CC BY
71
2006
Известия ТИНРО
Том 146
УДК 664.959
Н.Б. Аюшин, Н.Н. Ковалев
ЦИТОХРОМ С ИЗ СЕРДЕЦ ЛОСОСЕЙ: СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И СВОЙСТВА
Разработаны методы выделения цитохрома С из сердец лососевых рыб. Один из них основан на кислотной экстракции фарша сердец с последующим высаливанием, другой — на ступенчатой ультрафильтрации водного экстракта. Для обоих методов доказана аутентичность полученного препарата, который в дальнейшем предполагается использовать для приготовления биологически активных пищевых добавок.
Ayushin N.B., Kovalev N.N. Cytochrome C from salmon hearts: methods of extraction and properties // Izv. TINRO. — 2006. — Vol. 146. — P. 288-293.
Methods of cytochrome C preparation from heart tissue of salmons are elaborated. One of them is based on acid extraction of homogenate and further salt sedimentation. The other method is based on the graduated ultrafiltration of water extract of the tissue. Authenticity of preparations extracted by both methods is demonstrated. The cytochrome C is used for producing of biologically active supplements to food (BASF).
Цитохромы — группа сложных белков, относящихся к классу пигментов-гемопротеидов. Цитохром С — железосодержащий митохондриальный белок, участвующий в качестве переносчика электронов в процессах биологического окисления, он содержит одну полипептидную цепь и одну гемогруппу, которая ковалентно связана с полипептидом. Молекула цитохрома С свернута в компактную глобулу, причем большинство его гидрофильных групп расположено снаружи, а большинство гидрофобных групп — внутри глобулярной структуры. Рент-геноструктурный анализ показал, что в цитохроме С на долю спиральных сегментов приходится около 40 % аминокислотных остатков. В остальной части аминопептидной цепи цитохрома находятся всевозможные изгибы, повороты, нерегулярные витки и сегменты в вытянутой конформации. Цитохром С функционирует путем переменного окисления и восстановления атома железа, т.е. железо находится то в ферро-, то в ферриформах (Уайт и др., 1981). Молекулярная масса этого белка у большинства видов составляет около 12300 Да. Он исключительно важен для осуществления функции клеточного дыхания, и его препараты, полученные из сердец крупного рогатого скота, применяются в клинической практике. Цитохром С улучшает метаболизм миокарда, особенно в периинфарктной зоне, уменьшает размеры некроза, сокращает сроки рубцевания сердечной мышцы. Выявленный положительный инотропный эффект цитохрома С способствует более быстрому и полному восстановлению сократительной и ритмической функции сердца. Высокоэффективным оказалось применение препарата в кардиологической практике: в комплексе интенсивной терапии острого инфаркта миокарда, после операций протезирования искусственных клапанов сердца. В клинической практике цитохром С применяется для улучшения тканевого дыхания при
асфиксии новорожденных, астматических состояниях, хронической пневмонии, сердечной недостаточности, ишемической болезни сердца, инфекционном гепатите, старческой дегенерации сетчатки глаза, интоксикациях (Костюченко, 1998), прогрессирующих мышечных дистрофиях (Мальмберг и др., 2004).
Известно, что цитохром С из сердец крупного рогатого скота выпускается как лекарственное средство (Машковский, 1997). Его получают с помощью многостадийного и трудоемкого процесса, что сказывается на стоимости готовой формы, однако клиническая потребность в этом веществе обеспечена менее чем на 20 %, а наращивать объемы производства в современных условиях не представляется возможным. Кроме того, в последние годы использование органов сельскохозяйственных животных в качестве сырья для получения фармпрепаратов резко сократилось из-за опасности распространения тяжелых заболеваний прионовой природы. Эти обстоятельства стали побудительным мотивом для поиска альтернативных видов сырья для производства лекарств и действующих начал для биологически активных пищевых добавок, к числу которых относится цитохром С.
Большое количество разнообразных биологических ресурсов добывается средствами морского промысла. Одной из проблем, неразрывно связанной с промышленным рыболовством, является проблема рациональной утилизации отходов, большую часть которых составляют внутренние органы добываемых рыб, в том числе и сердца, которые могли бы быть использованы как сырье для производства цитохрома С. Для исследований в этом направлении были выбраны сердца рыб семейства лососевых, в частности кеты, которая занимает в общем объеме вылова тихоокеанских лососей второе место после горбуши.
Сердца кеты ОпсоЛуп^и keta '^а1Ьаат были заготовлены в разные годы на рыбокомбинатах Камчатки. По качественным показателям сырье соответствует требованиям ТУ 9267-258-00472012-04, необходимым для заготовки и хранения.
Цитохром выделяли двумя методами.
Метод с использованием кислотной экстракции
Классическая методика выделения цитохрома С из сердец сельскохозяйственных животных включает экстракцию слабым раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ), ступенчатое высаливание балластных белков сульфатом аммония, осаждение препарата 20 %-ным раствором ТХУ, отделение осадка, растворение его в воде, замораживание, размораживание, фильтрацию и диализ фильтрата против физиологического раствора. Затем материал либо лиофилизируют, либо готовят ампулированную жидкую форму для инъекций. Эта методика послужила основой для выделения цитохрома С из сердец кеты.
В процессе выделения цитохрома С из сердец лососевых были выявлены некоторые особенности. Для проведения экстракции сердца были измельчены, заморожены при минус 25 °С, а затем хранились в морозильной камере в течение 3 мес при минус 18 °С. Фарш был разморожен и повторно измельчен. При размораживании фарша отмечено, что мышечная ткань сердец лососевых имеет более мягкую консистенцию по сравнению с миокардом убойного скота и морских ластоногих и отличается более высоким содержанием в ней липидов. При обработке фарша раствором ТХУ оказалось, что экстракция цитохрома С из реакционной массы происходит при более высоких значениях рН (4,8-5,5), чем по классической технологии.
При отжиме после экстракции избыток липидов значительно затруднил фильтрацию экстракционных продуктов. В связи с этим для осаждения липид-ной фракции и ускорения процесса фильтрации в реакционную массу добавляли природный адсорбент.
В соответствии с промышленной технологией получения цитохрома С после нейтрализации экстракта дальнейшее выделение препарата проводили дробным высаливанием. Для высаливания, как в промышленных условиях, использовали сернокислый аммоний. При отработке методики осаждения цитохрома С из экстракта выяснилось, что использование реагента в концентрациях, рекомендуемых технологическим регламентом, для данного вида сырья оказалось не оптимальным, что потребовало проведения дополнительных изысканий. Выяснилось, в частности, что экстракцию цитохрома лососей лучше проводить при низкой температуре, в отличие от цитохрома крупного рогатого скота (КРС), как показано в табл. 1.
Таблица 1
Содержание цитохрома С в зависимости от температурного режима экстракции, мг/кг
Table 1
Cytochrome C, in related from temperature of extraction, mg/kg
Объект 20 0С 15 0С 10 0С 5 0С
КРС 151,4 120,5 100,6 -
Лососевые (кета) 180,1 202,5 289,8 345,8
Время экстракции, как оказалось, также имеет большое значение, поскольку при длительных экспозициях выход цитохрома снижается (табл. 2).
Таблица 2
Выход цитохрома С в зависимости от времени экстракции при разных температурах, мг/кг исходного сырья
Table 2
Yield of Cytochrome C in related from extraction time at different temperatures, mg/kg of initial material
Объ- 0,5 ч 1 ч 2 ч 3 ч 4 ч 12 ч
ект 20 0С 5 0С 20 0С 5 0С 20 0С 5 0С 20 0С 5 0С 20 0С 5 0С 20 0С 5 0С
КРС - - - - 151,4 - 140,3 - 144,3 292,8 111,0 110,2
Кета 113,1 331,2 160,2 320,6 180,1 345,8 173,5 330,1 153,8 250,3 101,7 110,8
Последующие стадии процесса получения препарата из нового вида сырья проводились в соответствии с промышленным регламентом.
Таким образом, модифицированный способ получения цитохрома С из сердец лососевых пород рыб включает измельчение сырья, экстракцию кислотой, обработку экстракта сульфатом аммония, осаждение препарата кислотой, обработку полученного осадка сульфатом аммония, получение водного раствора цитохрома С, его замораживание — размораживание с последующим фильтрованием, диализ с последующими стерильной фильтрацией и лиофилизацией суперна-танта и отличается тем, что в качестве сырья используют сердце лососевых, экстракцию проводят при рН 4,8-5,5 (в отличие от рН 2,5-3,5 в случае использования сердец крупного рогатого скота), а при осаждении балластных белков после экстракции вводят стадию обработки природным адсорбентом для удаления липидов из расчета 20-30 г на 100 г исходного сырья.
Эксперименты показали принципиальную возможность использования миокарда лососевых пород рыб для выделения цитохрома С в качестве источника получения фермента.
После обработки дитионитом для перевода цитохрома С в восстановленную форму был снят спектр поглощения и зарегистрированы максимумы поглощения при 430, 520 и 555 нм, что примерно соответствует спектрам поглощения цитох-рома С из сердечной мышцы крупного рогатого скота (Скулачев, 1969) и лошади (Новые методы ..., 1988), т.е. соответствует требованиям ФС 42-2533-88. Его содержание на разных стадиях процесса определяли спектрофотометрически, по
методу, основанному на разнице поглощения окисленной и восстановленной форм (ФС 42-2533-88).
Выход цитохрома С из нового сырья в опытах составил 70-100 мг/кг сердца — это достаточно высокий показатель, поскольку количественное содержание фермента в исходном сырье — миокарде лососевых пород рыб — равно 200 мг/кг (в сердцах КРС — 190 мг/кг, а выход препарата по технологии — от 40 до 120 мг/кг). Таким образом, новый вид сырья не уступает общепринятому для получения препарата в промышленных масштабах.
Метод с использованием ультрафильтрации
Ультрафильтрационные методы разделения и концентрирования различных веществ биологического происхождения начали широко применяться в полупромышленных и промышленных масштабах с середины 80-х гг., когда были созданы кассетные, волоконные и трубчатые аппараты. Поскольку процедура проводится в исключительно щадящих условиях, этот метод весьма удобен для получения нативных ферментов. Еще с помощью фильтрования с давлением через плоские мембраны была получена в препаративных количествах плацентарная В-1,4-о-ксиленаза (Green et al., 1986). Тогда же удалось разделить и получить в препаративных количествах фракции ингибитора трипсина из сои (Baker, 1986). С помощью мембран с пропускной способностью до 300 кДа на твердой подложке получили альбумин и иммуноглобулины человека (Wan, 2004).
Для проведения ультрафильтрации использовалась аппаратура фирмы Millipore (Франция) с плоскими мембранными модулями Pellicon, рассчитанными на пропускание макромолекул с массой в 1, 10 и 100 кДа.
Замороженные сердца кеты подвергали частичному оттаиванию и измельчали. Полученный фарш заливали пятикратным объемом дистиллированной воды и оставляли при перемешивании на 17 ч при 12 0С, после чего центрифугировали с охлаждением. Полученный супернатант подвергали ступенчатой ультрафильтрации: сначала пропускали его через мембранный модуль, задерживающий макромолекулы с массой свыше 100 кДа, затем к полученному концентрату добавляли равный объем дистиллированной воды (два раза) для более полного удаления низкомолекулярной фракции и продолжали процесс до достижения объема концентрата в 1/10 часть первоначального объема; фильтрат подвергали аналогичной процедуре с использованием мембранных модулей, задерживающих молекулы с массой более 10 кДа и 1 кДа. Концентрат с фракцией более 100 кДа был подвергнут дополнительному центрифугированию, поскольку в процессе концентрирования образовался осадок, хорошо различимый визуально. Остальные фракции получились совершенно прозрачными, при этом фракция, содержащая вещества массой от 10 до 100 кДа, имела интенсивную красную окраску, фракции от 1 до 10 кДа и менее 1 кДа были слабо окрашены в желтый цвет. Полученные фракции были направлены на сублимационную сушку. Данные о выходе сухих веществ представлены в табл. 3.
Наибольшую долю, как и ожидалось, составляют вещества с молекулярной массой более 100 кДа — кроме истинных биомолекул, присутствующих в растворе, здесь имеется мелкая механическая взвесь, от которой не удалось избавиться из-за ограничений, наложенных на скорость вращения роторов применявшихся при эксперименте центрифуг. Количество веществ с молекулярной массой менее 10 кДа оказалось весьма незначительным.
Спектры поглощения, снятые для всех фракций в диапазоне длин волн от 360 до 760 нм, показали наличие для фракции 10-100 кДа четырех максимумов — на 420, 500, 580 и 630 нм (см. рисунок). Как упоминалось выше, для цитохрома С из сердечной мышцы КРС и лошади характерны максимумы поглощения при 415, 520 и 550 нм (Скулачев, 1969; Новые методы ..., 1988). Максимумы при тех же значениях длины волны были отмечены ранее для цитохрома С
Таблица 3 Выход сухих веществ, полученных в результате ступенчатой ультрафильтрации водного экстракта сердец кеты, % от первоначального фарша
Table 3
Yield of dry substances after the step ultrafiltration of water extract by salmon (O. keta) hearts, % from initial material
из сердец кеты, полученного кислотной экстракцией. Некоторый сдвиг максимумов поглощения объясняется тем, что обработки дитионитом не производилось и материал содержит смесь окисленной и восстановленной форм цитохрома; кроме того, препарат приготовлялся в исключительно щадящих условиях без обработки любыми химическими реагентами и, несомненно, содержит истинный нативный цитохром. Максимум при 630 нм цитохрому не принадлежит. Массовая доля цитохрома С в этой фракции, вычисленная по значению оптической плотности при 580 нм, оказалась равна 26-27 % сухой массы препарата. Это соответствует его содержанию в сырье (450-470 мг на 1 кг сырого фарша), что заметно превышает показатель, полученный при использовании метода с экстракцией ТХУ. Спектр поглощения концентрата (более 100 кДа) снять не удалось из-за сильной опалесценции раствора; две низкомолекулярные фракции максимумов поглощения при длине волны более 400 нм не имеют.
Фракция Масса
Концентрат (свыше 100 кДа) 2,90
От 10 до 100 кДа 1,70
От 1 до 10 кДа 0,14
Менее 1 кДа 0,30
С--1 ■*• СП
Ш crj Ф О) О'ч
Длина волны, нм
Спектр поглощения фракции от 10 до 100 кДа, полученной при ступенчатой ультрафильтрации экстракта сердец кеты
Spectrum of ultrafiltration fraction from 10 to 100 kDa, obtained from water extract of salmon (O. keta) hearts
Классический способ получения цитохрома С включает в качестве обязательных процедур экстракцию растворами кислот, от которых впоследствии необходимо избавляться с помощью диализа. При этом время экстракции не превышает 2 ч, но дальнейший диализ требует как минимум 70 ч с заменой дистил-
лированной воды или физраствора, против которых он производится, через каждые 5 ч. Процедура с использованием ультрафильтрации занимает для получения фракции, содержащей весь имеющийся в экстракте цитохром С, не более суток; при этом сырье и конечный продукт не контактируют ни с каким другим веществом, кроме дистиллированной воды.
Таким образом, показана возможность применения сердец лососевых рыб в качестве источника цитохрома С, разработаны два метода получения его препаратов и доказано наличие в этих препаратах нативного цитохрома С с высокой степенью выхода.
Литература
Костюченко А.Л. Применение современных антигипоксантов в практике неотложной кардиологии // Agua Vitae. — 1998. — № 1. — С. 42-43.
Мальмберг С.А., Шаркова И.В., Дадали Е.Л. Использование препаратов ци-тохрома-с при прогрессирующих мышечных дистрофиях у детей // Мед. науч. и учеб.-метод. журн. — 2004. — № 18. — С. 58-60.
Машковский М.Д. Лекарственные средства. Изд. 13-е. — Харьков: Торсинг, 1997. — Т. 2. — 590 с.
Новые методы практической биохимии. — М.: Наука, 1988. — 262 с.
Скулачев В.П. Аккумуляция энергии в клетке. — М.: Наука, 1969. — 439 с.
ТУ 9267-258-00472012-04. Сердца лососевые мороженные — полуфабрикат.
Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии. В трех томах. — М.: Мир, 1981. — Т. 1. — 535 с.
ФС 42-2533-88. Цитохром С для инъекций.
Baker E.C. Separation of Soy Trypsin-Inhibitors Using Ultrafiltration // Journal of the American Oil Chemists Society. — 1986. — Vol. 63, № 4. — P. 402-408.
Green F., Clause C.A., Highley T.L., Micale J.A. Purification of an Extracellular B-1,4-Xylanase of Poria-Placenta by Gel-Filtration and Ultrafiltration // Phytopathology. — 1986. — Vol. 76, № 10. — P. 1113.
Wan Y.H., Ghosh R., Cui Z.F. Separation of human serum albumin and human immunoglobulins using carrier phase ultrafiltration // Biotechnology Progress. — 2004. — Vol. 20, № 4. — P. 1103-1112.
Поступила в редакцию 23.03.06 г.
