
1Ь-8 25,3 (1,7-176,3), п = 13 34,9 (0,8-250), п = 13
Примечание:
* - достоверные различия показателей в динамике заболевания (р<0,05).
** - достоверные различия между группой больных с тяжёлым течением гриппа рНШ1 и другими ОРВИ, находящимися в остром периоде заболевания (р<0,05).
* - достоверное отличие от контроля (р<0,05). п - число обследованных пациентов.
Отмечено повышение концентрации ШЫ-а в остром периоде среднетяжёлого (р<0,001) и тяжёлого течения гриппа рНШ1 (р<0,05), парагриппа (р<0,05),
РС-инфекции (р<0,05). Похожая тенденция выявлена и в остром периоде аденовирусной инфекции, но она не носила достоверного характера (р=0,055, р>0,05). У больных гриппом A/HзN2 в остром и реконвалесцентном периодах заболевания уровень 1КЫ-а в крови не изменялся.
Достоверных отличий концентрации у больных с тяжёлым течением
гриппа pHlNl в сравнении с его среднетяжёлым течением (острым периодом) определено не было (р>0,05), однако уровень статистически значимо был выше
у каждой из указанных двух выборок в сравнении с соответствующим периодом среднетяжёлого течения гриппа A/HзN2 (р<0,05).
У всех групп больных ОРВИ к периоду реконвалесценции уровень 1КЫ-а в сравнении с контролем был нормализован (р>0,05), что достаточно характерно для провоспалительных цитокинов, активно участвующих на начальном этапе инфекционного процесса (в фазе активации).
Наивысший уровень ^-8 (в более чем в 12 раз по сравнению с нормой) был зарегистрирован у лиц с тяжёлым течением pHlNl с неблагоприятным прогнозом (104,5 пг/мл), что может соответствовать максимальной активации иммунных клеток (прежде всего макрофагов) в зоне воспаления. Данная концентрация ^-8 была статистически значимой не только в сравнении с контролем (р<0,05), но и с острым периодом среднетяжёлого течения гриппа А как pHlNl (р<0,01), так и A/HзN2 (р<0,05), а также парагриппа (р<0,05). Помимо этого, определено статистически значимое повышение (в 6,2 раза) уровня ^-8 в остром периоде аденовирусной инфекции (51,6 пг/мл) по сравнению с контролем (р<0,05) и с группой больных среднетяжёлым течением гриппа pHlNl (р<0,05) с нормализацией данного показателя к периоду реконвалесценции.
В других группах обследуемых больных среднетяжёлой формой ОРВИ (грипп pHlNl, грипп A/HзN2, парагрипп, РС-инфекция), несмотря на визуальное повышение показателя и более значительный диапазон значений в исследуемые периоды заболевания, статистически значимого изменения уровня ^-8 в крови в сравнении с контролем выявлено не было (р>0,05).
Обсуждение результатов. В связи с преобладающим местным (дистантным), а не системным действием исследованных цитокинов, а также их быстрым разрушением и связыванием со специфическими рецепторами в кровотоке, не удивительно, что их концентрация в периферической крови очень слабо отражает те процессы, которые происходят в зоне воспаления, поэтому отсутствие изменений уровня и ^-8 при гриппе A/HзN2 является достаточно прогнозируемым
фактом.
В ходе настоящего исследования была определена следующая закономерность: в подавляющем большинстве среднетяжёлых форм ОРВИ изученной нами этиологии (грипп pHlNl, парагрипп, РС-инфекция, аденовирусная инфекция) в системном кровотоке отмечено повышение только одного из исследуемых факторов, что может свидетельствовать о превалировании в раннюю фазу инфекционного процесса (фазу активации) активности определённых клеточных популяций крови, ответственных за синтез белка-регулятора ранней фазы: моноцитов/макрофагов - !КЫ-а (чаще) или моноцитов/макрофагов и нейтрофилов - ^-8 (реже). И только тяжёлое течение гриппа pHlNl характеризовалось одновременным повышением уровня обоих факторов (причём в случае ^-8 это повышение было многократным). Данное обстоятельство наводит на мысль о возможном «сломе» защитных механизмов при гриппе рНШ1, характеризующимся бесконтрольной активацией как моноцитов/макрофагов, так и нейтрофилов с усиленной выработкой ими исследуемых цитокинов, прямо или косвенно (путём инициирования каскада цитокиновых реакций) участвующих в дальнейшем в реализации механизмов повреждения различных тканей с последующим нередким летальным исходом, т.е. в так называемом "цитокиновом шторме (буре)", что согласуется с данными литературы [8, 9].
В связи с определенной в результате исследования «обычной» схемой реагирования цитокиновой сети в виде умеренного повышения концентрации только одного из факторов: (чаще) или ^-8 (реже) -, отклонения от данной схемы
можно рассматривать как дисбаланс функционирования системы
иммунокомпетентных клеток. Наиболее выраженные изменения касались, кроме тяжелого течения гриппа pHiNi, и аденовирусной инфекции, в остром периоде которой было выявлено значительное (в 6 раз) повышение уровня IL-8. Возможно, избыточная стимуляция нейтрофилов, не наблюдаемая при других среднетяжёлых формах ОРВИ и характеризующаяся повышением продукции IL-8, при аденовирусной инфекции является компенсаторной реакцией иммунной системы на недостаточную активность макрофагов по выработке IFN-a, приводящей к "выпадению" части IFN-a из цепочки цитокиновых реакций. Выявленный в результате исследования нормальный уровень IFN-a в остром периоде данного заболевания, по-видимому объясняется тем, что IL-8 может ингибировать активность IFN-a [5].
Выводы. Таким образом, на примере белков ранней фазы воспаления выявлено, что оба фактора, играют важную роль в начальной фазе инфекционного процесса, причем при среднетяжёлых формах ОРВИ различного генеза обычно превалирует выработка IFN-a в сравнении с IL-8. Усиление же синтеза IL-8 соответствующими клеточными популяциями крови наблюдается лишь в остром периоде аденовирусной инфекции и при тяжёлом течении гриппа pHiNi.
Заключение. Высокий уровень IL-8 (в 10 и более раз) может указывать на тяжёлое, неблагоприятное течение гриппа pHiNi. Динамика уровня IFN-a, характеризующаяся повышением в остром периоде со снижением в сыворотке крови к периоду реконвалесценции при нормальных показателях IL-8, может свидетельствовать о благоприятном течении ОРВИ. На основе полученных данных концентрация исследуемых цитокинов в сыворотке крови была нами использована в качестве одного из дополнительных критериев прогноза в разработанной экспертной системе "Экспресс-диагностика и прогноз течения ОРВИ" [6].
В процессе проводимого лечения больных ОРВИ рекомендуется учитывать возможность развития цитокинового дисбаланса, связанного с усилением синтеза белков ранней фазы воспаления, в связи с чем в перспективе патогенетически обоснованным, по нашему мнению, будет устранение возникшего нарушения с помощью лекарственных препаратов, корригирующих уровень IL-8 и IFN-a. Особенно эта коррекция должна касаться лечения больных с тяжелым течением гриппа pHiNi.
Литература
1. Гавришева, Н.А. Инфекционный процесс: Клинические и патофизиологические аспекты: Учебное пособие. / Н.А. Гавришева, Т.В. Антонова. - СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2006.- 282 с.
2. Кобзарь, А.И. Прикладная математическая статистика. Для инженеров и научных работников / А.И. Кобзарь. - М.: Физматлит. - 2006. - 816 с.
3. Нагоев, Б.С. О роли цитокинов в регуляции иммунной системы при инфекционных заболеваниях / Б.С. Нагоев, М.Х. Нагоева, Э.А. Камбачокова // Материалы III Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням (Москва, 28-30 марта 2011 года). -Инфекционные болезни. - 20ii. - Том 9. - Приложение №1. - М. - 20ii. - С. 260.
4. Симбирцев, А. С. Интерлейкин-8 и другие хемокины / А.С. Симбирцев // Иммунология. - i999. - № 4. - С. 9 - i4.
5. Тотолян, А.А. Клетки иммунной системы / А.А. Тотолян, И.С. Фрейдлин. - СПб.: Наука. - 2000. - 231 с. - (серия учебных пособий. Т. 1., Т. 2).
6. Усков, А.А. Экспертная система "Экспресс-диагностика и прогноз течения ОРВИ" / А.А. Усков, М.В. Шипилов // Информатика, математическое моделирование, экономика: сборник научных статей по итогам Международной научно-практической конференции (г. Смоленск, 22 апреля 2011 г). - Смоленск. - 20ii. - Т.1 - С. 185-i88.
7. Bermejo-Martin, J.F. Predominance of Th2 cytokines, CXC chemokines and innate immunity mediators at the mucosal level during severe respiratory syncytial virus infection in children / J.F. Bermejo-Martin (and oth.) // Eur. Cytokine Netw. - 2007. -Vol. i8. - № 3. - P. i62-i67.
8. Bermejo-Martin, J.F. Thi and Thi7 hypercytokinemia as early host response signature in severe pandemic influenza / J.F. Bermejo-Martin (and oth.) // Crit Care. - 2009. - Vol. i3. - №6. -P. 20i.
9. Hagau, N. Clinical aspects and cytokine response in severe HiNi influenza A virus infection. / N. Hagau (and oth.) // Crit. Care. - 20i0. - Vol i4. - №6. - P 203.
10. Mera, S. Multiplex cytokine profiling in patients with sepsis / S. Mera (and oth.) // APMIS. - 20ii. - Vol. ii9. - №2. - P. i55-i63.
CYTOKINES EARLY PHASE OF INFLAMMATION IN PATIENTS WITH ACUTE RESPIRATORY VIRAL INFECTIONS
U.V. IVANOV M.V. SHIPILOV2 V.V. IVANOV3
1) Clinical hospital №83 of the Federal Medical-Biological Agency of Russia, Moscow
2) Smolensky State University
3) Advisory-diagnostic polyclinic №1, Smolensk
e-mail: med_infect@land.ru
Investigated the concentration of proteins of the early phase of inflammation: interferon-a (IFN-a) and interleukin-8 (IL-8) in the serum of 96 patients with acute respiratory viral infections by enzyme immunoassay. Control was blood of healthy donors. Defined increase of IFN-a in the acute stage of influenza pH1N1 (moderate and severe), moderate forms of parainfluenza and respiratory syncytial virus infection, and IL-8 - in the acute phase of adenovirus infection (moderate form) and in severe influenza pH1N1. Only the severity of influenza pH1N1 characterized by a simultaneous increase immediately IFN-a and IL-8 (increasing IL-8 was repeated). The results were used to create an expert system "Express-diagnosis and prognosis of ARVI".
Key words: interferon-a, interleukin-8, influenza, parainfluenza, adenoviral infection, respiratory syncytial virus infection, ARVI.
