CC BY
17Cows' high productivity, longevity and health are one of the main targets of livestock specialists. The higher cow's productivity the more its organism tension, therefore more accurate feeding is required. Firstly, animals have vitamin and mineral deficiency. During the studies conducted on a dairy farm in LLC Niva in Oktyabrsky district of Saransk, the following has been revealed: inclusion in cows' rations the premix "TRAU" in the amount of 150 g. per head per day (in the second group) in dry and fresh periods had a positive effect on the biochemical parameters of blood, with a simultaneous increase in milk yield during milking. Due to the premix, the total protein content in the cows' blood in the dry period increased by 3.65.8% and this advantage was remaining until the 60th day of lactation. A significant increase in the content of reserve alkalinity by the third month of lactation was also noted.
Keywords: cows, feeding, premix, blood, biochemical parameters.
References
1. Kuznetsov, S. G. Mineral supplements and vitamins for animals / S.G. Kuznetsov // Achievements of science and technology of Agro-industrial complex. - 1999. - No. 5. - P. 34-35.
2. Norms and rations for farm animals feeding. Reference manual / Ed. A.P. Kalashnikova, V.I. Fisinina, V.V. Shcheglova, N.I. Kleimenova. - Moscow, 2003. -456 p.
3. Organization of evidence-based feeding of highly productive livestock: practical recommendations. Borovsk. 2008.43 p.
4. Podobed, L.I. Why are premixes not always effective? / L.I. Podobed // Zootechnics. - 2002. No. 4. -PP. 11-13.
5. Safonov, V.A. Changes in blood biochemical parameters in highly productive cows in the second half of pregnancy and in the postpartum period / V.A. Safonov, A.G. Nezhdanov, M.I. Retsky, V.I. Shushlebin // Bulletin of the Russian Academy of Agricultural Sciences. - 2008. - No.3. - P. 74-76.
6. Physiological nutritional needs and rationing of dairy cows: a reference guide. Borovsk, 2000. - 134 p.
7. Yudin, M.F. The physiological state of cows' body in different seasons of the year / M.F. Yudin // Veterinary Medicine. - 2001. - No. 2 - P. 38-41.
УДК 63.636.7.045 DOI 10.33632/1998-698Х.2020-2-64-73
ЦИРКУЛЯЦИОННАЯ ГЕПАТОЦИТНАЯ ПРОИЗВОДНАЯ микроРНК КАК ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ БИОМАРКЕР ЖЕЛЧНОКАМЕННОЙ БОЛЕЗНИ У СОБАК
Эль-Себаей А. М. - аспирант, Абрамов П.Н. - кандидат ветеринарных наук, доцент
ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина» (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д.23; e-mail: dr.sebaey@yahoo.com)
Гиперлипидемия является одним из основных факторов риска развития стеатоза и фиброза печени, а также гипомобилизации желчного пузыря и образования холестериновых желчных камней, которые, если их не диагностировать на ранней стадии, могут являться факторами риска для жизни. Целью данного исследования было оценить возможное использование полученных из гепатоцитов cfa-микроРНК сыворотки (122, 34a и 21) в качестве раннего информативного и прогностического биомаркера желчнокаменной болезни (ЖКБ)у собак. При проведении исследований у всех больных животных диагностировали ЖКБ связанную со стеатозом и / или фиброзом, на основании результатов ультразвуковых и гистопатологических исследований. Биохимический анализ выявил значительное повышение аланинаминотрансферазы (ЛЛТ, P<0,05), аспартатаминотрансферазы (ACT, P<0,05), щелочной фосфатазы (ЩФ, P <0,001), гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ, P<0,001), а также концентрации в сыворотке общего холестерина (P<0,001) и триглицеридов (P<0,001) у собак с ЖКБ и стеатозом печени (ЖКБ + С) или фиброзом (ЖКБ+ Ф) по отношению к контрольной группе. Полученные из гепатоцитов cfa-miR-122 и 34a были значительно экспрессированы в сыворотке крови собак в группах ЖКБ + С (P<0,001) и ЖКБ + Ф
(Р<0,01) по сравнению с контролем, тогда как cfa-miR-21 регулировался только в сыворотке крови собак в группе ЖКБ + Ф по отношению к ЖКБ + С (Р <0,01) и контрольной группе (Р <0,001). Результаты исследования показали, что полученные из гепатоцитов cfa-микроРНК в сыворотке (122, 34а и 21) обычно связаны молекулярным путем с гиперлипидемией и могут рассматриваться как ранний информативный и прогностический биомаркер печеночного стеатоза и / или фиброза, ассоциируемого или приводящего к ЖКБ у собак.
Ключевые слова: гиперлипидемия, стеатоз печени, фиброз печени, ЖКБ у собак, УЗИ, гистология, cfa-микроРНК.
Желчекаменная болезнь (ЖКБ) - это патологическое состояние, при котором в желчном пузыре обнаруживаются камни, в основном состоящие из холестерина, билируби-ната кальция и билирубина [16]. Большинство случаев ЖКБ у собак протекают бессимптомно. Поэтому если не проведена ранняя диагностика, то может возникнуть обструкция внепеченочных желчных путей из-за миграции одного или нескольких микролитов холестерина в общий желчный проток. Также это может привести к холециститу и острому панкреатиту [17, 23]. Этиопатогенез ЖКБ у собак до сих пор неизвестен и, вероятно, является многофакторным [20]. Таким образом, образование желчных конкрементов не может быть заранее предсказано для принятия профилактических мер, поэтому, как только они обнаружены во время диагностических исследований, рекомендуется профилактическая холецистэк-томия, чтобы избежать осложнений и смертности [28]. Одна из гипотез заключается в том, что гиперлипидемия (гиперхолестеринемия и гипертриглицеридемия) будет способствовать накоплению холестерина в печени, повреждению гепатоцитов и фиброзному ответу на поражение печени у животных, что может снизить чувствительность желчного пузыря к хо-лецистокинину, перенасыщению желчи печеночным холестерином и развитию твердых пластинчатых кристаллов моногидрата [6,15,1,24,13].
К сожалению, современные биохимические тесты на заболевания печени результативны, но не достоверны на ранней стадии стеатоза печени, или при прогнозировании ЖКБ. Они информативны, когда болезнь прогрессирует [5,11,22]. С другой стороны, обычное ультразвуковое исследование не является чувствительным методом, если 30% или менее паренхимы печени подвержена стеатозу [26,8]. Таким образом, биопсия печени является золотым стандартом для диагностики стеатоза печени, ведущего к ЖКБ, но несмотря на это, не
может использоваться регулярно, поскольку это инвазивный диагностический инструмент, приводящий к серьезным осложнениям [27]. Идентификация неинвазивных сывороточных биомаркеров, отражающих молекулярные механизмы, участвующие в развитии гиперлипи-демии и стеатоза, может сыграть ключевую роль в раннем прогнозировании, диагностике и даже профилактике холестериновых желчных камней.
Исследование микроРНК (короткие некодирующие РНК длиной 22 нуклеотида) было введено в качестве неинвазивного диагностического биомаркера из-за их секреции почти во все жидкости организма и наличия значительного соответствия между их уровнями в сыворотке и тканях при различных болезненных состояниях, таких как ожирение печени, фиброз печени и цирроз [25,10]. Хорошо известно, что miR-122 как одна из наиболее распространенных микроРНК в гепа-тоцитах (приблизительно 70% всех печеночных микроРНК) в сочетании с другими формами микроРНК, такими как miR-34a и miR-21, как известно, играет решающую роль в регуляция экспрессии гена после транскрипции, которая связанна с нарушением метаболизма липидов и холестерина в гепатоцитах [11,10].
Целью нашего исследования являлась оценка возможного использования полученных из гепатоцитов cfa-микроРНК сыворотки (122, 34a и 21) в качестве раннего информативного и прогностического биомаркера для диагностики стеатоза и / или фиброза печени, связанных с ЖКБ или приводящих к ней.
Материал и методы. Исследования проводили на чистопородных собаках (n-45) разной массы и возраста в Инновационном ветеринарном центре (ИВЦ), Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА. У тридцати собак, принадлежащих частным владельцам, при ультразвуковом исследовании (Mindray DC-8 Expert®, преобразователь 6,5-8 МГц, Китай),
были обнаружены камни в желчном пузыре, сопровождаемые диффузной гиперэхогенно-стью печени. Ультразвуковое исследование проводили в качестве быстрого неинвазивного метода для скрининга наличия или отсутствия камней в желчном пузыре и дифференцирования их от полипов желчного пузыря путем оценки гравитационной подвижности камней. На основании проведенного УЗИ (рис. 1), а также гистопатологических данных, животные были разделены на две группы ЖКБ + С и ЖКБ + Ф по 15 животных в каждой. Для сравнения, 15 клинически здоровых собак являлись контролем.
Сбор и обработка образцов Кровь брали в пробирку (Vacuette®GreinerBio-OneGmbH) от всех животных контрольной и опытных групп. После взятия её оставили в холодильнике на 15 минут для максимального отведения сгустка. Сыворотку получали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут при 20 °С на центрифуге CM-6 MSky Line (ELMI®, Латвия).
Отделенная сыворотка была распределена на два образца, первый из которых был направлен на биохимическое исследование, а второй был сохранен при -80oC для анализа микроРНК. Кроме того, во время профилактической холецистэктомии от каждой собаки брали образцы печени при биопсии. Кроме того, у животных контрольной группы проводили биопсию печени под контролем УЗИ с использованием основной иглы (springcut®, Sterylab, Италия). Полученные образцы фиксировали в 10% формалине до ги-стопатологического исследования.
Анализ биохимических показателей сыворотки. Активность AЛT, ACT, ЩФ, ГГГ, амилазы и липазы в сыворотке, а также концентрацию общего белка (О. Белок), альбумина, общего билирубина (О. Билирубин), общего холестерина, триглицеридов, креатинина и глюкозы оценивали с использованием Cata-lystNSAID 6 Clip®and CatalystChem 17Clip®(IDEXX Laboratories®, США).
Гистопатологические исследования. Из полученных образцов печени готовили срезы толщиной 4 мкм которые окрашивали гематоксилином и эозином (Г&Э) (Кат. № RRSK26; AtomScientific ®, Великобритания) для гистологического исследования [7]. Волокна соединительной ткани (коллаген типа I и III) в печени определяли по Picrosiriusred (Кат. № KT037; Diagnostic BioSystems®, Нидер-
ланды) [3]. Гистопатологическую оценку проводили с помощью микроскопа Микмед-5® ("LOMO", Россия) [4].
Выделение РНК. Общую РНК, включая микроРНК, выделяли из каждого образца с использованием реагента для лизиса (QI-Azol®) в составе набора для сыворотки / плазмы miRNeasy (Кат. № 217184 Qiagen®, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. После этого, вариация от образца к образцу была нормализована во время процедуры выделения путем добавления 3,5 мкл синтетического Caenorhabditis elegans микроРНК-39 (cel-miR-39, Кат. № 219610, Qiagen®, Германия) в качестве контроля выброса к каждому денатурированному образцу сыворотки в 1,6 х 108 копий / мкл рабочего раствора [21].
Концентрацию и чистоту выделенных образцов РНК определяли путем измерения их оптической плотности при 260 нм и 280 нм с помощью Nanophotometer® (NP80, Германия) и соотношений РНК (A260: A280), равных и / или более чем в 1.6 [18].
Обратная транскрипция и количественное определение микроРНК с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР). Выделенные образцы РНК подвергали обратной транскрипции с использованием набора miScriptIIRT (Кат. № 218160, Qiagen®, Германия) для получения комплементарной ДНК в соответствии с инструкциями производителя. ОТ-ПЦР проводили в системе обнаружения ПЦР в реальном времени CFX-96® (Bio-Rad, США) для определения относительной экспрессии выбранных микроРНК и экзогенного cel-miR-39 с использованием набора miScriptSYBRGreen ПЦР (Кат. № 218073 Qiagen®, Германия), как описано в справочнике miScript-ПЦР-System-справочник. Специфичные прямые праймеры для представляющих интерес cfa-микроРНК были разработаны Евроген Компани (Москва, Россия). Условия реакции амплификации ПЦР были следующими: 1 цикл в течение 15 минут начальной денатурации при 95 °С и 45 циклов 3-этапной ПЦР, включая 15 секунд денатурации при 94 °С, фазу отжига при 55 °С в течение 30 секунд, и фазу удлинения в течение 30 секунд при 70 °C. Все анализы проведены в трех повторностях для каждого образца, и средний порог цикла (СТ) каждой эндогенной cfa-микроРНК был оценен и нормализован относительно экзогенного синтетического кон-
троля (cel-miR-39), который добавляли во время выделения РНК, и все данные были относительно выражены как кратное изменение по сравнению с контролями с использованием сравнительного метода CT (метод 2"AACt) [19].
Статистический анализ. Полученные данные были статистически обработаны с использованием SPSS версии 20,0 (IBM Corp., Нью-Йорк, США). Расчетные непрерывные переменные включали: возраст, живую массу, биохимические показатели, уровень экспрессии cfa-микроРНК в сыворотке. Категориальная переменная включала породу и пол. Тест Шапиро-Уилка использовали для определения нормального распределения непрерывных переменных. Все они были нормально распределены (p> 0,05), кроме уровней экспрессии cfa-микроРНК (p< 0,05). Следовательно, среднее ± стандартное отклонение (SD) использовали для выявления нормально распределенных переменных, в то время как значимые различия между группами оценивали путем применения
одностороннего ANOVA с последующим тестированием и коррекцией Бонферрони [14]. Кроме того, медиана и диапазон были использованы для описания уровней экспрессии микроРНК, а достоверные различия между группами оценивали с помощью теста Крускала-Уоллиса с последующим тестированием и коррекцией Бонферрони. Для всех результатов уровень значимости составлял Р <0,05.
Результаты исследований. Анализ таблицы 1 показал, что в обеих группах ЖКБ была в основном диагностирована у мелких пород самок собак, таких как Миниатюрная такса, Цвергшнауцер и Чихуахуа, и включала в себя неспецифические клинические признаки (прерывистая рвота, летаргия, анорексия, по-лиурия). Средний возраст животных опытных групп был выше(Р<0,001), по сравнению с животными контрольной группы.
По массе тела между группами нами достоверных отличий обнаружено не было (Р> 0,05).
Таблица 1 - Породные, возрастные данные и пол, показатели массы тела у опытных и
контрольной групп животных
Переменные Группы, ( n = 15)
Контроль ЖКБ + С ЖКБ + Ф
Порода (№)
Цвергшнауцер (3) (4) (5)
Гончая (1) (2) (0)
Русский тойтерьер (3) (1) (1)
Чихуахуа (5) (3) (4)
Миниатюрная такса (3) (5) (5)
Пол (№) Самка (7), Самец (8) Самка (12), Самец (3) Самка (13), Самец (2)
Возраст (лет), Среднее ± SD 5,60±1,44 8,02±1,08*** 8,70±1,35***
Масса тела (КГ), Среднее ± SD 5,60±1,37 6,17±1,42\ 6,88±1,39
(* P<.05, ** P< 01, *** P<001)между группами
Из данных таблицы 2 очевидно, что сывороточная активность AЛT (P<0,05), ACT (P<0,05) ЩФ (P<0,001) и ГГГ (P<0,001), а также концентрация общего холестрола (Р <0,001) и триглицеридов (Р<0,001) в сыворотке крови были значительно повышены у собак группы ЖКБ + С и ЖКБ + Ф по сравнению с контрольной группой, в то время как
при анализе всех остальных показателей (О. Белок, альбумина, О. Билирубин, глюкоза, креатинин, липаза и амилаза) значимых различий нами выявлено не было (Р> 0,05).
При проведении гистологического исследования нами не отмечены патологические изменения в структуре печени у контрольной группы животных.
Таблица 2 - Биохимические показатели крови животных контрольной и опытных групп
Groups
Переменные Контроль ЖКБ + С ЖКБ + Ф
AЛT (ед/л) 41,12 ± 3,87 47,62 ± 4,36* 47,20 ± 4,26*
ACT (ед/л) 33,36 ± 2,58 37,24 ± 4,69* 38,65± 3,30*
ЩФ (ед/л) 72,40 ± 4,12 102,08 ± 13,24*** 115,14 ±7,20***
ГГГ (ед/л) 6,91 ± 0,57 8,31 ± 1,14*** 8,54 ± 0,82***
О. Белок (г/дл) 5,95 ± 0,45 5,81 ± 0,69 5,54 ± 0,67
Альбумин (г/дл) 2,84 ± 0,41 2,76 ± 0,29 2,69 ± 0,44
О. Билирубин (мкмоль/л) 4,24 ± 0,64 4,41 ±0,57 4,36 ± 0,54
Холестерин (мкмоль/л) 5,12 ± 0,75 9,61 ± 1,19*** 9,34 ± 1,25***
Триглицериды (мкмоль/л) 0,83± 0,21 2,53 ± 0,43*** 2,24 ± 0,24***
Глюкоза (мг/дл) 4,36 ± 0,71 4,61 ± 0,42 4,55 ± 0,48
Креатинин (мкмоль/л) 44,76 ± 6,32 42,83 ± 5,69 45,24 ± 6,22
Липазы (ед/л) 125,36 ± 13,51 124,00 ± 10,21 126,14 ± 9,75
Амилаза (ед/л) 167,65 ± 15,13 172,52 ± 21,42 173,89 ± 19,53
(* P<.05, ** P< 01, *** P<.001). между группами
Скопление жира в гепатоцитах мы ную ткань (коллаген типа I и III) у собак
отметили в группе ЖКБ + С, которое группы ЖКБ + Ф (рис. 2).
прогрессировало в волокнистую соединитель-
А i' г ■ .■ г : ■ »•: .' . ■ . >:• ■•■.■■. . . .■ . .•• с. У .J «••••..;. . • ■ _ ■. ■ >:.г'1 ■-• ■ ' ' . ■■?:1 ..'-•":•' <:•• л; v. V .-?; ■'••': у ¿Ы .'' ' •"■ "■■ . • ••• • - ' ■к :-• ■ V** ' . - - . . ■ - .• . - - .- - * . ■ . •. « „ - - -. « : - - ■ ■ • \ - v Ч- . ■ • - - - -. ■BKaSL . — *
. - V ' ':•* Ч ■ . ' "".'■ ' ¿¿ '. 'täii v; •' . ..;■.■ V^-iy'::.^ :*. s - -.* ч ■ .«V-.^'1 . * у, ■ . .. - '„¿г'*...
Рисунок 2 - Репрезентативная гистопатология у собак с ЖКБ + С и ЖКБ + Ф, а также у животных контрольной группы. Окраска гематоксилин и эозин. Не измененная паренхима печени (А). Микровезикулярный и макровезикулярный стеатоз у собак группы ЖКБ + С (Б). Прогрессирование стеатоза печени в фиброзную ткань (В). Красные коллагеновые волокна (типы I и III) в паренхиме печени (Г) у собак группы ЖКБ + Ф.
Сfa-miR-122 и cfa-miR-34a, получен- делах ЖКБ + С (изменение средней складки =
ные из гепатоцитов, были значительно экс- 6,43 и 4,16 соответственно, P<0,001) и группы
прессированы в сыворотке крови собак в пре- ЖКБ + Ф (изменение средней складки= 3,97 и
2,64 соответственно, P<0,01) по сравнению с контролем. Полученный из гепатоцитов cfa-miR-21 был только повышен в сыворотке крови собак в группе ЖКБ + Ф (изменение средней складки = 5,80) по отношению к животным группы ЖКБ + С (Р <0,01) и контрольной группы (Р < 0,001).
Заключение. Проведенные исследования позволили заключить, что гиперлипиде-мия является основной причиной стеатоза пе-
чени, которая может способствовать образованию желчных камней или развитию фиброза. Исследование микроРНК (cfa-miR-122, cfa-miR-34a, cfa-miR-21) играет роль в изучении липидного обмена. Потенциально этот показатель выражен у собак с ЖКБ, связанной со стеатозом печени или фиброзом, и может в будущем служить новым неинвазивным диагностическим биомаркером для ранней диагностики ЖКБ и гепатопатий в целом.
Литература
1. Бартош, Л.Ф. Новые подходы к диагностике и лечениюгиперкинетических дискинезий желчного пузыря в сочетании с хроническим некалькулезным холециститом / Л.Ф. Бартош, И.В. Балакина, Л.М. Гриднева // Клиническая медицина. - 2004. - № 9. - С. 57- 59.
2. Гуцол, Л. О. Роль микроРНК в регуляция метаболизма холестерина / Л. О. Гуцол, Е. Ю. Коршунова, С. Ф. Непомнящих // Современные проблемы науки и образования. - 2019. - № 4. - C. 144-154.
3. Иванченкова, Р.А. Инновации в диагностике и лечении желчнокаменной болезни / Р.А. Иванченкова, А.В. Егоров, А.Е. Леонович, Е.Р. Атькова // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2012. - № 4. - С.66-73.
4. Мараховский, Ю.Х. Желчнокаменная болезнь: современное состояние проблемы / Ю.Х. Мараховский // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - 2003. - № 1. - С. 81-92.
5. Arguello, G. Recentinsightsontheroleofcholesterolinnon-alcoholicfattyliverdisease / G. Arguello, E. Balboa, M. Arrese, S. Zanlungo // Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. - 2015. -№. 1852 (9). - P.1765-1778.
6. Constantine, V.S. A combined tissue stain for the selective staining of collagen, elastic fibers and acidic carbohydrates / V. S. Constantine // J. Invest. Dermatol. - 1969. - №. 52. - P.353-356.
7. Cullen, J. M. Morphological classification of circulatory disorders of the canine and feline liver / J.M. Cullen et al. - In WSAVA standards for clinical and histological diagnosis of canine and feline liver disease, Philadelphia, PA Saunders Elsevier, Edinburgh, UK, 2006. - 41-59 p.
8. Das К. Non-Alcoholic Steatohepatitis / KDas, P. Kar // J Assoc Physicians India. - 2005. - №. 53 - P.195-199.
9. Di Ciaula, A. Current views on genetics and epigenetics of cholesterol gallstone disease / A. Di Ciaula, D. Q. H.Wang, L. Bonfrate, P. Portincasa // Cholesterol. - 2013. - №. 2013. - P. 1-10.
10. Feldman, A.T. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining / A.T. Feldman, D. Wolfe // Methods. Mol. Biol. - 2014. - №.1180. - P. 31-43.
11. Ferreira, D.M. Revisiting the metabolic syndrome and paving the way for microRNAs in nonalcoholic fatty liver disease / D.M. Ferreira, A.L. Simao, C.M. Rodrigues, R.E. Castro // FEBS J. - 2014. -№. 281. - P. 2503-2524.
12. Florescu, L.M. CT and MRI findings in biliary tract obstruction / L. M. Florescu, A.M. Lapadat, S. Bondari, I. Gheonea // European Congress of Radiology. - 2018. - №. 618. - P. 1-43.
13. Iravani, F. Role of MicroRNAs in Pathophysiology of Non-alcoholic Fatty Liver Disease and Non-alcoholic Steatohepatitis / F. Iravani, N. Hosseini, M. Mojarrad // Middle East journal of digestive diseases.-2018. - №. 10 (4). - P. 213.
14. Kakimoto, T. Effect of a high-fat-high-cholesterol diet on gallbladder bile acid composition and gallbladder motility in dogs / T. Kakimoto, H. Kanemoto, K. Fukushima, K. Ohno, H. Tsujimoto // American journal of veterinary research. - 2017. - №. 78 (12). - P. 1406-1413.
15. Kirkwood, B.R. Essential medical statistics / B.R. Kirkwood, J. Sterne. 2-nd ed. - Maiden, MA: Blackwell, 2003.
16. Kutsunai, M. The association between gall bladder mucoceles and hyperlipidaemia in dogs: a retrospective case control study / M. Kutsunai, H. Kanemoto, K. Fukushima, Y. Fujino, K. Ohno, H. Tsujimoto // The Veterinary Journal. - 2014. - №. 199 (1). - P.76-79.
17. Larson, M.M. Ultrasound imaging of the hepatobiliary system and pancreas / M.M. Larson // Veterinary Clinics: Small Animal Practice. - 2016. - №. 46 (3). - P.453-480.
18. Lee, S. Associations between serum leptin levels, hyperlipidemia, and cholelithiasis in dogs / S. Lee, O. K. Kweon, W. H. Kim // PloS one. - 2017. - №. 12 (10). - e0187315.
19. Lin, M.S. Aberrant expression of microRNAs in serum may identify individuals with pancreatic cancer / M.S. Lin, W.C. Chen, J.X. Huang, H.J. Gao, H.H. Sheng // Int. J. Clin. Exp. Med. - 2014. - №. 7. -P. 5226-5234.
20. Livak, K.J. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-AACT method / K. J. Livak, T. D. Schmittgen // Methods. - 2001. - №. 25. - P. 402-408.
21. Mitchell, P.S. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection / P.S. Mitchell, R.K. Parkin, E M. Kroh, B. R. Fritz, S.K. Wyman, E.L. Pogosova, D.W. Lin // P NAS. - 2008. - №. 105.- P. 10513-10518.
22. Mofrad, P. Clinical and histologic spectrum of nonalcoholic fatty liver disease associated with normal ALT values / P. Mofrad, M.J. Contos, M. Haque, C. Sargeant, R.A. Fisher, V. A. Luketic, A. J. Sanyal // Hepatology. - 2003. - №. 37 (6). - P. 1286-1292.
23. Pike, F.S. Gallbladder mucocele in dogs: 30 cases (2000-2002) / F.S. Pike, J. Berg, N.W. King, D. G. Penninck, C.R. Webster // Journal of the American Veterinary Medical Association. - 2004. - №.224 (10). - P. 1615-1622.
24. Sara?, S. Leptin levels and lipoprotein profiles in patients with cholelithiasis / S. Sara?, A. Atamer, Y. Atamer, A.S. Can, A. Bilici, I. Ta?yildiz, N. Yenice // Journal of International Medical Research.
- 2015. - №.43 (3). - P. 385-392.
25. Schueller, F. The role of miRNAs in the pathophysiology of liver diseases and toxicity / F. Schueller, S. Roy, M. Vucur, C.Trautwein, T. Luedde, C. Roderburg // International journal of molecular sciences.-2018. - № 19 (1). - P. 261.
26. Spengler, E.K. Recommendations for diagnosis, referral for liver biopsy and treatment of nonalcoholic fatty liver disease and non-alcoholic steatohepatitis / E.K. Spengler, R. Loomba // Mayo Clin Proc.
- 2015. - № 90. - P. 1233-1246.
27. Thampanitchawong, P. Liver biopsy: complications and risk factors / P. Thampanitchawong, T. Piratvisuth // World journal of gastroenterology. - 1999. - № 5 (4). - P. 301.
28.Youn, G. Outcome of elective cholecystectomy for the treatment of gallbladder disease in dogs / G. Youn, M. J. Waschak, K. A. Kunkel, P. D. Gerard // Journal of the American Veterinary Medical Association. - 2018. - №. 252 (8). - P. 970-975.
CIRCULATING HEPATOCYTE DERIVED MICRORNA AS A DIAGNOSTIC BIOMARKER OF
GALLSTONE DISEASEIN DOGS
El-Sebaey A.M. - Postgraduate student, Abramov P.N. - Candidate of Veterinary Science, Associate Professor
FSBEI of HE "Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology - MVA named after K.I. Scryabin " (109472, Moscow, Akademika Skryabin St., 23; e-mail: dr.sebaey@yahoo.com)
Hyperlipidemia is one of the major risk factors of hepatic steatosis and/or fibrosis together with a gallbladder hypomotility and cholesterol gallstone formation which if not diagnosed early would be life threatening. The aim of this study was to assess the possible use of hepatocyte derived serum cfa-miRNAs (122, 34a and 21) as an early informative and predictive biomarker of cholelithiasis in dogs.Fifteen healthy dogs were enrolled in the study together with thirty client-owned dogs that confirmed to have cholelithiasis associated with hepatic fatty changes and/or fibrosis based on ultrasonographic and histopathologicalfindings.Biochemical analysis revealed the significant elevation ofalanine aminotransferase (ALT, P <0.05), aspartate aminotransferase (AST, P< 0.05), alkaline phosphatase (ALP, P <0.001), gamma glutamyltransferase (GGT, P <0.001) as well as the serum concentrations of total cholesterol (P <0.001) and triglyceride (P <0.001) in dogs of cholelithiasis and hepatic steatosis (GS+HL) or fibrosis (GS+HF) with respect to the control group.Hepatocyte derived cfa-miR-122 and 34a were significantly expressed in serum of dogs within GS+HL (P <0.001) and GS+HF groups (P <0.01) compared to control whereas cfa-miR-21 was only up regulated in serum of dogs within GS+HFgroup with respect to GS+HL (P <0.01) and control group(P <0.001). These results indicate that hepatocyte derived serum cfa-miRNAs (122, 34a and 21) usually related to the molecular pathway of hyperlipidemia and may be consider as an early informative and predictive biomarker of hepatic steatosis and/or fibrosis associated with or leaden to canine cholelithiasis.
Keywords: Hyperlipidemia, hepatic steatosis, hepatic fibrosis, canine cholelithiasis, ultrasonography, histopathology, cfa-miRNAs.
References
1. Bartosh, L.F. New approaches to the diagnosis and treatment of hyperkinetic gallbladder dyskinesia in combination with chronic non-calculouscholecystitis / L.F. Bartosh, I.V. Balakina, L.M. Gridneva // Clinical Medicine. - 2004. - No.9. - P. 57-59.
2. Gutsol, L.O. Role of the microRNAs in the regulation of cholesterol metabolism / L.O. Gutsol, E. Yu. Korshunova, S.F. Nepomnyashchikh // Modern problems of science and education. - 2019. - No. 4. - P. 144-154.
3. Ivanchenkova, R.A. Innovation in the diagnosis and treatment of gallstone disease / R.A. Ivanchenkova, A.V. Egorov, A.E. Leonovich, E.R. Atkova // Experimental and Clinical Gastroenterology.-2012.- No.4 .- P. 66-73.
4. Marakhovsky, Yu.Kh. Gallstone disease: the current state of the problem / Yu.Kh. Marakhovsky // Russian Journal of Gastroenterology, Hepatology and Coloproctology. - 2003. - No.1. - P. 81 -92.
5. Arguello, G. Recent insights on the role of cholesterol in non-alcoholic fatty liver disease / G. Arguello, E. Balboa, M. Arrese, S. Zanlungo // Biochimica et BiophysicaActa-Molecular Basis of Disease.-2015. - No.1852 (9). - P. 1765-1778.
6. Constantine, V.S. A combined tissue stain for the selective staining of collagen, elastic fibers and acidic carbohydrates / V. S. Constantine // J. Invest. Dermatol. - 1969. - No.52. - P. 353-356.
7. Cullen, J.M. Morphological classification of circulatory disorders of the canine and feline liver/ J.M. Cullen et al. - In WSAVA standards for clinical and histological diagnosis of canine and feline liver disease, Philadelphia, PA Saunders Elsevier, Edinburgh, UK, 2006. - 41-59 p.
8. Das K. Non-Alcoholic Steatohepatitis / K. Das, P. Kar // J Assoc Physicians India. - 2005. - No. 53 - P. 195-199.
9. Di Ciaula, A. Current views on genetics and epigenetics of cholesterol gallstone disease / A. Di Ciaula, D. Q. H.Wang, L. Bonfrate, P. Portincasa // Cholesterol. - 2013.- No. 2013. - P. 1-10.
10. Feldman, A.T. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining / A.T. Feldman, D.Wolfe // Methods. Mol. Biol. - 2014. - No. 1180. - P.31-43.
11. Ferreira, D.M. Revisiting the metabolic syndrome and paving the way for microRNAs in nonalcoholic fatty liver disease / D.M. Ferreira, A.L. Simao, C.M. Rodrigues, R.E. Castro // FEBS J. - 2014. -No.281. - P. 2503-2524.
12. Florescu, L.M. CT and MRI findings in biliary tract obstruction / L.M. Florescu, A.M. Lapadat, S. Bondari, I. Gheonea // European Congress of Radiology. - 2018. - No. 618. - P. 1-43.
13. Iravani, F. Role of MicroRNAs in Pathophysiology of Non-alcoholic Fatty Liver Disease and Non-alcoholic Steatohepatitis / F. Iravani, N. Hosseini, M. Mojarrad // Middle East journal of digestive diseases.-2018. - No. 10 (4). - P. 213.
14. Kakimoto, T. Effect of a high-fat-high-cholesterol diet on gallbladder bile acid composition and gallbladder motility in dogs / T. Kakimoto, H. Kanemoto, K. Fukushima, K. Ohno, H. Tsujimoto // American journal of veterinary research. - 2017. - No. 78 (12). - P. 1406-1413.
15. Kirkwood, B.R. Essential medical statistics / B.R. Kirkwood, J. Sterne. 2-nd ed.- Malden, MA: Blackwell, 2003.
16. Kutsunai, M. The association between gall bladder mucoceles and hyperlipidaemia in dogs: a retrospective case control study / M. Kutsunai, H. Kanemoto, K. Fukushima, Y. Fujino, K. Ohno, H. Tsujimoto // The Veterinary Journal. - 2014. - No. 199 (1). - P. 76-79.
17. Larson, M.M. Ultrasound imaging of the hepatobiliary system and pancreas / M.M. Larson // Veterinary Clinics: Small Animal Practice. - 2016. - No. 46 (3). - P. 453-480.
18. Lee, S. Associations between serum leptin levels, hyperlipidemia, and cholelithiasis in dogs / S. Lee, O. K. Kweon, W. H. Kim // PloS one. - 2017. - No. 12 (10). - e0187315.
19. Lin, M.S. Aberrant expression of microRNAs in serum may identify individuals with pancreatic cancer / M.S. Lin, W. C. Chen, J. X. Huang, H. J. Gao, H. H. Sheng // Int. J. Clin. Exp. Med. - 2014. - No.7. - P. 5226-5234.
20. Livak, K.J. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-AACT method / K. J. Livak, T. D. Schmittgen // Methods. - 2001. - No. 25. - P. 402-408.
21. Mitchell, P.S. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection / P.S. Mitchell, R.K. Parkin, E M. Kroh, B.R. Fritz, S.K. Wyman, E.L. Pogosova, D.W. Lin // P NAS. - 2008. - No. 105.- P.10513-10518.
22. Mofrad, P. Clinical and histologic spectrum of nonalcoholic fatty liver disease associated with normal ALT values / P. Mofrad, M.J. Contos, M. Haque, C. Sargeant, R.A. Fisher, V. A. Luketic, A. J. Sanyal // Hepatology. - 2003. - No. 37 (6). - P. 1286-1292.
23. Pike, F.S. Gallbladder mucocele in dogs: 30 cases (2000-2002) / F. S. Pike, J. Berg, N. W. King, D. G. Penninck, C. R. Webster // Journal of the American Veterinary Medical Association. - 2004. - No. 224 (10). - P. 1615-1622.
24. Sara?, S. Leptin levels and lipoprotein profiles in patients with cholelithiasis / S. Sara?, A. Atamer, Y. Atamer, A.S. Can, A. Bilici, I.Ta?yildiz, N. Yenice // Journal of International Medical Research.
- 2015. - No. 43 (3). - P. 385-392.
25. Schueller, F. The role of miRNAs in the pathophysiology of liver diseases and toxicity / F. Schueller, S. Roy, M. Vucur, C. Trautwein, T. Luedde, C. Roderburg // International journal of molecular sciences.-2018. - No. 19 (1). - P. 261.
26. Spengler, E.K. Recommendations for diagnosis, referral for liver biopsy and treatment of nonalcoholic fatty liver disease and non-alcoholic steatohepatitis / E.K. Spengler, R. Loomba // Mayo Clin Proc.
- 2015. - No. 90. - P. 1233-1246.
27. Thampanitchawong, P. Liver biopsy: complications and risk factors / P. Thampanitchawong, T. Piratvisuth // World journal of gastroenterology. - 1999. - No. 5 (4). - P. 301.
28. Youn, G. Outcome of elective cholecystectomy for the treatment of gallbladder disease in dogs / G. Youn, M.J. Waschak, K.A. Kunkel, P.D. Gerard // Journal of the American Veterinary Medical Association.-2018. - No. 252 (8). - P. 970-975.
