CC BY
43
ПРОБЛЕМЫ НАУКИ
Известия ТСХА, выпуск 4, 2010 год
УДК 573.6:577.11-022.532
ЦИТОАКТИВНЫЙ БИОПОЛИМЕР-СОЛЕВОЙ КОМПОЗИТ С НАНОРАЗМЕРНЫМИ КРИСТАЛЛАМИ
С.Д. ЛИТВИНОВ
(Центр нанобиотехнологий РГАУ - МСХА имени К.А. Тимиря зева)
Б статье приводятся анализ имплантационных материалов, необходимые условия синтеза универсального материала для восполнения дефектов тканей, данные синтеза цитоактивного биополимер-солевого композита. Обсуждается эффективность и перспективы работы со стволовыми клетками как инициаторами избирательной регенерации. Предлагается версия механизма действия цитоактивного композитного материала для регенерации различных типов ткани.
Ключевые слова: биополимер-солевой композит, биоматериал, наноразмерный гидроксил- и гидроксилфторапатит, регенерация ткани, стволовые клетки.
В настоя щее время для создания имплантатов широко применяется комбинация биополимерных (коллагеновых или альгинатных) волокон с неорганическими соля ми [1]. Ранее в качестве солевого компонента приме-н лись гранулы аттапульгита (глина) в смеси с коллагеном [2]. Более сложная композиция, состоящая из коллагена (5$25%), минеральных частиц (75$95%) и остеогенного фактора (0,5$4%) предлагалась как материал, обеспечивающий костную индукцию и полную репарацию костных дефектов [3]. В качестве минеральной добавки использовалась смесь гидроксилапа-тита и трикальций фосфата.
Авторы работы [4] разработали технологию получени волокнистого наполнител из гидроксилапатита в «интактном виде» с хорошей биосовместимостью. Он может быть использован с различными биополимерами, в т.ч. и коллагеном.
В патенте [5] предлагается материал дл витализации поверхностей
имплантатов на основе поглощаемых биополимеров. В материале содержатся неорганические добавки, в т.ч. ортофосфат кальция и(или) гидрокси-лапатит. Запатентован материал дл имплантатов [6], состоя щий из частиц фосфата кальци и пептидного восстановленного волокнистого коллагена. Материал я вля ется неиммуноген-ным и через него происходит прорастание вновь формирующейся ткани.
В патенте [7] для получения материала дл костных имплантатов авторы использовали лиофильную сушку смеси коллагена и гидрокси-лапатита. В изобретении [8] предлагалось использовать дл сокращени сроков сращени костных отломков искусственную мозоль в виде муфты, с помощью которой отломки прочно бы фиксировались. Муфта образовывалась в результате ультразвуковой обработки смеси, состоящей из ги-дроксилапатита (58-60%), желатина или коллагена (30-32%) и воды (6%), введённой в зону костного дефекта.
Биокерамика или стеклокерамика, или поликристаллическая керамика стали примен тьс в клинической практике с начала 60-х годов ХХ века. Были получены образцы стёкол с вкраплениями меди, серебра, золота, осажденных с помощью ультрафиолетового излучени [9].
Эти металлические ингредиенты придали стеклу отличные механические и термические свойства. Таким образом были получены первые имплантаты «В^1авв», «Ceravital» [10, 11].
Стеклокерамические имплантаты имеют хорошую биосовместимость, т.е. образуют большое количество св -зей с края ми костного дефекта. Позднее в биокерамические имплантаты стали добавл ть оксид алюмини , оксид кремния, фосфат кальция [12] или только фосфат кальция [13], или только гидроксилапатит [14]. В патенте [15] разработан способ нанесения биоактивных покрытий из фосфата кальци на имплантаты из инертного материала. Из соответствующих растворов получают аэрозоль, содержащий ионы кальция и ионы ф осфата, и он наноситс на гор чую поверхность имплантата. В процессе осаждения аэрозол на поверхности имплантата образуетс гладка плёнка.
Применение композитов дл «запуска» регенерации того или иного типа ткани предполагает отсутствие на его поверхности болезнетворных микроорганизмов.
Стерилизаци имплантатов осуществляется как физическими, так и химическими агентами [16]. Химическими агентами вл ютс окись этилена и формалин [17], физическими — гамма(у)- и УФ-излучения [18, 19]. Обычно для стерилизации в лабораторных услови х используетс
0,25 или 0,5% раствор формалина. Сроки стерилизации — 5-7 сут. Формалин, сочетающий в себе стерилизующие и консервирующие свойства, остаётся основным препаратом, используемым при заготовке трансплан-
татов и изготовлении имплантатов. Однако формалин необычайно склонен к полимеризации и спонтанным реакци м окислени и конденсации, что приводит к значительному снижению активности агента и его растворов [20, 21]. А это ощутимо влия ет на результаты стерилизации. Авторы [16] считают, что разноречивые данные о стерилизационной активности формалина свидетельствуют о том, что при его применении не учитывается содержание формальдегида в исходном продукте. В товарном формалине его содержание постоя нно занижено. Необходимо также отметить, что в свя зи с обнаружением у формальдегида канцерогенных свойств его применение дл стерилизации и консервации тканей не рекомендовано Международной ассоциацией хирургов.
Отличительной и весьма ценной особенностью окиси этилена как стерилизующего агента вл етс его способность глубоко проникать в обрабатываемые объекты и довольно быстро улетучиватьс при комнатной температуре. Сжиженный препарат обеспечивает стерильность биоматериалов в течение 30 мин, а в 50%-м разведении — в течение 1 ч. Стери-лизаци осуществл етс путём погружения трансплантата в рабочую смесь с последующим его проветриванием и помещением в стерильную посуду. Применение концентрированной смеси окиси этилена требует особых условий дл защиты персонала от вредного действи его паров (работа в противогазах). Поэтому применение слабых растворов (1 %) препарата крайне желательно. Автором [16] разработан способ, позволяющий помещать трансплантат в охлаждённый физиологический раствор, к которому добавляется охлаждённая окись этилена до количества, необходимого для получения 1% раствора. Сте-рилизаци окисью этилена более надёжна, чем стерилизация формали-
ном, так как у микроорганизмов нет устойчивости к ней.
Наиболее удобным и надёжным способом стерилизации трансплантатов (имплантатов) я вля ется у-излу-чение. Согласно данным [22], сте-рилизаци коллагена и коллаген-
минеральной смеси у-излучением в интервале от 2 до 40 кГр не приводит к изменению биосовместимости имплантатов. Граница подлинности стерилизации соответствует 15 кГр. В соответствии с имеющимис данными, стерилизацию имплантатов для биологических и клинических испытаний целесообразно проводить дозой в 25 кГр.
В работе [23] оцениваетс уровень у-излучения для имплантатов, инфицированных гепатитом В и С. Обращается внимание на то, что общепринятая в мире доза в 36 кГр не обеспечивает уничтожение вируса гепатита, так как дл этого требуетс 50 кГр. Но столь высока доза оказывает отрицательное побочное воздействие на микроструктуру имплантата.
Изготовление имплантационных
материалов на основе клеточных технологий (инжиниринг тканей) предполагает изначальную стерильность в производственном цикле. Последнее обсто тельство требует дорогостоящего оборудования, постоянный контроль процесса и особые услови хранени готовой продукции. Это повышает стоимость материала дл регенерации, что делает его широкое применение дл основной части населения маловозможным.
Тем не менее клеточные технологии (биотехнологии) занимают львиную долю внимани современных учёных, работающих над созданием имплан-тационных материалов. Из существующих на сегодн шний день материалов больша их часть предназначена дл регенерации костной ткани. Однако заболевани паренхиматозных органов (легкие, печень, почка, поджелудочная железа), а также дефек-
ты сердечной мышцы (миокарда), повреждения периферических нервов с большим диастазом (разрывам в несколько сантиметров) стимулируют поиск материала универсального характера, т.е. материала, способного восстанавливать не выборочно один тип ткани (кость или хря щ, или легкое, почку и т.д.), а несколько типов сразу. Часто аварийная ситуация наносит организму повреждение не одного органа или ткани, а нескольких, т.е. вл етс политравмой.
Таким образом, идеальным явля-етс создание имплантационного материала универсального типа.
Замещение дефектных участков костной, хрящевой и мягкой (паренхиматозных органов) тканей имплан-тационным материалом с целью вос-становлени полноценной бездефектной тканевой структуры, на первый взгляд, кажется совершенно невыполнимой задачей.
Даже в случае восполнения только костных дефектов материалы могут быть представлены несколькими группами [24]. Например, по способу получени имплантаты подраздел -ются на 4 группы: натуральные, синтетические, композиционные, полу-синтетические.
Натуральные материалы (биологического происхождения) включают: костные трансплантаты (ауто-, алло-и ксенокость, например, материал Вю-Обб [25]); продукты размножения клеток (аутогенные кость и хр щ).
Синтетические материалы полностью состоят из веществ, получаю-щихс соответствующими химическими способами. Они подраздел ютс на: полученные неорганическим синтезом (биостекла, биокерамика); полученные органическим или ферментативным синтезом (органические полимеры, например, Б,Ь-полилактид; факторы роста костной ткани, например, костный морфогенетический белок ВМР — синтетический по способу получени ).
Полусинтетические материалы — материалы натурального происхождения , претерпевшие химическую, физическую или термическую обработку. Дл этого чаще всего используется кость животных.
Композиционные материалы (композиты) представл ют собой комбинации веществ натуральных, синтетических и полусинтетических; обычно они вл ютс механическими смес -ми нескольких различных компонентов. Примерами подобных материалов могут быть: неорганические носители, содержащие в себе действующие вещества, например, факторы роста костной ткани или концентрат из тромбоцитов; органические матрицы с неорганическими добавками.
Согласно [26] композитные материалы — это смесь двух или более фаз, свя занных вместе так, что передача механического напряже-ни происходит по их границе. Композитные материалы позвол ют обеспечить сочетание свойств, которые не могут быть достигнуты с помощью материала, представляющего собой одну фазу (под фазой понимается однородная часть гетерофазной, т.е. разнородной, системы). Идеальным композитом является кость, так как фибриллы коллагена, имеющие низкий модуль упругости (низкие прочностные свойства), сочетаются на на-нометрическом уровне с кристаллами гидроксилапатита (точнее карбонатги-дроксилапатита — даллита), которые имеют высокие прочностные характеристики. Учитывая, что в нативной костной ткани солевой компонент (апатит) свя зан химическими свя зя -ми с коллагеновыми волокнами и что блоки кристаллов имеют регул рное расположение в пространстве некоторые исследователи [26] считают, что такое сочетание фаз композита вл -етс идеальной моделью имплантаци-онного материала. Дл оценки качества такого материала при сравнении
с качеством натуральной кости предлагается индекс (7Ч):
I, = (Б х Р х Т) / Ю [26]
где Ю — модуль упругости Юнга; Р — прочность на растяжение; Т — трещиноустойчивость; Б — биоактивность (Б).
Такие материалы, как Bioglass®, СегаБогЪ®, имеют одного порядка с таким же индексом для кортикального сло трубчатой кости. Тем не менее, их эффективность оставляет желать много лучшего, так как врем биодеградации этих и других керамических материалов, так же как и у кости, исчисля ется меся цами и годами. А это таит в себе определённую опасность. Многолетний опыт приме-нени дл имплантации ауто- и аллокости подтверждает это.
Таким образом, приходится согласиться с тем, что приведение прочностных характеристик композита в соответствие с костными вл етс не только неправильным, но и порочным, так как тормозит развитие исследовательской мысли в направлении совершенствовани и универсализации имплантационных композитов. Видимо, поэтому авторы работы [26] признают возможность создания биосовместимых рассасывающихс
каркасных материалов.
Под биосовместимостью можно понимать наличие у материала двух существенных свойств: эффективного функционировани и отсутствие токсичности [26]. При этом биосовместимость не вл етс только свойством материала.
К биосовместимым материалам относятся: биоинертные, рассасываю-щиес (биодеградируемые) и биоактивные.
Биоинертные материалы вызывают в организме реакцию в виде ин-капсул ции имплантата в рыхлую соединительную ткань с образованием рубца.
Рассасывающиеся (биодеградируе-мые) материалы обычно растворя ют-ся (лизируются ) при контакте с биологическими жидкостя ми in vivo.
Биоактивные материалы стимулируют реакцию организма. Различают два вида: остеокондуктивные и остео-продуктивные. Кондуктивные материалы стимулируют рост кости своей поверхностью за счёт включения в состав малорастворимого солевого компонента: среднего фосфата кальция, октафосфата кальция, гидроксила-патита или другой малорастворимой соли с биогенными элементами, например, магнием.
Остеопродуктивные материалы
(остеоиндуктивные) стимулируют
рост костной ткани в направлении от границы кость — имплантат.
Относительно роли каркаса в им-плантационном композите распространено соображение: «для того,
чтобы можно было регенерировать ткань каркасы должны иметь структуру, которая действует как шаблон, или матрица дл роста ткани в трёх направлени х и стимулирует новый рост в форме, заданной каркасом. Очевидно, что конструкцией шаблона я вля ется структура, копирующая структуру ткани организма-хоз ина. Для того чтобы позволить ткани расти в трёх направлени х, шаблон должен быть сетью больших пор (макро-пор). Поры должны быть соединены друг с другом, а отверстия между порами должны иметь диаметр более 100 мкм. Взаимосвя занная сеть пор необходима для того, чтобы позволить клеткам мигрировать по каркасу и способствовать росту ткани на протяжении всего шаблона. В конечном счёте идеальные каркасы стимулируют рост кровеносных сосудов (ангиогенез) внутри сети пор» [26].
Нашей задачей было создание композитного имплантационного быстро биодеградирующего материала, имеющего универсальный характер действия, т.е. способного обеспечить
регенерацию не только костной, хря -щевой, но и ткани паренхиматозных органов.
Придание более широкого спектра действи имплантационному мате-
риалу (не только дл костной ткани) предполагает решение р да проблем, иногда взаимоисключающего характера, как, например, необходимость быстрой биодеградации материала (дни или недели) и наличие у него же высоких (соизмеримых с костными) прочностных характеристик.
Таким образом, идти по пути создания материла с «концентрацией» различных свойств в нём (типа три в одном или п ть в одном) авторам кажется неприемлемым и, скорее всего, невозможным. Во вся ком случае, очень затратным по конечному результату. Известно, что «золотой» материал, как бы универсален он не был, никогда не будет востребован по экономическим соображения м. В этом случае можно апеллировать только к регенераторным механизмам организма на генетическом уровне.
Известно, что инфекция может присоедин тьс к имплантированному материалу в течение пяти (!) лет [27]. Поэтому минимальность времени пребывани в организме протезирующего инородного тела — залог успешного восстановлени ткани в дефектном участке. Дл выполнени этой задачи мы приступили к созданию имплантационного биодеградирующего материала с минимальным временем нахождения в биологической системе.
Исследовательский опыт наших предшественников [28, 29] показы-
вал, что оптимальный результат (по затратам и эффективности действи ) может быть получен, если на некую матрицу (иногда называемую матриксом) осадить кристаллы нанометри-ческого размера плохо растворимой соли (с произведением растворимости 10-20 и меньше при наличии в формульной единице 3$5 ионов). В роли
матрицы должен выступать нетоксичный биодеградируемый полимер неиммуногенного характера, а солевым компонентом может быть плохо растворимая соль, которая почти не подвергаетс гидролизу дл сохранения рН в пределах 7-8.
Нами (в качестве матрицы) был выбран биополимер (коллагеновое или альгинатное волокно), а солевой компонент — гидроксилапатит (Са10(ОН)2(РО4)6 = 10Са2+ + 2ОН- + + 6РО43-), который имеет произведение растворимости 1,022 -10-122 [30]. Рассчитанна из произведени растворимости равновесна концентрация иона кальция [Са2+] в насыщенном растворе этой соли должна быть равна 0,24-10-7 М/л. На самом деле равновесие in vivo поддерживается нахождением в сыворотке крови Са2+ и НРО42-, тогда активная концентра-ци кальци в сыворотке крови дл взрослого здорового человека натощак будет аСа = 0,47-10-3 М/л [31].
Работа по созданию материала сопряжена со значительными трудностями, так как материал будет на-ходитьс и про вл ть свои свойства в среде, которая я вляется продуктом многих процессов, идущих одновременно в колебательном режиме [32, 33]. При этом всенепременно выполнение следующих условий: материал должен быстро биодеградировать (дни или недели); быть пористым; быть цитоактивным (стимулировать регенерацию на генетическом уровне).
Сочетание этих условий предполагает, что материал будет композитным, что и сможет обеспечить универсальный характер его дей-стви . Композитность подразумевает наличие фибриллярной матрицы, на волокнах которой расположены нано-размерные кристаллы соли (гидроксил- или гироксилфторапатита). Пористость необходима дл диффузии внутрь полипатентных малодифференцированных (стволовых) клеток, а
солевой компонент — дл стимул ции этих клеток к «запуску» регенерации. Таким образом, это должен быть биоматериал, запускающий (инициирующий регенерацию) на генетическом уровне.
Дл восстановлени ткани в области дефекта в насто щее врем при-мен ютс разнообразные материалы биологического и небиологического происхождения . При этом все они называются «биоматериалами» (не по характеру происхождения, а по области применения, т.е. для биологических объектов). Биоматериалы, обеспечивающие регенерацию ткани, ещё называются имплантатами, трансплантатами, композитами. Диапазон их применени широк: заполнение корневого канала зуба [34] или полости кисты кости [35], замещение хрящевой перегородки носа [36], заполнение области дефекта в ткан х паренхиматозных органов [37], миокарда [38]. Видимо, в связи с этим «биоматериал» имеет несколько толкований. Он может трактоваться как природный или синтетический материал, используемый для того, чтобы заменить часть биологической (живой) системы. При этом предполагается, что он (материал) функционирует в близком контакте с биологической тканью. Специальный комитет при Клемсонском университете [27] формально определил «биоматериал (biomaterial)», как системно- и фармацевтически инертное вещество, разработанное (предназначенное) дл внедрени в определённых пределах или объединения с живыми системами. В противоположность понятию «биологический материал (biological material)») — материал типа матрицы кости или эмали зуба, сформированный в биологической системе. При этом предполагается, что искусственные материалы или приспособлени , которые просто наход тс в контакте с кожей, типа слуховых аппаратов, не являются биоматериалами, так
как кожа действует (выступает) как барьер, отграничивающий биосистему от внешнего мира. Использование биоматериалов подразумевает замену части органа тела (котора потер -ла свою функцию в св зи с болезнью или травмой), помогая заживлению или улучшению функции и ликвидации патологии.
Другие авторы [39] под биоматериалом понимают материал, биологически совместимый с тканью, т.е. вызывающий адекватный отклик — не токсичный, не иммуногенный, не вызывающий других реакций организма, не отторгающийся им как инородное тело. При этом материал должен быть биологически активным. Имплантируемый биоматериал должен сохранять свои функциональные качества в течение определённого периода времени, не изменяя существенно свою структуру и механические свойства [39].
Не менее витиевато определ ют биоматериал авторы [40], которые считают, что биоматериал — это материал, обладающий адекватными физическими и механическими свойствами для выполнения своей функции.
Все предложенные ранее толко-вани биоматериала предполагают некоторую (в той или иной степени) инертность, что, скорее, может соответствовать пон тию «протез», которое определ етс как изготовленное человеком устройство, используемое внутри организма для замены, восстановления или усиления поражённой болезнью, поврежденной или отсутствующей части тела [40]. Синонимом «протез») я вля ется «имплантат».
В формировании пон ти (в данном случае «биоматериал») необходимо определить главное свойство, или признак материала или процесса, который закладывается в основу определени .
В работе [27] — это инертность вещества, в работе [39] — также инерт-
ность, а в работе [40] — выполнение «своей функции». Эта функция может быть представлена двум составл ю-щими: а) механическое восполнение дефекта ткани органа тела, б) стимул ци регенерации ткани в зоне дефекта.
Механическое восполнение или коррекци дефекта с помощью инертных имплантатов (металл, керамика) на данном (современном) этапе — малоперспективный путь. В свя зи с растущей потребностью в долгосрочном восстановлении предполагаетс сместить акцент с замены тканей протезами на регенерацию или обеспечение неким механическим приспособлением (аппаратом) восстановлени ткани с последующим удалением приспосо-блени . Весьма успешный опыт в этом направлении — применение аппарата Г.А. Илизарова. Но этим приемом обеспечиваетс (и то не всегда) рост только костной ткани.
Поэтому кажется более перспективным развитие научного направ-лени по регенерации тканей путём введени некоего вещества в организм, стимулирующего клеточную де тельность самого организма. Это направление развиваетс благодар
развитию исследований в области инжиниринга тканей человеческого организма. Инжиниринг тканей — это конструирование и создание в лаборатории живых функциональных компонентов, которые могут быть использованы дл регенерации неправильно функционирующих тканей. Более упрощенно инжиниринг можно представить как выращивание фрагментов тканей человеческого организма in vitro с последующей имплантацией их. Это предполагает работу с клеточным материалом пациента или донора.
Другим подходом инжиниринга я в-ля ется «производство» (выращивание) стволовых клеток, с последующим введением их в дефектный участок организма, что также предполагает
работу с клеточным материалом «на стороне») (вне организма). Теоретически плодотворность такого подхода к регенерации вл етс оправданной. Однако на практике результаты не всегда соответствуют ожидания м: видимо, современный уровень развития научной мысли или технических возможностей не позволяет управлять поведением стволовых клеток после их возвращени из реактора (термостата) в биологическую систему организма.
Тем не менее, клеточная индустрия развивается бурно, так как формирование фрагмента требуемой ткани без участия клеток невозможно. Идентификация стволовых клеток и возможность их забора у пациента, высевание их на каркасы необходимой архитектуры in vitro позвол ет расширить круг регенерируемых тканей.
В насто щее врем внимание исследователей сосредоточено на разработке каркасов дл инкубировани клеточной массы перед помещением в область дефекта. В качестве каркасов можно использовать как биоинерт-ные материалы (оксид алюмини , оксид циркония, металлы и сплавы, полиэтилен), рассасывающие (поли-гликолива и полимолочна кислоты, коллаген, альгинат кальция-натрия, фосфаты кальция), так и биоактивные (гидроксилапатит, фторгидрок-силапатит, керамика на основе среднего фосфата кальци ).
Иногда высказываетс ошибочное мнение, что «каркасы должны иметь структуру, которая действует как шаблон, или матрица для роста ткани в трёх измерени х и стимулирует новый рост в ф орме, заданной каркасом. Очевидно, что конструкцией шаблона я вля ется структура, копирующая структуру ткани организма-хоз ина» [40]. Это умозрительное и ничем не подтверждённое заключение отчасти вл етс не только неправильным, но и вредным, так как тормозит развитие научного поиска в перспектив-
ном направлении. Роль каркаса может быть совсем иной. В одном авторы сходятся несомненно: каркасы, с культивированными на них клетками in vitro (ещё эти каркасы называютс «конструктами») после имплантации должны способствовать росту кровеносных сосудов, т.е. обеспечивать ангиогенез.
Однако если в ткани «хозяина») остаетс искусственный материал,
то регенерации тканей до их первоначальных состояний и функций не происходит. Из этого следует, что идеальные каркасы должны быть рассасывающимися , с тем, чтобы в конечном счёте не имелось никаких следов их присутстви .
Учитывая, что нахождение инородного тела в организме-хоз ине (в течение длительного времени) не исключает присоединение к нему инфекции [27], наиболее эффективным с позиций инфицировани будет материал, каркас которого существует в зоне регенерации минимально возможное время.
Считается, что механические
свойства конструкта, получаемого посредством инжиниринга тканей, должны соответствовать механическим свойствам ткани организма хо-зя ина [40]. По мнению авторов, это очевидно из опыта полной замены бедра. К сожалению, данный пример не я вля ется убедительным, так как в случае замены бедра никакой регенерации тканей не происходит. С точки зрения авторов [41], невозможно создать имплантат, который бы имел одновременно и высокие прочностные характеристики (наподобие костных) и малое врем биотрансформации (быструю биодеградацию), чтобы исключить возможность инфи-цировани . Услови регенераторного процесса заставл ют выбрать: либо прочностные свойства, но длительная биодеградация имплантата, либо отсутствие прочностных свойств, но быстра биотрансформаци материа-
ла в здоровую полноценную ткань. В свя зи со сказанным кажется перспективным разработка материала (имплантата), который без привле-чени (или культивировани ) клеток (в режиме in vitro) мог бы, благодаря своему химическому составу, стимулировать клеточную де тельность самого организма, т.е. запускать регенераторный механизм, апеллируя к малодифференцированным клеткам самого организма-хоз ина (рис. 1).
Такой материал (композит), разработанный нами в конце 90-х годов под названием «ЛитАр») [42], продолжает совершенствоваться в лаборатории Центра нанобиотехнологий РГАУ - МСХА имени К.А. Тимиря зева [43]. Он представля ет собой систему биополимерных волокон с осаждёнными на них кристаллами гидроксил-или гидроксилфторапатита (рис. 2).
На рисунке 2 представлена фотографи материала под электронным микроскопом. Видно обилие кристаллов апатита и пространства микронных размеров между волокнами биополимера.
Таким образом, одно из условий — пористость — в описываемом композите реализовано. Оно же обеспечивает быструю биодеградацию, так как клетки организма могут свободно перемещаться внутри материала, вы-зыва его лизис в кратчайшие сроки (2$3 нед.). Для стимулирования клеточной активности на генетическом уровне необходимо проникновение кристаллов апатита внутрь стволовой клетки. Это предполагает наличие в композитном материале наноразмер-ных кристаллов.
Для подтверждения наличия в нашем материале апатита и наноразмерности его кристаллов было проведено рентгенофазовое исследование образцов композита на альгинатной и коллагеновой основе (на рисунках 3 а и б приведены их диф-фрактограммы). Поскольку набор
Рис. 1. Схема строения биополимер-солевого композита: ломаные линии — волокна полимера, звёздочки — нанокристаллы соли (гидроксил- или гидроксил-фторапатита)
Рис. 2. Биополимер-солевой композит Электронный микроскоп Jem-2000 FX-II.
Ув. х 300
основных рефлексов, характеризующий апатитную структуру, находится в интервале 30$35 20° и одинаков для обоих образцов, то на одном рисунке (3 а) приведен полный спектр в широком диапазоне 10-50 200, а на другом (3 б) — более подробный в интервале 30$35 200.
| | ЛитАр: альтинг 1т + апатит
2000 -1800 -1600 - I ; ; ; I ; ; г I | 1 ! 1 ; г \
- ; ; 1
1000 -800 - ! ! ; ! : ! ? !
■У ; :■ : £ ! т/; ¥Ь Г "”36.9113 39.7' : : —{— 39 ' '' 47 8990 — ‘
200 - 20*
1 ^ ж 4-++—К —1 "^7-1 М- 45
б
Рис. 3. Рентгенограммы образцов биоматериала (композита) на альгинатной (а) и коллагеновой (б) основе. По оси Х — угол поворота каретки в 20°, по У — интесивность рентгеновского излучения. Анализ выполнен на диффрактометре ДРОН-7
На основании данных рентгенофазового анализа (рис. 3 а, б) синтезированного нами материала произведён расчёт средних значений кристаллов апатита в биополимер-солевом композите (таблица).
Из данных таблицы следует, что размер кристаллов (Ь), рассчитанных по формуле Шерера (Ь = КХ/вшеов®), колеблется в интервале 11-17 нм. При этом невозможно определить, какой
из этих размеров я вляется среднестатистическим.
Более точные результаты можно получить, используя метод мягкой абляции объекта под воздействием субмиллиметрового излучени лазера на свободных электронах [44]. В результате измерений, проведённых с помощью этого метода, было установлено, что в биополимер-соле-вом композите находится две фрак-
Параметры кристаллических фаз образцов, синтезированных на биополимерной матрице
Параметр Са5(РО4^ JCPDS 34-0011 Ca^PO^OH JCPDS 09-0432 ^нтезированные образцы
1 2 3 4 5 6 7
а, А 9,38 9,42 9,52 9,41 9,36 9,41 9,41 9,41 9,41
с, А 6,88 6,88 6,21 6,54 6,69 6,54 6,78 6,78 7,05
L, нм — — 10,62 14,15 16,99 14,15 10,62 12,13 16,99
X, % — — 0,014 0,033 0,057 0,033 0,014 0,021 0,057
ции нанокристаллов: 3-5 и 25-90 нм (с максимальным содержанием частиц среднегеометрического диаметра 45 нм). Те же измерения показали, что трубчатая часть большеберцовой кости взрослого человека имеет среднегеометрический диаметр частиц 38 нм, что соответствует данным других авторов [27]. Близкие значения кристаллических размеров соли (апатита) в кости и материале говорит о том, что их различает только регу-ля рное (для кости) и хаотическое (для композита) расположение минерального компонента (гидроксилапатита), соответствующее в обоих случаях примерно 70% (вес).
Наличие наночастиц «малого» диаметра позволяет предположить о возможности диффузии их в протоплазму клетки, как это показано на рисунке 4.
Гидролиз гидроксил- или гидрок-силфторапатита в замкнутом пространстве (протоплазме или я дре клетки) приведет к изменению рН примерно до 7, что ослабит водородные свя зи между гетероциклами двойной спирали ДНК, этого достаточно для её раскрытия и запуска регенераторного механизма.
В завершении необходимо отметить, что эволюция имплантаци-онных материалов от аллокости до полимер-солевых композитов в основном св зана с созданием заменителей костной ткани. Попытка синтеза материала, универсального по свойствам
Рис. 4. Поглощение кристаллов гидроксила-патита (НА) полиядерными нейтрофилами (Polymorphonuclear Neutrophils) [45]
(не только дл регенерации костной, но и хрящевой тканей паренхиматозных органов) привела к необходимости вовлечени в этот процесс малодифференцированных стволовых клеток. Имеющийся опыт показывает, что клетки, выведенные из организма, после их обработки в термостате не всегда дают воспроизводимый желаемый результат при обратном их введении. Более перспективным кажется создание материала, который после имплантации апеллировал бы непосредственно к стволовым клеткам самого организма без извлечения их наружу. При этом воздействие
введённого материала должно быть таково, чтобы инициировать регенерацию на генетическом уровне.
Представленные результаты показали наличие такой возможности у цитоактивного биополимер-солевого композита, в состав которого входят наноразмерные кристаллы апатита.
Анализ экспериментальных и клинических результатов применени биокомпозита в медицине и сельском хозяйстве позволил предложить механизм, который требует дальнейшей детальной проверки.
Возможность применения «ЛитАр» в сельском хозяйстве предполагает два пути развития: животноводство и садоводство (возможно и растениеводство). В первом случае можно использовать регенераторные способности материала дл восполнени
дефектов костей крупных животных (лошади, коровы, свиньи), например, восстановление поврежденной при опоросе ключицы свиноматки.
В садоводстве (растениеводстве) перспективными вл ютс опыты по действию «ЛитАр» на ткани ствола дерева, которые проводили на 6$ 7-летних свободнорастущих деревь х сосны обыкновенной [43]. В середине июня на уровне 5-го междоузлия удал ли участок луба размером 30 мм по горизонтали и 10 мм по вертикали, в контроле сразу прикладывали
его на место, в опыте вначале наносили 20 мг «ЛитАр» в сухом виде на камбиальную зону (3 см2), место повреждения закрывали скотчем. В каждом варианте было 3 дерева. В начале сентя бря взя ли высечки, включавшие весь луб и древесину текущего и частично предыдущего года. Высечки делали так, чтобы они захватывали зону повреждения и участки, находя -щиеся от нее на 1,5 см выше и ниже (размеры высечек 50-60 мм в вертикальном направлении и 12-15 мм в горизонтальном).
На основании анализа срезов высечек, сделанных на удалении 15 мм вниз по стволу от места механического повреждения можно сделать вывод о том, что добавление композита «ЛитАр» приводит к снижению степени травматизации тканей, при этом продолжается нормальная диф-ференциаци сло флоэмы и ксилемы текущего года (флоэмо- и ксилогенез). Причинами такого действи могут быть как ускорение заживления непосредственно в зоне травматиза-ции, так и блокировка исходя щих из этой зоны сигналов. Данные пилотные результаты открывают перспективу применени цитоактивного композитного нанокристаллического материала «ЛитАр» как активатора биологических процессов в объектах сельского хоз йства.
Библиографический список
1. Леонтьев В.К., Литвинов С.Д., Судакова Т.В. Имплантационные материалы для замещения дефектов костной и хрящевой ткани // Российский вестник дентальной имплантологии, 2003. № 2. С. 10-19.
2. Berenguer A. Clay-collagen complex an process for their retention. Eupopean patent specification 0154741 B1. A 61 127/00. 14.03.84.
3. Chu G., Marthan R. Inductive collagen — based bone repair preparations. United States Patent N 4. 886336. 19.12.1989.
4. Toa N.K. Fibrous bone filler and process of producing the same. European Patent N 0241753 H61 1 27/00. 20.03.86.
5. Ruhland N. Material zum vitalisieren von implantatoberflachen. Dtsch. Paten-tampt. DE 3409372 A1. 19.09.85.
6. Pier K.A., Brace B.Ph. Xenogenic collagen/mineral preparations in bone repair. Unated States Patent N 4. 795.467. 03.01.89.
7. Ries P., Mitteimeler H. Verfahren zur. Her stellung von Knochenersaltz Material. European Patent 0164483 B1. 12.06.84.
8. Поляков В.В., Чеменов Г.Г. Способ остеосинтеза. А. С. 1685420 от 28.09.88 .
9. Park J.B., Lakes R.S. Biomateriales: Nev York. Plenum Press, 1992.
10. Ogino M., Ohuchi F., Hench L.L. Compositional dependence of the formation of calsium phosate film on bioglass // J. Biomed. Mater. Res., 1986. Vol. 12. P. 55-64.
11. Torigama M. Composition for coating bioceramics and composite biocertamics produced there with. United States patent N 4988362. 29.01.91.
12. Bolander M.R., Bllian G. Use of demineralized bone matrix in the repair of segmental defects. United States Patent N 4902296. 20.02.90.
13. Grunecker A. Fleible Prothsen Mirivorgegebener Geitalt und verfahren zu ihrer Herstellung. Dtsch. Patent D.E. 3611798 Al. 04.12.86.
14. Heikkila I. Bioactive glass versus hidroxyapatite in reconstration of osteochondral defects in rabbit // Acta orthop. Scand., 1993. Vol. 64, N 6. P. 678-682.
15. Berenguer A. Clay-collagen complex an process for their retention. European patent specification o154741 B1. A 61 127/00. 14.03.84.
16. Савельев В.И., Родюкова Е.И. Трансплантация костной ткани. Новосибирск: Наука, 1992.
17. Уокер Дж. Формальдегид. М.: Иностр. лит-ра, 157.
18. Волова Л.Т. Аллогенные деминерализованные костные матриксы и регуляция остеогенеза: Автореф. докт. дис. М., 1997.
19. Прокопова Л.В., Николаева Н.Г. Использование УФ-облучённой аутоспонгио-зы при костнопластических операция х у детей // Вест. хир. им. И.И. Грекова, 1990. Т. 145. № 12. С. 58-61.
20. Паньшин А.Г., Соколова Л.И., Фридлянская И.И. Цитотоксические свойства слабых растворов формальдегида // Трансплантация биологических тканей, стерилизованных и консервированных формалином, 1980. Вып. 5. С. 26-34.
21. Парфентьева В.Ф., Разводовский В.Д., Дмитриенко В.И. Консервация гомологичных костных трансплантатов. Кишинёв: Картя Молдoвеняска, 1969.
22. Smestad T.L. Gamma irradiation of collagen/mineral mixtures. European Patent N 0270254. A 61 L 27/00. 06.11.86.
23. Лекишвили М.В., Исаева Е.И., Пономарёв В.Н., Васильев М.Г. Лучевая сте-рилизаци деминерализованных костных трансплантатов в свете профилактики инфицировани гепатитов В и С // Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова, 2002. № 1. С. 75-77.
24. Леонтьев В.К., Литвинов С.Д., Судакова Т.В. Имплантационные материалы дл замещени дефектов костной и хр щевой ткани // Российский вестник дентальной имплантологии, 2003. № 2. С. 10-19.
25. Schlegel A., Donath K. BIO-OSS — A resorbable bone substitute? // J LongTerm Effects Med. Impl., 1998. N 8. P. 201-209.
26. Хенч Л., Джонс Д. Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей. М.: Техносфера, 2007.
27. Park J.B., Lakes R.S. Biomaterials. An Introduction. N-York and London, 1992. 394 р.
28. Hayas^i K., Yabuki T., Tabuchi K., Fujii T. Repair of experimental bone defect with a collagen block containing synthesized apatite // Arch. Orthop. Trauma. Surg., 1982. N 4. Р. 265-269.
29. Mittelmeier H., Katthagen B.D. Clinical experience with the implantation of collagen-apatite for local bone regeneration // Z. Orthop. Ihre. Grenzgeb., 1983. N 2. P. 115-123.
30. Gineste L., Gineste M., Ranz X. et al. Degradation of hydroxylapatite, fluorap-tite, and fluorhydroxyapatite coatinig of dental implants in dogs // J. Biomed. Mater. Res. (Appl. Biomater.), 1999. N 3. P. 224-234.
31. Ньюман У., Ньюман М. Минеральный обмен кости. М.: Изд. ин. лит., 1961.
32. Корзухин М.Д. Колебательные процессы в биологических и химических системах. Под. ред. Г.М. Франка. М., 1967.
33. Этитейн И.Р., Кастин К., Де Кеппер П., Орбан М. Колебательные хи-
мические реакции // В мире науки, 1983. № 5. С. 72-81.
34. Litvinov S.D. , Chigarina S.E. Material «LitAr» for biological filling root canals // Intern . Dent. J. (Pub. by FDI World Dent. Press), 2001. N 5.
35. Литвинов С.Д., Буланов С.И. Коллаген-апатитовый материал при замещении дефектов костной ткани челюсти // Стоматология, 2001. № 3. С. 7-12.
36 Литвинов С.Д., Серёгин А.С., Пуштова Т.Б., Оленникова М.М. Перспективы применения материала «ЛитАр» для восстановления хрящевой перегородки носа у детей // Российская оториноларингология, 2006. № 3(22). С. 66-70.
37. Селякин С.П., Чучков В.М., Марков А.И., Назаров С.Б. Применение кол-лаген-гидроксиапатитового материала «ЛитАр» в условиях репаративной регенерации легочной ткани // Успехи современного ествествознания, 2005. № 12.
38. Markov I.I., Litvinov S.D., Vankov V.A., Skvortzov O.I. Stimulation of the postaumatic cellular myocardium regeneration by means of the polymer-salt-based composite material LitAr // The International Journal of Artificial Organs, 2009. Vol. 32. N 7.
39. Баринов С.М., Комлев В.С. Биокерамика на основе фосфатов кальция; Институт физико-химических проблемкерамических материалов. М.: Наука, 2005.
40. Хенч Л., Джонс Л. Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей. М.: Техносфера, 2007.
41. Литвинов С.Д., Ершов Ю.А. Биоадекватный имплантационный материал на основе коллаген-гидроксосолевого композита // Материаловедение, 2000. № 7. С. 34-38.
42. Litvinov S.D., Krasnov A.F., Ershov Yu.A. Specific Features of Bone Tissue Regeneration after Replacement of the defect with a Synthetic Implant // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. Plenum Publishing Corporation, 1995. Vol. 119. № 4. P. 422-425.
43. Литвинов С.Д. Наноразмерный материал «ЛитАр» и перспективы его при-менени в медицине и сельском хоз йстве. Нанобиотехнологии в сельском хоз й-стве. Доклады Международной научно-практической конференции 15-19 декабря 2008 г. М.: Изд-во РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева, 2008. С. 42-43.
44. Петров А.К., Козлов А.С., Тарабан М.Б., Горячковская Т.Н., Малышкин С.Б., Попик В.М., Пельтек С.Е. Мягкая абляция объектов под воздействием субмил-лиметрового излучения лазера на свободных электронах // Доклады Академии Наук, 2005. Т. 404. № 5. С. 698-700.
45. Velard F., Laurent-Maquin D., Bouthors S., Jallot E., Nedelee J.M., Be-laaouaj A.,Laquerriere P. Zinc Doped Hydroxyapatite as Immunomodulatory Biomaterial // Journal of Artificial Organs, 2009. Vol. 32. № 7.
Рецензент — к. с.-х. н. М.С. Раскин
SUMMARY
Implantation materials analysis, necessary synthesis conditions of universal material for tissue defects compensation, data on cyto-active biopolymer-saline composite synthesis are adduced in the article. Both effectiveness and perspectives of stem cells use, functioning as selective regeneration initiators, have been considered. Cyto-active composite material mechanism of action version for various tissue types regeneration has been offered.
Key words: biopolymer-saline composite, biomaterial, nanosized hydroxyl- and hydroxylfluorine apatite, tissue regeneration, stem cells.
Литвинов Сергей Дмитриевич — д. фарм. н. Эл. почта: [email protected]
