CC BY
48
2012
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 11
Вып. 2
ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ
УДК 616.9-07-092-037
М. В. Шипилов, В. В. Иванов
УРОВЕНЬ ИНТЕРФЕРОНА-у ПРИ ГРИППЕ А
ООО «Смоленскмединвест», Смоленск
Одними из важнейших факторов, осуществляющих межклеточные взаимодействия для поддержания клеточного гомеостаза, являются интерфероны IFN относят к цитокинам, и они входят в состав биологической мультисистемы — «цито-киновой сети». Не подлежит сомнению факт важнейшей роли IFN в осуществлении врожденной неспецифической локальной и системной реакции организма в ответ на внедрение и репликацию вирусов [1-3].
Из известных на сегодняшний день типов IFN наиболее важное значение имеет №N-7, продукция которого может осуществляться практически всеми клетками человеческого организма (при соответствующей стимуляции), но чаще — активированными ^1-лимфоцитами, реже — В-лимфоцитами, NK-клетками, моноцитами/макрофагами. Данный цитокин способствует активации клеток моноцитарно-макрофагально-го звена, NK-клеток, Т- и В-лимфоцитов, что приводит к усилению их цитотоксично-сти, продукции молекул адгезии, а также к запуску целого каскада провоспалительных и противовоспалительных цитокинов [1-3]. Последнее подтверждается исследованием на модели инфекционно-токсического шока мышей, характеризующегося изначально тяжелым течением, когда исследователями было определено то, что №N-7 усиливает выработку клетками-продуцентами интерлейкина-4, интерлейкина-10, интерлейки-на-12, интерлейкина-17, эотаксина, так как после введения мышам антител к №N-7 уровень исследуемых факторов в крови статистически значимо уменьшался [4].
Предположение о том, что при утяжелении заболевания усиливается продукция №N-7 активированными ^1-лимфоцитами, подтверждается недавним исследованием сыворотки крови больных гриппом А/ШШ/2009, когда при не отличающейся от нормы концентрации №N-7 в периферической крови больных среднетяжелой формой гриппа А/ШШ/2009 было выявлено достоверное повышение его уровня при тяжелом течении заболевания, в связи с чем авторы посчитали этот повышенный уровень №N-7 отличительным признаком (критерием) тяжелого течения гриппа А/ШШ/2009 [5]. Однако в другом исследовании отсутствовали статистически значимые различия концентрации №N-7 как в сравнении среднетяжелого и тяжелого течения гриппа
© М. В. Шипилов, В. В. Иванов, 2012
А/Н1Ш/2009, так и с контролем [6]. В доступной нам литературе не оказалось работ по исследованию уровня №N-7 у больных гриппом А/Н3Ш.
Целью настоящей работы явилось исследование уровня №N-7 в периферической крови больных гриппом А разных типов (А/Н1Ш/2009, А/Н3Ш) среднетяжелой и тяжелой формой заболевания в остром и реконвалесцентном периодах.
Материалы и методы исследования. Обследовано 18 больных гриппом А/Н1Ш/2009 средней степени тяжести в возрасте 15-54 лет (9 мужчин и 9 женщин), у трех из которых в качестве фоновой патологии был выявлен хронический бронхит. Другой фоновой патологии обнаружено не было. Также были обследованы 10 больных в возрасте 19-61 лет (6 мужчин и 4 женщины) с тяжелым течением гриппа А/Н1Ш/2009 с летальным исходом, причиной которого была двусторонняя субтотальная/тотальная пневмония с развитием острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС).
Помимо этого, была исследована сыворотка крови 17 больных гриппом А/Н3Ш в форме средней тяжести в возрасте 16-51 лет (8 мужчин и 9 женщин) в те же периоды заболевания. У одной обследованной пациентки, больной гриппом А/Н3Ш, в качестве сопутствующего заболевания был выявлен хронический пиелонефрит (вне обострения), у двух — хронический бронхит; другой фоновой патологии обнаружено не было.
Степень тяжести гриппа А оценивали по выраженности интоксикационного и катарального синдромов. При среднетяжелой форме гриппа А заболевание начиналось остро, температура тела повышалась в пределах 38-40°С, симптомы интоксикации и катаральные явления были умеренно выражены. Длительность лихорадочного периода составляла 4-5 дней. Тяжелая форма гриппа характеризовалась внезапным началом заболевания, высокой (39,5°С и более) лихорадкой, резко выраженными симптомами интоксикации (адинамией, резкой головной болью, головокружением, обморочным состоянием, анорексией, рвотой, судорогами, сердечно-сосудистыми нарушениями). Данная форма осложнялась двусторонней пневмонией с развитием ОРДС с последующим (наступившим на 5-17 дни болезни) летальным исходом.
В качестве противовирусной терапии больным среднетяжелой формой гриппа А/Н1Ш/2009 (п = 15) и гриппа А/Н3Ш (п = 14) назначали осельтамивир по 75 мг 2 раза в сутки внутрь в течение 5 дней. Лечение осельтамивиром получали также 9 из 10 больных с тяжелым течением гриппа А/Н1Ш/2009 в той же дозе и длительностью курса. В лечении пациентов с тяжелым течением гриппа А/Н1Ш/2009 использовали респираторную поддержку в режиме по давлению аппаратом для искусственной вентиляции легких «Ньюпорт 150». Помимо этого, всем больным гриппом проводилась патогенетическая (дезинтоксикационная, жаропонижающая, антигистаминная, отхаркивающая) терапия согласно общепринятым схемам.
Кровь для исследования забирали в остром периоде (1-2 день болезни) и в периоде реконвалесценции (на 7-9 день болезни). Диагноз был подтвержден с помощью метода полимеразной цепной реакции или реакции непрямой гемагглютинации (выявлением специфических антител с ростом их титра в 4 и более раз). Уровень фактора определяли в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа коммерческими тест-системами ЗАО «Вектор-Бест», Россия [7].
Результаты клинических и лабораторных исследований были внесены в специально разработанные карты индивидуального обследования пациентов с последующим
представлением в виде электронных таблиц Microsoft Excel 2007. Статистическая обработка результатов исследований была проведена с использованием пакета StatGraphics 15.0.
Нормальность распределения вариационных рядов (соответствие закону Гаусса) проверяли с помощью критерия согласия Шапиро—Вилкса, одного из самых мощных критериев нормальности [8]. Из всех групп исследованных пациентов нормальным оказалось распределение лишь концентрации IFN-y у больных гриппом A/H3N2 в периоде реконвалесценции (критерий Шапиро—Вилкса составил р = 0,923). Таким образом, гипотеза нормальности распределения не была выполнена в большинстве вариационных рядов, что согласуется с литературными данными, свидетельствующими о том, что только 20% распределений количественных признаков, встречающихся в медико-биологических исследованиях, являются приближенно нормальными [9].
В связи с невыполнением гипотезы нормальности распределения большинства вариационных рядов известные критерии парных сравнений (t-критерий Стьюдента и точный критерий Фишера для сравнения дисперсий) не могли быть применены, и в соответствии с рекомендациями [9] были использованы методы непараметрической статистики. В частности, в качестве точечной оценки характеристики центра группирования значений случайной величины использовали медиану (Ме) — показатель, наименее подверженный влиянию со стороны индивидуальных колебаний признака. Также был определен интервал [25-й; 75-й перцентили] [8, 9]. Между собой выборки сравнивали с помощью непараметрических критериев Вилкоксона—Манна—Уитни (ВМУ) — рангового критерия, хорошо приспособленного для анализа малых выборок и робастного к виду закона их распределения, а также двухвыборочного критерия Колмогорова—Смирнова (КС) [8]. Уровень значимости при проверке всех статистических гипотез — р < 0,05 (доверительная вероятность > 0,95).
Контролем служила кровь 17 здоровых доноров в возрасте 19-40 лет (Ме = 0,1 пг/мл). Полученные нами значения IFN-y контрольной группы лиц согласуются со средним показателем, полученным при обследовании сыворотки крови 68 здоровых доноров фирмой-производителем тест-систем ЗАО «Вектор-Бест»: 2 пг/мл (с вариацией от 0 до 10 пг/мл).
Результаты исследования. Сравнительная характеристика динамики концентрации IFN-y в сыворотке крови больных гриппом А (в остром периоде и в периоде ре-конвалесценции) представлена в таблице 1. В результате проведенного исследования выявлено достоверное повышение концентрации IFN-y в остром периоде (КС р < 0,05) и в периоде реконвалесценции (КС р < 0,001) у больных среднетяжелой формой гриппа A/H1N1/2009 по сравнению с контролем. Аналогичные результаты, в виде статистически значимого повышения концентрации IFN-y в остром периоде (ВМУ, КС р < 0,05) и в периоде реконвалесценции (ВМУ, КС р < 0,05) по сравнению с контролем, были получены и при гриппе A/H3N2.
Кроме того, уровень IFN-y в остром периоде у больных с тяжелым течением гриппа A/H1N1/2009 был достоверно выше не только по сравнению с контролем (КС р < 0,05), но и со среднетяжелым течением гриппа A/H1N1/2009 (КС р < 0,001), что согласуется с данными литературы [5].
Изменение уровня IFN-y в течение заболевания при гриппе А носило разнонаправленный характер. Так, при гриппе A/H1N1/2009 было отмечено достоверное снижение концентрации цитокина к периоду реконвалесценции (КС р < 0,001). При гриппе
А/Н3Ш в течение всего заболевания концентрация №N-7 сохранялась стабильно высокой (ВМУ, КС р > 0,05).
Таблица 1. Сравнительная характеристика уровня №N-7 у больных гриппом А
Группы больных Медиана ТБ^у [25-й; 75-й перцентили], пг/мл
Период Острый период Период реконвалесценции
Грипп А/НШ1/2009 (среднетяжелое течение) 1,1 [0,27; 1,93]**#, п = 17 0,15 [0,04; 0,27]*#, п = 16
Грипп А/НШ1/2009 (тяжелое течение /умершие/) 1,3 [0,33; 2,31]#, п = 10 —
Грипп А/Н3№ 8,7 [2,17; 15,53]#, п = 13 6,3 [1,51; 11,02]#, п = 13
Контроль, пг/мл 0,1 [0,02; 0,18], п = 17
Примечание: * — достоверные различия показателя в динамике заболевания (КС р < 0,001); ** — достоверные различия между группой больных с тяжелым и среднетяжелым течением гриппа А/НШ1/2009 в остром периоде заболевания (КС р < 0,05); # — достоверное отличие от контроля (р < 0,05); п — число обследованных пациентов.
В остром периоде и периоде реконвалесценции у больных исследуемых групп самый низкий статистически значимый уровень ^N-7 — хотя и больший по сравнению с контролем — был у пациентов со среднетяжелым течением гриппа А/НШ1/2009 в сравнении с больными гриппом А/Н3Ш (ВМУ КС р < 0,05).
Обсуждение. В результате данного сравнительного исследования определено повышение уровня ^N-7 у всех групп больных гриппом А по сравнению с контролем, что подтверждает активное участие цитокина в патогенезе данного заболевания; ведь именно индукция №N-7 является основным (ядерным) звеном в защите клеток при гриппе, что связано с усилением резистентности клеток организма к вирусу гриппа, повышением клеточно-опосредованного иммунитета, активацией макрофагального звена, повышением презентации антигенов [1, 3, 4-6].
Однако при этом были выявлены следующие особенности иммунного ответа у больных разными типами вируса гриппа А. Так, при гриппе А/Н3Ш была выявлена наиболее высокая концентрация фактора в остром периоде без статистически значимого снижения его уровня к периоду реконвалесценции. Иная ситуация наблюдалась при гриппе А/Н1Ш/2009. При среднетяжелом течении данного заболевания отмечался более низкий по сравнению с гриппом А/Н3Ш уровень №N-7 уже в начале заболевания (хотя и превышающий норму). В последующем отмечено достоверное снижение концентрации к периоду реконвалесценции гриппа А/Н1Ш/2009, приближающееся практически к нормальным значениям.
Таким образом, у больных гриппом А/Н3Ш концентрация №N-7 в сыворотке крови в остром периоде заболевания достоверно превосходила соответствующий уровень №N-7 при гриппе А/Н1Ш/2009 (как среднетяжелого, так и тяжелого течения) в 7-8 раз, что, возможно, объясняется более выраженной активностью ^1-лимфоцитов по выработке данного белка. Еще больший ^1-ответ организма в виде повышенной в 42 раза
концентрации IFN-y был выявлен в реконвалесцентном периоде среднетяжелого гриппа A/H3N2 в сравнении с соответствующим показателем при гриппе A/H1N1/2009.
Достоверное повышение уровня IFN-y при тяжелом течении гриппа A/H1N1/2009 в сравнении с его среднетяжелым течением, выявленное в настоящем исследовании, подтверждается некоторыми литературными данными [5]. По нашему мнению, статистически значимый более высокий уровень IFN-7 при тяжелом течении гриппа A/H1N1/2009 (в сравнении с его среднетяжелым течением) может свидетельствовать о возрастающей роли цитокина при утяжелении состояния, требующей еще большего его количества для участия в каскаде цитокиновых реакций и реализации противовирусного иммунитета. Однако и этот уровень (гораздо меньший в сравнении с гриппом A/H3N2) оказывается недостаточно защитным, что и может служить одной из причин летального исхода.
В связи с тем, что уровень IFN-7 является центральным звеном в защите клеток от гриппозной инфекции [1], а также с особенностями его изменения в зависимости от типа вируса гриппа А, выявленными в настоящем исследовании, результаты концентрации данного цитокина в сыворотке крови в норме и у больных гриппом были нами использованы в качестве одного из важных критериев прогноза в разработанной экспертной системе «Экспресс-диагностика и прогноз течения острых респираторных вирусных инфекций» [10].
Литература
1. Деева Э. Г. Грипп. На пороге пандемии: руководство для врачей. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. 208 с.
2. Иванов А. А., Гладких О. П., Кузнецова А. В., Данилова Т. И. Межклеточные и клеточно-ма-триксные взаимодействия в патологии // Молекулярная медицина. 2005. № 2. С. 16-21.
3. Нагоев Б. С., Нагоева М.Х., Камбачокова Э. А. О роли цитокинов в регуляции иммунной системы при инфекционных заболеваниях / Матер. III Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням (Москва, 28-30 марта 2011 г.) // Инфекционные болезни. 2011. Т. 9. Приложение № 1. С. 260.
4. Tilahun A. Y. Interferon gamma-dependent intestinal pathology contributes to the lethality in bacterial superantigen-induced toxic shock syndrome // PLoS One. 2011. Vol. 6, N 2. P. 16764.
5. Bermejo-Martin J. F., Ortiz de Lejarazu R., Pumarola T. et al. Th1 and Th17 hypercytokinemia as early host response signature in severe pandemic influenza. // Crit Care. 2009. Vol. 13(6). P. 201.
6. Hagau N., Slavcovici A., Gonganau D. N. et al. Clinical aspects and cytokine response in severe H1N1 influenza A virus infection // Crit Care. 2010. Vol. 14 (6). P. 203.
7. Рябичева Т. Г., Вараксин Н. А., Тимофеева Н. В., Рукавишников М. Ю. Определение цитокинов методом иммуноферментного анализа // Информационный бюллетень «Новости "Вектор-Бест"». 2004. Т. 4, № 34. С. 3-7.
8. Кобзарь А. И. Прикладная математическая статистика: для инженеров и научных работников. М.: Физматлит, 2006. 816 с.
9. Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2002. 312 с.
10. Усков А. А., Иванов В. В., Шипилов М. В. Интерфейс экспертной системы «Экспресс-диагностика и прогноз течения ОРВИ». Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ в Федеральной службе по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам РФ № 2011615981 от 02.08.2011 г.
Статья поступила в редакцию 20 марта 2012 г.
