CC BY
40
И.А. Громов (специальная премия)
Научный центр здоровья детей РАМН
Цитокиновые рецепторы лимфоцитов крови при бронхиальном астме у детей
ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ОСОБЕННОСТЕЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЦИТОКИНАМ У ДЕТЕЙ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ НАМИ ПРОВЕДЕНО ИССЛЕДОВАНИЕ МЕМБРАННЫХ РЕЦЕПТОРОВ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ К ИНТЕРФЕРОНУ (ИФН) у, ИНТЕРЛЕЙКИНУ (ИЛ) 2, ИЛ 4, ИЛ 5, ИЛ 8 И ИЛ 10. ОБСЛЕДОВАНО 30 ДЕТЕЙ В ВОЗРАСТЕ ОТ 5 ДО 17 ЛЕТ С АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ (ЛЁГКОГО И СРЕДНЕТЯЖЁЛОГО ПЕРСИСТИРУЮЩЕГО ТЕЧЕНИЯ, В ПЕРИОДЕ РЕМИССИИ). ГРУППУ СРАВНЕНИЯ СОСТАВИЛИ 10 ДЕТЕЙ БЕЗ АТОПИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОВЕДЕНЫ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТО-ФЛЮОРОМЕТРИИ В ПРЯМОЙ РЕАКЦИИ С МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ К ПЕРЕЧИСЛЕННЫМ РЕЦЕПТОРАМ. УСТАНОВЛЕНО, ЧТО У ДЕТЕЙ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ ОТМЕЧАЛСЯ ПОВЫШЕННЫЙ УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ К ИЛ 2 (ЗА СЧЕТ ВЫСОКОАФФИННОЙ ЕДИНИЦЫ CD122), ИЛ 5; ОТМЕЧАЕТСЯ ТЕНДЕНЦИЯ К ПОВЫШЕНИЮ УРОВНЯ КЛЕТОК С РЕЦЕПТОРАМИ К ИЛ 4 И ИЛ 8. В ТО ЖЕ ВРЕМЯ У ДАННОЙ ГРУППЫ ДЕТЕЙ ИМЕЕТСЯ СНИЖЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРА К ИФН у И ОТМЕЧАЕТСЯ ТЕНДЕНЦИЯ К ПОНИЖЕНИЮ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРА К ИЛ 10 КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: БРОНХИАЛЬНАЯ АСТМА, ДЕТИ, ИНТЕРФЕРОН у, ИНТЕРЛЕЙКИНЫ.
Контактная информация:
Громов Иван Александрович, врач-педиатр Консультативнодиагностического центра Научного центра здоровья детей РАМН Адрес: 119991, Москва, Ломоносовский проспект, дом 2/62, тел. (495) 967-14-20
Бронхиальная астма (БА) — одно из наиболее распространённых заболеваний в мире. В основе заболевания лежит хроническое аллергическое воспаление бронхов, сопровождающееся их гиперреактивностью и периодически возникающими приступами затруднённого дыхания или удушья в результате бронхиальной обструкции, обусловленной бронхоконстрикцией, гиперсекрецией слизи, отёком стенки бронхов [1, 2]. В настоящее время важнейшая роль в регуляции иммунного ответа отводится растворимым медиаторам, которые называют в зависимости от клеток, их продуцирующих, лимфо- и монокинами (медиаторы лимфоцитарного или моноцитарного происхождения), интерлейкинами (медиаторами, осуществляющими все взаимодействия между различными лейкоцитами) или цитокинами (любые растворимые медиаторы, независимо от их клеточного источника) [3]. Особенности цитокинового статуса больных бронхиальной астмой обсуждаются в литературе достаточно широко, однако публикуемые данные в основном касаются определения концентрации цитокинов в периферической крови, тогда как экспрессия мембранных рецепторов к цитокинам изучена мало [4, 5].
Для выявления особенностей чувствительности к цитокинам у детей с БА нами проведено исследование мембранных рецепторов к интерферону-у (ИФНу), интерлейкинам-2, 4, 5, 8, 10 (ИЛ 2, 4, 5, 8, 10) на мембране лимфоцитов крови. Обследовано 30 детей в возрасте от 5 до 17 лет с атопической БА (лёгкого и среднетяжёлого персистирующего течения, в период ремиссии). В качестве группы сравнения обследованы 10 детей без атопических заболеваний. Исследования проведены методом проточной цитометрии в прямой реакции с моноклональными антителами к перечисленным рецепторам по общепринятой методике иммунного фенотипирования лимфоцитов, выделенных на градиенте плотности фиколл-верографина. Использовано оборудование и реактивы фирмы BD Biosciences, США: лазерный анализатор FASC Calibur, программа Cell Quest [6, 7].
64
I.A. Gromov
Scientific Center of Children' s Health, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
Cytokine receptors of blood lymphocytes in children with bronchial asthma
BLOOD LYMPHOCYTE MEMBRANE RECEPTORS TO IFNy, IL 2, IL 4, IL 5, IL 8 AND IL 10 HAVE BEEN INVESTIGATED TO ASSESS CYTOKINE SENSITIVITY VARIATIONS IN CHILDREN WITH ASTHMA. THIRTY CHILDREN AGED 5-17 WITH REMISSION OF ATOPIC BRONCHIAL ASTHMA RANGING FROM MILD TO MODERATE PERSISTENT FORMED THE STUDY GROUP TEN CHILDREN WITHOUT ANY ATOPIC DISORDERS FORMED THE GROUP OF CONTROLS. THE FLOW CYTOMETRY WITH DIRECT REACTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO THE MENTIONED ABOVE CYTOKINE RECEPTORS HAS BEEN USED. AN INCREASED EXPRESSION OF IL 2 (DUE TO HIGH AFFINITY CD122 SUBUNIT) AND IL 5 RECEPTORS HAS BEEN REGISTERED IN CHILDREN WITH ASTHMA, AND SO A NUMBERS OF CELLS BEARING IL 4 AND IL 8 RECEPTORS THAT HAS TRENDED TO BE HIGHER. AT THE SAME TIME, THERE HAS BEEN A DECREASE OF IFNy RECEPTOR EXPRESSION AN A TREND TO LOWER EXPRESSION OF IL 10 RECEPTOR IN THESE CHILDREN.
KEY WORDS: BRONCHIAL ASTHMA, CHILDREN, INTERFERON-/, INTERLEUKINS.
Для исследования использовали венозную кровь, взятую в пробирку с ЭДТА (Becton Dickinson VACUTAINER Systems); лимфоциты выделяли с помощью центрифугирования на градиенте плотности с фиколл-верографином при 1500 об/мин в течение 30 мин при температуре 4 °С. Выделенные лимфоциты отмывали раствором Cell Wash центрифугированием при 1200 об/мин при температуре 4 °С в течение 10 мин. Затем полученные лимфоциты метили моноклональными антителами (Simultest Imk Plus, Becton Dickinson). Клетки инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин, затем отмывали центрифугированием с 2 мл Cell Wash и ресуспензиро-вали в 0,5 мл Cell Wash. Анализ образцов проводили на проточном цитометре. Для сбора данных использовали программу Simulset. Исследовали лимфоцитарное окно, согласно типичному расположению популяций лимфоцитов, выявленному по светорассеянию и флюоресцентной метке LeukoGate (CD 45/14).
Максимальный уровень экспрессии отмечен для рецептора к ИФНу — он выявлен на 61,8±1,8% клеток лимфоидного региона у больных и на 67±2,6% лимфоцитов детей группы сравнения (рис. 1)
У детей с БА отмечено повышение экспрессии рецептора к ИЛ 2, в основном за счёт высокоаффинной единицы — CD122, количество лимфоцитов с этим рецептором составило 21,6±1,5%, что статистически значимо выше референтного уровня 16,25±1,5%. В то же время низкоаффинная единица рецептора к ИЛ 2 — CD25 у детей с БА была выявлена на 9,08±0,3% лимфоцитов, что статистически значимо не отличается от референтного уровня 9,2±2,1%. Количество лимфоцитов, экспрессирующих рецептор к ИЛ 4, у детей с БА составило 5,3±0,8%, в то время как в группе сравнения этот показатель составил 3,7±0,6%. Экспрессия рецептора к ИЛ 5 составила 9,6±1,3% у больных, а в группе сравнения этот показатель равнялся 5,3±1,1%.
Рис. 1. Экспрессия рецептора к ИФНу у детей с БА
М1
Emply
показатели для рецептора к ИЛ 10 составили 20,8±2% и 27,2±3,9% соответственно; особенностью последнего рецептора является слабая интенсивность флюоресцентной метки, что создаёт ряд трудностей при проведении исследований. Полученные данные суммированы в табл. 1.
Таким образом, на лимфоцитах крови детей с БА повышена экспрессия рецепторов к таким патогенетически важным цитокинам, как ИЛ 2 (за счёт высокоаффинной единицы CD122), ИЛ 5; прослеживается тенденция к повышению количества клеток с рецепторами к ИЛ 4 и ИЛ 8. В то же время у данной группы детей понижена частота экспрессии рецептора к ИФНу и отмечается тенденция к уменьшению экспрессии рецептора к ИЛ 10.
Данные изменения, сохраняющиеся в период ремиссии, являются дополнительным доказательством оправданности проведения длительной патогенетической терапии у детей с БА.
Рецептор к ИЛ 8 экспрессировали 29,9±2,1% лимфоцитов больных, в группе сравнения — 24,3±3,6%, аналогичные
Таблица 1. Экспрессия рецепторов к цитокинам у пациентов с БА и детей без признаков атопии
Частота экспрессия рецепторов, %
ИФНу CD25 CD122 ИЛ4 ИЛ5 ИЛ8 ИЛ10
Дети с бронхиальной астмой 61,8±1,8 9,08±0,3 21,6±1,5 5,3±0,8 9,6±1,3 29,9±2,1 20,8±2
Дети без атопических заболеваний 67±2,6 9,2±2,1 16,25±1,5 3,7±0,6 5,3±1,1 24,3±3,6 27,2±3,9
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Балаболкин И.И., Намазова Л.С., Ковальчук и др. // Иммунология. — 1994. — № 1. — С. 33-36.
2. Огородова Л.М., Кобякова О.С., Фрейдин М.Б. и др. Роль интерлейкина-5 в патогенезе бронхиальной астмы // Аллергология. — 1999. — № 4. — С. 32-36.
3. Студеникин М.Я., Балаболкин И.И., Баканов М.И. и др. // Аллергические болезни у детей. — М.: Медицина, 1998. — С. 70-78.
4. Janossy G., Contreras M., Navarrete C. Intracellular Cytokine Profile of Cord and Adult Blood Lymphocytes // Blood. — 1998. — V. 92, № 1 (July 1). — P 11-18.
5. Shiota Y., Arikita H., Horita N. Intracellular Il-5 and T-lymphocyte subsets in atopic and nonatopic bronchial asthma // J Allergy Clin Immunol. — 2002. — V. 109 (2). — R 294-298.
6. Winterrowd G.E., Chin J.E. Flow cytometric detection of antigen-specific cytokine responses in lung T cells in a murine model of pulmonary inflammation //J Immunol Methods. — 1999. — 226 (1-2). — R 105-118.
7. Bonifase S., Koscher V., Mamessier E.. Assesment of T lymphocyte cytokine production in induced sputum from astmatics: a flow cytometry study // Clin Exp Allergy. — 2003. — V. 33. — R 1238-1243.
ПЕДИАТРИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ/ №2/ 2006
