CC BY
396
дигиена и санитария 6/2012
Генетические исследования в гигиене
О Л.П. СЫЧЕВА, 2012 УДК 614.7:575:576.3
Л.П. Сычева
цитогенетический мониторинг для оценки безопасности среды обитания человека
ФГБУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина Минздрава России, Москва
Цитогенетический мониторинг позволяет выявить группы риска по цитогенетическим нарушениям, а также индивидов с повышенным уровнем нестабильности генома, определить наличие генотоксических факторов в обследуемом регионе для обоснования проведения гигиенических мероприятий. Представлен алгоритм цитогенетического мониторинга с использованием полиорганного кариологического теста, приведены ориентировочные нормативные уровни показателей цитогенетического действия, пролиферации и апоптоза, предложен индекс накопления цитогенетических нарушений, который положен в основу выделения трех групп риска по цитогенетическим нарушениям.
Ключевые слова : цитогенетический мониторинг, полиорганный кариологический тест, микроядра, пролиферация, апоптоз
L. P. Sycheva - CYTOGENETIC MONITORING FOR ASSESSMENT OF SAFETY OF ENVIRONMENTAL HEALTH
Federal State Budgetary Institution A. N. Sysin Research Institute of Human Ecology and Environmental Health of the Ministry of Healthcare and Social Development, Moscow, Russian Federation
Cytogenetic monitoring allows to identify groups and individuals with elevated levels of genomic instability, to determine the presence of genotoxic factors in the inspected area to justify the conduct of hygienic measures. An algorithm for cytogenetic monitoring with the ту of multi-organ karyological test, baseline of indices of cytogenetic effect, cell proliferation and apoptosis are presented, the index of accumulation of cytogenetic damage as a the basis for assessment of the three level of risk of cytogenetic abnormalities, is proposed
Key words: cytogenetic monitoring, multi-organ karyological test, micronuclei, proliferation, apoptosis
Генетический мониторинг представляет собой контроль наследственной изменчивости популяций с целью защиты наследственности человека (и других организмов) от экологических последствий загрязнения окружающей среды. Актуальность и необходимость проведения цитогенетического мониторинга как составной части генетического мониторинга при оценке состояния генома на клеточном уровне обусловлены рядом аспектов. Накапливается все больше фактов о ведущей роли генома в развитии и функционировании отдельных клеток, тканей, органов, а также организма в целом, об этиологической роли нарушений в строении генома и экспрессии генов в развитии и течении онкологических и других заболеваний [11].
Вместе с тем развитие науки и промышленности приводит к все большему загрязнению окружающей среды факторами физической, химической и биологической природы. Приблизительно 10% из них оказывают мутагенное действие, но только у небольшого числа факторов изучена мутагенная активность в опытах на млекопитающих для ограничения их использования. Общепринятый подход к оценке риска и прогнозированию развития патологии на основании содержания отдельных факторов не позволяет определить реальную нагрузку на организм низкоинтенсивного действия всего комплекса факторов с учетом их трансформации и взаимодействия. В связи с этим становится понятной необходимость проведения цитогенетического мониторинга - определения частоты
Сычева Л.П. - д-р биол. наук, проф., зав. лаб. генетического мониторинга (lpsycheva@mail.ru).
клеток с ярко выраженными, «грубыми» повреждениями генома (хромосомными аберрациями, микроядрами, ядерными протрузиями), образующихся в ответ на весь спектр действующих факторов у отдельных индивидов и обследуемых групп населения.
Следует отметить, что благодаря цитогенетическому мониторингу можно получить информацию как о состоянии здоровья населения обследуемой популяции (донозологическая диагностика), так и о наличии генотоксических факторов в среде обитания (регионе, городе, районе), т. е. цитогенетический статус человека может служить биомаркером уровня загрязнения среды генотоксикантами (в диагностике загрязнения среды мутагенами). В связи с этим цитогенетический мониторинг может быть рекомендован для включения в социальногигиенический мониторинг для оценки безопасности среды обитания человека.
Методологическая база его проведения хорошо разработана и включает использование общепринятого, широко апробированного количественного учета хромосомных аберраций [1, 2, 6]. В качестве инновационного подхода международное научное сообщество стало применять микроядерный тест на лимфоцитах человека. В 1997 г. был создан International Human Micronucleus (HUMN) Project, для его разработки и применения с 2007 г. действует проект HUMNxL по применению микроядерного теста на эксфолиативных клетках [13]. Эти проекты позволили решить многие вопросы цитогенетического мониторинга, в частности стандартизации протоколов, подготовки препаратов к исследованию, критериев выявления микроядер, влияния сопутствующих факторов. Опубликованы обзоры данных, указывающие на повышение частоты микроядер
68
Рис. 1. Алгоритм проведения цитогенетического мониторинга с применением ПКТ.
у человека при генотоксическом действии различных факторов окружающей среды, а также при ожирении, диабете, сердечно-сосудистых, онкологических, гематологических, нейродегенеративных и других заболеваниях [4, 10, 11, 14, 15]. Становится очевидным, что этот подход является перспективным, в том числе как инструмент фундаментальных исследований физиологических и патологических процессов в организме, связанных с повреждением генома. На повестке дня стоит вопрос о внедрении микроядерного теста как метода рутинной диагностики в рамках новой парадигмы профилактики заболеваний, основанной на персонифицированном предотвращении повреждений ДНК [12, 13, 16, 17].
В институте в рамках этого направления разработан и апробирован неинвазивный полиорганный кариоло-гический тест (ПКТ), позволяющий оценивать наряду с микроядрами широкий спектр состояний ядра эксфоли-ативных клеток по цитогенетическим показателям, показателям пролиферации и апоптоза в эксфолиативных клетках [3-5, 7].
Основное преимущество ПКТ по сравнению с учетом хромосомных аберраций - неинвазивное взятие материала для анализа и отсутствие необходимости культивировать клетки крови. Следует отметить простое
приготовление препаратов и сравнительно невысокую стоимость исследования. Кроме того, ПКТ разработан для анализа любых эксфолиативных (слущиваю-щихся) клеток: буккальных, назальных, уротелиальных, бронхиальных, других, и позволяет оценивать все виды цитогенетических нарушений состояния ядра интерфазной клетки, а также показатели клеточной кинетики: - пролиферации и апоптоза. Изменение соотношения этих процессов ведет либо к деструкции ткани, либо к развитию новообразований. ПКТ позволяет учитывать наряду с кла-стогенным эффектом (фрагменты и обмены хромосом) анеугенный эффект, который вносит существенный вклад в формирование наследственных и других болезней [9].
При планировании цитогенетического мониторинга возникают дополнительные организационные вопросы: кто, где, каким образом и как часто должен проводить такого рода исследования, что является результатом исследования и как его использовать для обеспечения генетической безопасности в каждом конкретном регионе.
В настоящее время базовой лабораторией по разработке и апробации ПКТ в России является лаборатория генетического мониторинга ФГБУ НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина Минздравсоцразвития России. Совместно с гигиеническими лабораториями института мы провели оценку цитогенетического статуса разных групп населения в связи с загрязнением окружающей среды: служащих крупного офисного центра Москвы; детей из Тулы, проживающих в условиях разных уровней загрязнения атмосферного воздуха; детей, проживающих вблизи предприятия по производству кофе; населения вблизи целлюлозно-бумажного комбината; населения Вьетнама, проживающего на территориях, загрязненных диоксинсодержащими гербицидами (совместно с РоссийскоВьетнамским тропическим научно-исследовательским и технологическим центром). Даны заключения по наличию или отсутствию влияния комплекса факторов непосредственно на население, характеру этого влияния, расчету относительного риска цитогенетических нарушений, выделению групп риска среди обследованных, что позволило обосновать необходимость профилактических мероприятий на данных территориях. Институт курирует цитогенетические исследования в ряде учреждений Москвы, Нальчика, Грозного, Магнитогорска, Кемерово [8].
В проведении цитогенетического мониторинга заинтересованы сотрудники и студенты кафедр генетики, цитологии, экологии университетов, а также НИИ, занимающихся проблемами экологии. Для объединения всех заинтересованных специалистов необходимы разработка Программы генетического мониторинга и соответствующее финансирование, как это сделано в Украине, отдельных регионах РФ, Казахстана и ряда зарубежных стран. Проводить цитогенетический мониторинг можно приблизительно 1 раз в 5 лет, однако этот подход также пригоден для оценки эффективности профилактических мероприятий в каждом
69
[гиена и санитария 6/2012
Таблица 1
Средние значения (X ± т) и пределы варьирования (в скобках) фоновых кариологических показателей эксфолиативных клеток человека (условно контрольная группа, служащие, Москва)
Показатель Буккальные клетки Назальные клетки Уротелиальные клет-
(п = 205) (п = 205) ки (п = 19)
Цитогенетические показатели, %%
Частота клеток с микроядрами 0,24 ± 0,03 (0-2) 0,35 ± 0,03 (0-3) 0,31 ± 0,11 (0-1)
Частота клеток с протрузиями 0,29 ± 0,03 (0-2) 1,51 ± 0,08 (0-11) 0,53 ± 0,19 (0-3)
Интегральный показатель цитогенетического действия (сумма клеток с микроядрами и протрузиями) 0,53 ± 0,05 (0-4) 1,85 ± 0,08 (0-12) 0,84 ± 0,18 (0-3)
Частота клеток с ядром атипичной формы 0,88 ± 0,26 (0-5) 1,16 ± 1,26 (0-5) 7,89 ± 1,29 (0-23)
Показатели пролиферации, %%
Частота клеток с двумя ядрами 1,06 ± 0,07 (0-8) 2,29 ± 0,11 (0-10) 1,21 ± 0,44 (0-8)
Частота клеток со сдвоенными ядрами 1,70 ± 0,09 (0-10) 2,84 ± 0,12 (0-12) 1,94 ± 0,53 (0-8)
Интегральный показатель пролиферации (сумма клеток с двумя ядрами и сдвоенными ядрами) 2,76 ± 0,09 (0-12) 5,13 ± 0,12 (0-21) 3,16 ± 0,52 (0-11)
Показатели ранней стадии деструкции ядра (апоптоза/некроза), %%
Частота клеток с перинуклеарной вакуолью 97,12 ± 3,46 (5-240) н. о. н. о.
Частота клеток с конденсацией хроматина 16,19 ± 0,72 (2-67) 58,41 ± 1,63 (3-142) н. о.
Частота клеток с вакуолизацией ядра и началом кариолизиса н. о. н. о. н. о.
Показатели завершения деструкции ядра (апоптоза), %%
Частота клеток с кариопикнозом 25,84 ± 0,85 (5-101) н. о. 121 ± 18,5 (11-321)
Частота клеток с кариорексисом 7,13 ± 0,58 (0-103) 2,27 ± 0,15 (0-15) Единичные клетки
Частота клеток с полным кариолизисом 42,63 ± 2,20 (0-198) н. о. 58,0 ± 9,21 (13-142)
Апоптотический индекс (сумма клеток с кариопикнозом, кариорекси- 75,6 ± 3,62 н. о. н. о.
сом, полным кариолизисом) Примечание. н. о. - не определяли.
конкретном случае, если оценить цитогенетический статус обследуемых групп населения до и после соответствующих социально-гигиенических мероприятий.
Программа работы, принципы и этапы генетического мониторинга опубликованы нами ранее [6]. Опыт, накопленный при проведении подобных исследований, позволяет предложить скорректированный алгоритм цитогенетического мониторинга с использованием ПКТ (рис. 1). Кроме того, к настоящему времени разработана классификация показателей, предложены интегральные показатели цитогенетических нарушений, пролиферации и апоптоза, определены ориентировочные нормативные уровни исследуемых показателей [7], представленные в табл. 1. В соответствии с международными данными средняя частота буккальных клеток с микроядрами в контроле составляет 1,1%о (95% CI 0,7-1,72) [13].
Следует отметить, что частота показателей цитогенетического действия и пролиферации у разных исследователей хорошо сопоставима, тогда как частоты показателей поздней и особенно ранней стадии деструкции ядра (апоптоза) значительно варьируют. Критерии показателей ранней стадии деструкции ядра (вакуолизации ядра, конденсации хроматина или начала кариолизиса) достаточно размыты. Поэтому предлагаем выделять в ранней стадии деструкции ядра только конденсацию хроматина (сморщенное ядро с уплотненным хроматином; рис. 2; з) и начало кариолизиса, включая вакуолизацию ядра (ядро с многочисленными вакуолями, более светлое; рис. 2, и). В качестве апоптотического индекса можно учитывать сумму показателей поздней стадии деструкции ядра (кариопикноз, кариорексис и полный кариолизис) или общую сумму клеток в апоптозе, включая конденсацию хроматина и начало кариолизиса. Показатели «перину-клеарная вакуоль» (рис. 2, е) и «повреждение ядерной мембраны» (рис. 2, м) также учитываем как показатели деструкции ядра, но не включаем в апоптотический
индекс. По нашим данным, у большинства обследуемых отмечаются единичные клетки с повреждением ядерной мембраны, однако у некоторых индивидов частота таких клеток составляет 20% и более. По-видимому, этот показатель характеризует местное токсическое действие какого-то фактора. Согласование критериев по определению и оценке значимости показателей апоптоза и/ или некроза эксфолиативных клеток по-прежнему актуально. На данном этапе, учитывая несогласованность критериев оценки показателей апоптоза, проводить их сравнение корректно только в одном и том же исследовании.
В данной работе мы впервые предлагаем использовать для оценки цитогенетического статуса индивида (не только человека, но и других организмов) индекс накопления цитогенетических нарушений - Index of accumulation of cytogenetic damage (Iac), учитывающий показатели клеточной кинетики. Анализ полученных к настоящему времени данных показывает, что увеличение апоптоза приводит к снижению частоты клеток с цитогенетическими нарушениями, тогда как усиление пролиферации, как предполагают, препятствует нормальным процессам репарации и способствует воспроизведению клеток с цитогенетическими нарушениями. В связи с этим предлагаем определять I как произведение интегрального показателя цитогенетических нарушений (суммы клеток с микроядрами, ядерными протрузиями и межъядерными мостами в промилле Ic - cytogenetic index) и интегрального показателя пролиферации (суммы клеток с двумя и более ядрами в промилле I - index of proliferation), деленное на апопти-ческий индекс (сумму всех клеток в апоптозе в промилле I - apoptotic index): apopi = (I- I/ I ) ■ 100.
Йс v c p apop'
том случае, когда у индивида не выявлены цитогенетические нарушения или двуядерные клетки, нулевое значение следует изменить на единицу. Определение
70
• а / % j б в
"I 1 1 \ " 9 % и 1 / ф *• е
——^ Ф Ж 1 1 • ч ■ ■ 3 / # z L
0 К ’ ‘ фи** * 1 "! М •
Кариологические показатели.
а - буккальный эпителиоцит в норме; б - клетка с ядром и микроядром (указано стрелкой); в - клетка с ядерной протрузией (указано стрелкой); г - клетка с двумя изолированными ядрами; д - клетка со сдвоенными ядрами; е - клетка с перинуклеарной вакуолью; ж - клетка с конденсацией хроматина; з - клетка с началом кариолизиса и вакуолизацией ядра; и - клетка с кариорексисом; к - клетка с кариопикнозом; л - клетка с полным кариолизисом; м - клетка с повреждением кариолеммы. Окраска ацетоорсеином, светлым зеленым.
индекса накопления цитогенетических повреждении позволяет выделить 3 группы риска: низкий (I < 2), умеренный (2 < I < 4) и высокий (I > 4) риск. Разделение на группы проведено эмпирическим путем и, возможно,
требует коррекции. В качестве примера в табл. 2 представлены результаты обследования двух групп лиц по интегральным показателям цитогенетического действия, пролиферации и апоптоза с расчетом I При сравнении
71
[гиена и санитария 6/2012
Таблица 2
Показатели цитогенетического действия, пролиферации, апоптоза и индекс накопления цитогенетических повреждений в двух группах обследуемых
Интегральный Интегральный Апопто- Индекс накопле-
следуе- мого показатель цитогенетического действия Ic показатель пролиферации Ip тический индекс Iap0p ния цитогенетических повреждений ^
1-я группа (группа воздействия)
1 3 4 196 6,12
2 1,4 6,7 220 4,26
3 1 1 135 0,74
4 1,54 1,54 162 1,45
5 4 6 134 17,9
6 1 6 140 4,28
X ср 2-я группа (группа контроля) 5,79
1 0 7 120 5,83
2 0 7 151 4,63
3 0 6 251 2,39
4 0 1 106 0,94
5 0 3 196 1,53
6 0 2 213 0,94
7 0 2 134 1,49
8 0 2 226 0,88
9 0 1 352 0,28
10 0 1 294 0,33
11 0 2 167 1,19
12 1 3 143 2,09
13 0 1 92 1,08
14 1 6 130 4,6
15 0 4 140 2,86
16 0 5 248 2,01
17 0 0 146 0,68
X ср 1,74
определено, что 1-я группа является группой высокого риска цитогенетических нарушений, 2-я - группой низкого риска, причем эти группы различаются в 3,3 раза. Индивидуальная оценка показывает, что в 1-й группе 4 человека из 6 подвержены высокому риску цитогенетических нарушений, во 2-й группе - только 2 из 17 обследованных, а также 5 - умеренному и 10 - низкому. Предлагаемый показатель позволяет свернуть информацию для формализации данных, определить группы высокого риска, выделить лиц группы высокого риска для проведения оздоровительных мероприятий.
Какие практические результаты дает цитогенетический мониторинг на территории всей страны? Прежде всего следует отметить возможность выявления зон риска - регионов с наиболее высокими уровнями цитогенетических нарушений. Как правило, они могут быть связаны с воздействием на население повышенного уровня радиации, техногенных химических факторов или их комплекса. Оценка популяционных уровней повреждения генома может быть полезна как для характеристики хронического воздействия комплекса факторов, сложившихся в данном регионе, так и для определения влияния на здоровье комплекса действующих факторов при аварийных ситуациях. Оценка цитогенетического статуса наиболее чувствительных групп населения
приблизительно через 3-4 недели после какого-либо аварийного воздействия (с учетом времени, необходимого для выхода базальных эпителиальных клеток на поверхность слизистой оболочки) и далее в динамике может дать информацию о включении и напряжении компенсаторно-приспособительных реакций, доле лиц со срывом адаптации (повышенным уровнем нестабильности генома), что может служить базисом для разработки гигиенических мероприятий.
Сейчас для этих целей широко используется методология оценки риска, позволяющая определять дополнительные случаи заболеваний и рассчитывать ущербы в зависимости от загрязнения окружающей среды теми или иными факторами, давать рекомендации для проведения наиболее эффективных гигиенических мероприятий. По-видимому, цитогенетический мониторинг как метод оценки индивидуального и среднегруппового уровня цитогенетических нарушений может быть хорошим индикатором эффективности рекомендуемых мероприятий.
Л и т е р а т у р а
1. Бочков Н.П., Катосова Л.Д. // Вестн. РАМН.- 1992.- № 4.-С. 10-14.
2. Дружинин В.Г. Хромосомные нарушения у населения крупного промышленного региона: пространственно-временной цитогенетический мониторинг: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - М., 2003.
3. Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека: Метод. рекомендации. Утверждены Председателем НС РАМН и МЗ и СР России по экологии человека и гигиене окружающей среды.
- М., 2005.
4. Полиорганный микроядерный тест в эколого-гигиенических исследованиях / Под ред. Ю.А.Рахманина, Л.П.Сычевой. -М.: Гениус, 2007.
5. Способ неинвазивной диагностики цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды на организм человека. Изобретение № 2292027, зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 20 января 2007 г. по заявке № 2005108225.
6. Сычева Л.П., Рахманин Ю.А., Ревазова Ю.А., Журков В.С. // Гиг. и сан. - 2005. - № 6. - С.59-62.
7. Сычева Л.П. // Мед. генетика. - 2007. - № 11.- С. 3-11.
8. Сычева Л.П., ЖурковВ.С., Ингель Ф.И. // Итоги и перспективы научных исследований по проблеме экологии человека и гигиене окружающей среды / Под ред. Ю.А.Рахманина. - М., 2011. - С. 149-172.
9. AardemaM.J., Albertini S., Ami P. et al. // Mutat. Res. - 1998. -Vol. 410, N 1. - P 3-79.
10. Andreassi M.G., Barale R., Iozzo P., Picanj E. // Mutagenesis. -2011. - Vol. 26, N 1. - P 77-83.
11. Bonassi S., El-Zein R., Bolognesi C., Fenech M. // Mutagenesis.
- 2011. -Vol. 26, N 1. - P 93-100.
12. FenechM. // Mutagenesis. - 2005. - Vol. 20, N 4. - P. 255-269.
13. FenechM., HollandN., ZeigerE. et al. // Mutagenesis. - 2011. -Vol. 26, N 1. - P. 239-245.
14. Lal A., Ames B. // Mutagenesis. - 2011. -Vol. 26, N 1. - P. 5762.
15. MiglioreL., CoppedeF., FenechM., ThomasP. // Mutagenesis. -2011. -Vol. 26, N 1. - P. 85-92.
16. ThomasP., HollandN., Bolognesi C. et al. // Nat. Protoc. - 2009.
- Vol. 4. - P 825-837.
17. Tolbert P.E., Shy C.M, Allen J.W. // Mutat. Res. - 1992. -Vol. 271, N 1. - P. 69-77.
Поступила 20.02.12
72
