Цито-гистологическая характеристика каллусогенеза in vitro у Bryophyllum daigremontianum Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 575.113:575.16:581.162

ЦИТО-ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАЛЛУСОГЕНЕЗА IN VITRO У BRYOPHYIIUM DAIGREMONTIANUM

©2013 А.В. Гильмаева1, С.Н. Абрамов1, В.Ю. Горбунова1, Г.А. Геращенков2, Н.А. Рожнова2

башкирский государственный педагогический университет им. М. Акмуллы, г. Уфа 2Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, г. Уфа

Поступила 15.0.2013

В данной работе приведены результаты цито-гнстологического анализа развития каллусов Btyophyllum daigremonticmum, полученных при культивировании in vitro листовых высечек.

Ключевые слова. Bryophyllum daigremonticmum, каплусогенез, морфогенез, IfSrK, £477.

Для эффективного воспроизводства и рационального использования растительных ресурсов необходимо знание основных особенностей размножения растений. В основе механизмов различных способов размножения высших растений лежат явления дифференциации, дедифференциации и редифференциации клеток и изменение клеточных взаимодействий в составе целостного организма. Все эти явления связывают с функционированием меристематических (стволовых) клеток у растений [1, 2]. Из-за методических особенностей изучение процессов развития in vivo у Bryophyllum daigremonticmum достаточно сложное и трудоемкое. Хорошей модельной системой являются культивируемые in vitro ткани и органы растений [3], в том числе и каллусы [4].

Цель работы состояла в подборе оптимального соотношения фитогормонов в составе питательной среды для индукции каллусогенеза in vitro у В. daigremonticmum и цито-гистологическом анализе развития каллусов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили каллусы В. daigremontianum. В качестве эксплантов использовали листовые высечки, содержащие пропагулы. Высечки брали от листовых пластинок шириной 17-23 мм и длиной 40-47 мм [5].

Оптимальную концентрацию фитогормонов в питательной среде для индукции каллусогенеза определяли эмпирически. Было проанализировано 40 вариантов питательной среды Мурасиге-Скуга [6], различающихся по концентрации 6-бензиламинопурина (БАП) и индолил-3 -уксусной кислоты (ИУК). БАП использовали в концентрациях 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 и 1.5 мг/л. ИУК использовали

в концентрациях 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0 и 2.5 мг/л. Постоянные препараты готовили по [7].

Гильмаева Апина Владиславовна, студент, e-mail: abramov-67®)mail.ru; Абрамов Сергей Николаевич, к.б.н., доц., e-mail: abramov-67(a!mail.ru; Горбунова Вапентина Юрьевна, д.б.н., проф., e-mail: obg-bspu(a)mail.ru; Геращенков Григорий Алексеевич, к.б.н., старший научный сотрудник, e-mail: apomixis(a!anrb.ru; Рожнова Наталья Анатопьевна, к.б.н., научный сотрудник, e-mail: apomixis(a!anrb.ru

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе работы определяли оптимальное соотношение БАП и ИУК в питательной среде для индукции каллусогенеза. При этом показателем служила частота индукции каллусогенеза на различных вариантах питательной среды. Установлено, что максимальная частота индукции каллусогенеза (80-90%) отмечалась на питательной среде, содержащей 1.5 мг/л ИУК и 1.0-1.5 мг/л БАП.

Второй этап работы был посвящен цито-гистологическому анализу начальных этапов развития каллусов.

В качестве эксплантов использовали листовые высечки, содержащие пропагулы в стадии глобулярного зародыша (рис. 1 ci). В течение первой недели культивирования эксплантов in vitro происходила дегенерация глобулярного зародыша и частично окружающих его тканей (рис. 16). Возможно, это происходило вследствие избыточной концентрацией ауксинов в питательной среде, которые в больших концентрациях являются для клеток токсичными.

Появление каллусных клеток на поверхности эксплантов отмечалось на 12-14-е сут культивирования in vitro. Визуально каллусы представляли собой тонкий слой интенсивно делящихся недифференцированных клеток желтовато-зеленош цвета.

Цито-гистологический анализ показал, что каллус формируется вдоль сосудистых пучков листа и представлен мелкими интенсивно окрашенными клетками. В отличие от клеток формирующегося каллуса окружающие его клетки паренхимы листа гораздо крупнее и менее интенсивно окрашены, по-видимому, за счет сильной вакуолизации (рис. 2ci).

Формирование каллуса вдоль сосудистых пучков листа позволяет предположить, что каллусные клетки являются дериватами камбиальных клеток. Это объяснение кажется вполне логичным, так как после дегенерации соматического зародыша камбий представляет собой единственный источник меристематических клеток в культивируемом in vitro листовом экспланте.

В ходе дальнейшей пролиферации количество каллусных клеток увеличивается. В то же время клетки паренхимы листа дегенерируют (рис. 26).

1587

Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2013. Т. 15, № 3 (5)

Рис. 1. Цито-гистологические особенности листовых эксплантов BryophvUum daigremontianum в момент инокуляции на питательную среду для индукции каллусогенеза (а) и через 1 неделю культивирования in vitro (б). Световая микроскопия, постоянные препараты. Условные обозначения: ГЗ - глобулярный зародыш, ДГЗ - дегенерирующий глобулярный зародыш, ДПК - дегенерирующие паренхимные клетки, ГШ - паренхима листа

Рис. 2. Цито-гистологические особенности начальных этапов формирования каллуса В. daigremontianum: а -14-е сут культивирования in vitro: б - 17-е сут культивирования in vitro. Световая микроскопия, постоянные препараты. Условные обозначения: ДКК - делящиеся каллусные клетки, ДКП - дегенерирующие клетки паренхимы листа, КК - каллусные клетки, ПК - паренхимные клетки, ПрПч - проводящий пучок, СП - сосудистый пучок

Сформированный каллус представлял собой компактную структуру. Культивируемые в темноте каллусы имели светло-желтую окраску, которая после переноса каллусов на свет изменялась на зеленую. Это свидетельствует о том, что в клетках каллусов имеются функционирующие хлоропласты, способные к фотосинтезу. Эти данные согласуются с результатами [8], которые сообщают о получении каллусов из листовых эксплантов

В. daigremontianllm.

Цито-гистологический анализ показал, что клетки сформированного каллуса имели относительно одинаковые формы и размеры (рис. За). Изодиа-метрическая форма клеток, интенсивно окрашенная цитоплазма и плотное прилегание клеток к друг к другу характеризовали статус клеток каллуса как меристематически активных и о способности клеток каллусов к фотосинтезу.

В ходе дальнейшего культивирования поверхно-

стные клетки каллуса подвергались деструкции и на поверхности каллуса образовывался гомогенный слой полисахаридной природы, интенсивно окрашивающийся при использовании гистохимической реакции Шифф-йодная кислота (рис. 36). Известно, что такие изменения в структуре каллуса - начальный этап формирования в каллусе особой поверхностной меристематической зоны, с деятельностью клеток которой связывают процессы органогенеза и эмбриоидогенеза [9].

Цито-гистологический анализ показал, что такая зона обнаруживалась в каллусах на 35-е сут культивирования in vitro (рис. 4). Клетки поверхностной меристематической зоны имели более мелкие размеры и интенсивную окраску по сравнению с клетками каллуса, лежащими глубже, которые, в свою очередь увеличивались в размерах, вакуолизирова-лись и приобретали характеристики парехимантоз-ных клеток.

ДГЗ

1588

Рис. 4. Каллус со сформированной поверхностной меристематической зоной. Световая микроскопия, постоянные препараты. Условные обозначения: ПКК - паренхиматозные клетки каллуса, ПМЗ - поверхностная мери-стематическая зона

После пяти недель культивирования возникала необходимость переноса каллусов на среду для регенерации или субкультивирования. В процессе дальнейшего культивирования появились морфо-генные структуры, сходные с эмбриоидами. Более подробный анализ проводится в настоящее время.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что листовые экспланты В. daigremontianum способны к каллусогенезу в условиях in vitro.

Впервые был проведен цито-гистологический анализ развития каллусов В. daigremontianum. Установлено, что каллусы В. daigremontianum являются дериватами клеток камбия проводящих пучков листовых эксплантов. Цито-гистологический статус таких каллусов позволил охарактеризовать их как морфогенетически компетентные и способные к дальнейшему морфогенезу в условиях культуры in vitro. Это, в свою очередь, позволяет использовать каллусы в качестве модельной системы для изучения процессов развития и воспроизведения у В. daigremontiam ип.

Работа выполнена при частичной поддержке

Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 11-04-97039, № 13-04-01873 и № 13-04-01404).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Батыгина Т.Е. Эмбриоидогения // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 2: Семя / [под ред. Т.Б. Батыгиной]. СПб.: Мир и семья,, 1997. С. 628-634.

2. Батыгина Т.Б. Воспроизведение, размножение и возобновление // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 3: Системы репродукции / Под ред. Т.Б. Батыгиной. СПб.: Мир и семья, 2000. С. 35-39.

3. Носов А.М. Культура клеток высших растений -уникальная система, модель, инструмент // Физиология растений. 1999. Т. 46. № 6. С. 837-844.

4. Круглова H.H. Каллус как модель для изучения формирования структуры высшего растения // Известия Уфимского НЦ РАН. 2011. № 2. С. 32-35.

5. Абралюв, С.Н. Анализ дифференциации клеток при вивипарии у Bryophyllum daigremontianum (Berger) /

Рис. 3. Цито-гистологические особенности сформированного каллуса В. daigremontianum: а - поперечный срез компактного каллуса, 21-е сут культивирования in vitro: б - дегенерация поверхностных клеток каллуса, 28-е сут культивирования in vitro. Световая микроскопия, постоянные препараты. Условные обозначения: ДНК - дегенерирующие поверхностные клетки, КК - каллусные клетки

1589

Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2013. Т. 15, № 3 (5)

С.Н. Абрамов, А.В. Бакирова, В.Ю. Горбунова, ГА. Геращенков, Б.Н. Постригань // Материалы Международной научно-практической конференции «Роль классических университетов в формировании инновационной среды регионов». Уфа, 2009. С. 74.

6. Murashige, Т. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures / T. Murashige, F. Skoog //Physiol. Plant. 1962. V. 15. N 3. P. 473-497.

7. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Колос, 1988. 170 с.

8. Wilkins, М.В. The occurrence of an endogenous circadian rhythm in a plant tissue culture / M.B. Wilkins, A.W. Holowinsky //Plant Physiology. 1965. V. 40. N 5. P. 907909.

9. Батыгина, Т.Е. От микроспоры - к сорту / Т.Б. Батыгина, Н.Н. Круглова, В.Ю. Горбунова, Г.Е. Титова, О.А. Сельдимирова. М.: Наука, 2010. 174 с.

CYTO-HISTOLOGICAL CHARACTERISTICS OF CALLUSOGENESIS IN VITRO

IN BRYOPHYLLUM DAIGREMONTIANUM

©2013 A.V. Gilmaeva1, S.N. Abramov1, V.Yu. Gorbunova1, G.A. Gerashchenkov2, N.A. Rozhnova2

Bashkir State Pedagogical University named after M. Akmullah, Ufa institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Sci. Center of RAS, Ufa

This paper discusses the cyto-histological analysis results of origin and development of calli, obtained by culturing in vitro of Bryophyllum daigremontianum leaf explants.

Keywords: Btyophyllum daigremontianum, callusogenesis, morphogenesis, IA4, B*4P.

Alina Gilmaeva, student, e-mail: abramov-67(S)mail.ru; Sergey Abramov, Candidate of Biology, assistant professor, e-mail: ab-ramov-67(S!mail.ru; Valentino Gorbunova, Doctor of Biology, professor, e-mail: obg-bspu(S)mail.ru; Grigoty Gerashchenkov, Candidate of Biology, senior researcher, e-mail: apomix-is(S)anrb.ra; Natalia Rozhnova, Candidate of Biology, researcher, e-mail: apomixis(S)anrb.ru

1590