Научная статья на тему 'Цинксодержащий антигипоксант аминотиолового ряда πQ1104 и его влияние на функциональную активность митохондрий клеток головного мозга'

Цинксодержащий антигипоксант аминотиолового ряда πQ1104 и его влияние на функциональную активность митохондрий клеток головного мозга Текст научной статьи по специальности «Фармакология»

136
32
Поделиться
Ключевые слова
ГИПОКСИЯ / АНТИГИПОКСАНТЫ / МИТОХОНДРИИ / НЕЙРОНЫ

Аннотация научной статьи по биологии, автор научной работы — Евсеев А. В., Парфенов Э. А., Правдивцев В. А., Евсеева М. А., Шабанов П. Д.

Изучено влияние нового антигипоксанта вещества πQ1104 (N-ацетил-L-цистеинато) Zn2+-сульфат октагидрат) на процессы окислительного фосфорилирования в митохондриях клеток головного мозга крыс. Установлено, что внутрибрюшинное введение изучаемого вещества в дозах 10, 25 и 50 мг/кг существенно замедляло скорости дыхания митохондрий, находившихся в различных метаболических состояниях по мере увеличения дозы, что сопровождалось уменьшением их энергосинтетической функции при удовлетворительном уровне сопряжения процессов окисления и фосфорилирования. Предложена гипотеза о возможной точке приложения антигипоксического действия вещества πQ1104 в дыхательной цепи митохондрий. Евсеев А.В., Парфенов Э.А., Правдивцев В.А., Евсеева М.А., Шабанов П.Д. Цинксодержащий антигипоксант аминотиолового ряда πQ1104 и его влияние на функциональную активность митохондрий клеток головного мозга // Психофармакол. биол. наркол. 2007. Т. 7, № 1. С. 1423-1430.

Похожие темы научных работ по биологии , автор научной работы — Евсеев А.В., Парфенов Э.А., Правдивцев В.А., Евсеева М.А., Шабанов П.Д.,

Zinc-Containing Aminothiol Antihypoxant πQ1104, and Its Influence on the Functional Activity of Brain Cell Mitochondria

The influence of a new antihypoxant, the substance πQ1104 (N-acetyl-L-cysteinato) Zn2+ sulfas octohydrate), on the processes of oxidative phosphorilation in mitochondria of rat brain cells was investigated. Intraperitoneal injection of the substance studied (10, 25 and 50 mg/kg) significantly and in dose-depended manner reduced the rates of mitochondrial respiration which took place in various metabolic conditions. That was accompanied by the decrease of ATP synthesis while the degree of oxidation and phosphorilation coupling was satisfactory. The hypothesis about a possible applying point of πQ1104 antihypoxic action in mitochondrial respiratory chain was discussed. Evseyev A.V., Parfenov E.A., Pravdivtsev V.A., Evseyeva M.A., Shabanov P.D. Zinc-containing aminothiol antihypoxant πQ1104, and its influence on the functional activity of brain cell mitochondria // Psychopharmacol. Biol. Narcol. 2007 Vol. 7, N 1. P. 1423-1430.

Текст научной работы на тему «Цинксодержащий антигипоксант аминотиолового ряда πQ1104 и его влияние на функциональную активность митохондрий клеток головного мозга»

НЕЙРОФАРМАКОЛОГИЯ

Резюме

Изучено влияние нового антигипоксанта — вещества nQ1104 (Ы-ацетил-Ь-цистеинато) 2п2+-сульфат октагидрат) — на процессы окислительного фосфорилирования в митохондриях клеток головного мозга крыс. Установлено, что внутрибрюшинное введение изучаемого вещества в дозах 10, 25 и 50 мг/кг существенно замедляло скорости дыхания митохондрий, находившихся в различных метаболических состояниях по мере увеличения дозы, что сопровождалось уменьшением их энергосинтетической функции при удовлетворительном уровне сопряжения процессов окисления и фосфорилирования. Предложена гипотеза

о возможной точке приложения антигипоксического действия вещества nQ1104 в дыхательной цепи митохондрий.

Евсеев А.В., Парфенов Э.А., Правдивцев В.А., Евсеева М.А., Шабанов П.Д. Цинксодержащий антигипоксант аминотиолового ряда nQ1104 и его влияние на функциональную активность митохондрий клеток головного мозга // Психофармакол. биол. наркол. — 2007. — Т. 7, № 1. — С. 1423-1430.

Ключевые слова

гипоксия; антигипоксанты; митохондрии; нейроны

© А.В. ЕВСЕЕВ1, Э.А. ПАРФЕНОВ1, В.А. ПРАВДИВЦЕВ1,

М.А. ЕВСЕЕВА1, П.Д. ШАБАНОВ2; 2007

1 ГОУ ВПО Смоленская государственная медицинская академия Росздрава; Крупской ул., 28, Смоленск, 214019; Россия

2 Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова МО РФ; акад. Лебедева ул., 6, Санкт-Петербург, 194044, Россия

ЦИНКСОДЕРЖАЩИЙ АНТИГИПОКСАНТ АМИНОТИОЛОВОГО РЯДА nQ1104 И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МИТОХОНДРИЙ КЛЕТОК ГОЛОВНОГО МОЗГА

ВВЕДЕНИЕ

В комплексе мероприятий по обеспечению выживания человека в условиях дефицита О2 во вдыхаемом воздухе все чаще находят применение фармакологические вещества, обладающие антигипоксическим действием [5, 11]. В соответствии с данными литературы, перестройка метаболизма при развитии гипоксии во всех органах носит стереотипный неспецифический характер [30]. Основу этих изменений составляет экономичная утилизация О2 клетками, снижение интенсивности окислительного фосфорилирования, торможение биосинтеза продуктов пластического обмена. Такого рода метаболические изменения способствуют более рациональному расходованию энергетических ресурсов, которые быстро истощаются при кислородном и субстратном голодании, вызванном гипоксией или ишемией [11, 33].

Использование химических соединений, способных оптимизировать деятельность внутриклеточных механизмов саморегуляции за счет рационального использования энергетических и пластических ресурсов, в первую очередь позволяет сохранить достаточный уровень активности жизненно важных органов на всем протяжении неблагоприятного периода [18]. Ранее нами было показано, что вещество nQ1104, являющееся комплексным соединением Zn2+ и N-ацетил-Ь-цистеина, после внутрибрюшинного введения мышам в дозе 50 мг/кг повышает их устойчивость к различным видам острой экзогенной острой гипоксии более чем в 2,5 раза [9, 10, 27].

Целью работы явилось изучение возможных внутриклеточных механизмов антигипоксического действия вещества nQ1104.

МЕТОДИКА

Все эксперименты выполнены в соответствии со стандартами Независимого комитета по биоэтике при Смоленской государственной медицинской академии.

Опыты проведены на 34 крысах-самцах массой 150—180 г линии Wistar . Животных делили на 4 группы по 7 крыс.

За 60 мин до декапитации трем опытным группам внутрибрюшинно вводили вещество nQ1104 в различных дозировках — 10, 25 и 50 мг/кг, растворенное в 1 мл физиологического раствора хлорида натрия. 4-я группа крыс, которая использовалась в качестве контроля, получала чистый физиологический раствор в равноценном объеме.

Процессы окислительного фосфорилирования в митохондриях головного мозга крыс изучали с помощью полярографического метода [12, 14]. После декапитации животного из мозговой ткани методом дифференциального центрифугирования выделяли митохондрии, в которых полярографически с помощью закрытого электрода Кларка, определяли состояние окислительного фосфорилирования. В качестве субстрата окисления использовали глутамат натрия.

По данным полярограммы рассчитывали скорость дыхания митохондрий в различных метаболических состояниях: V0 — скорость поглощения O2 при окислении экзогенного субстрата; V3 — скорость потребления O2 после добавки AДФ (акцептора фосфора), т.е. скорость фосфорилирующего окисления; V4 — скорость дыхания при условии истощения AДФ в системе — окисления после фосфорилирования; — скорость дыхания после добавления разобщителя протонофора — 2,4-динитрофенола. Рассчитывали показатели, характеризующие сопряжение процессов окисления и фос-форилирования в митохондриях: дыхательный контроль по Ларди (ДКЛ = V3/V0); дыхательный контроль по Чансу (ДКЧ = V3/V4); коэффициент AДФ/лO; стимуляцию дыхания 2,4-динитрофенолом (ДHФ = V^/V4); скорость фосфорилирования добавки AДФ (ЛДф/л^; способность мембран митохондрий сохранять собственный энергетический потенциал (V0/V4).

Ход определения. В ячейку электрода со средой инкубации общим объемом 1 мл вносили микропипеткой с изогнутым капилляром 0,015 мл глутамата натрия до конечной концентрации 3 мм. H ленте самописца регистрировали нулевую линию и, размыкая электрическую цепь, выписывали шкалу содержания O2 в среде. Вся длина шкалы при постоянной температуре среды 270 °С и объеме 1 мл соответствовала 240 нмолям O2 Сразу после добавления в среду инкубации 0,12 мл суспензии митохондрий регистрировали начальную скорость дыхания митохондрий V0. Затем добавляли 0,004 мл раствора AДФ до конечной концентрации 174 мкМ и последовательно регистрировали скорости V3 и V4. После добавления в среду инкубации 0,021 мл раствора разобщителя (2,4-динитрофенола) до конечной концентрации

20 мкМ регистрировали скорость разобщенного дыхания — Уднф.

Скорости дыхания митохондрий выражали в на-ног-атомах О2 за 1 мин в расчете на 1 мг белка митохондрий. ДДФ/At выражали в нмолях АДФ за 1 мин на 1 мг белка. Количественное определение белка проводили по Lowry et al. [32].

Полученные результаты обрабатывали статистически на персональном компьютере с использованием t-критерия Стьюдента и стандартных программ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты опытов представлены в таблице. Митохондрии, выделенные из ткани головного мозга крыс контрольной группы имели следующие стартовые показатели активности: скорости дыхания V0, V3, V4, V^j,, соответственно, равнялись— 22,07; 57,88; 25,72 и 64,81 наног-атом O2/мин/мг белка суспензии митохондрий (рис. 1). Дыхательный контроль — ДКЛ и ДКЧ — составили 2,62 и 2,25 соответственно. Коэффициент AДФ/лO равнялся 1,64. Скорость фосфорилирования AДФ/лt достигала 87,16 нмоль/ мин/мг белка. Применение разобщителя 2,4-динитрофенола увеличивало скорость окисления (ДHФ) в 2,54 раза. Показатель V0/V4, отражающий способность митохондриальных мембран удерживать энергетический потенциал, был равен 0,86.

Близкие показатели окислительного фосфорили-рования митохондрий головного мозга интактных крыс приведены в литературе [14].

После введения вещества nQ1104 в дозе 10 мг/кг начальная скорость окисления субстрата (V0) не изменялась. Тем не менее, прочие показатели свидетельствовали о некотором ослаблении энергетической функции митохондрий. Так, скорость окисления после фосфорилирования (V4) снизилась на

13,06 %, скорость фосфорилирующего окисления (V3) и разобщенного окисления (V^) снизились, соответственно, на 14,79 и 13,86 % в сравнении с контролем (рис.). Сопряжение процессов окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи при этом существенно не изменялось, что подтверждается стабильностью рассчитанных коэффициентов дыхательного контроля (ДКЛ и ДКЧ), а также сохранением скорости фосфорилирования добавки AДФ на исходном уровне, что свидетельствует о достаточном образовании ЛТФ в митохондриях головного мозга в единицу времени (ДДФ/л^. Показатель отношения скоростей нефосфорилирующего окисления (V0/V4) в этой группе исследования был достоверно выше, чем в контроле — 0,92.

ления (УДНФ) — на 37,39 %, было зарегистрировано существенное снижение скорости окисления субстрата — глутамата натрия (У0) на 30,09 % (все цифры даны в сравнении с контролем). Было отмечено некоторое ухудшение процессов сопряжения в дыхательной цепи, что проявлялось в снижении ДКЛ на 10,7 % и ДКЧ на 15,1 %. Образование АТФ в единицу времени (АДФ/М) снизилось на 38,9 % по сравнению с контрольными показателями. Отмечали тенденцию к уменьшению коэффициентов АДФ/лО и ДНФ. Соотношение У0/У4, однако достоверно не отличалось от исходной величины и составляло 0,81.

Введение вещества ^1104 в наибольшей из трех исследуемых доз (50 мг/кг) приводило к максимальному уменьшению начальной скорости окисления субстрата (У0). Данный показатель снижался еще на 14,46 %, т.е. в совокупности — на 44,55 % по сравнению с контрольным показателем. Скорость фосфорилирующего окисления (У3) в конечном итоге уменьшалась на 48,15 %. Скорость окисления после фосфорилирования (У4) снижалась на 32,46 %, а скорость разобщенного окисления (Уднф) — на 43,94 %.

Однако, несмотря на максимальную дозировку изучаемого вещества, ДКЛ возвращался к контрольному значению, хотя другой коэффициент — ДКЧ продолжал уменьшаться и составлял в среднем 76,44 % от исходного уровня. Образование АТФ в этой серии опытов составляло всего 43,6 % от исходной величины. Коэффициенты АДФ/лО и ДНФ

Таблица

Влияние вещества л^1104 на процессы окислительного фосфорилирования в митохондриях головного мозга крыс

Группы животных Статистические параметры Ч V3 V4 VДИФ ДКл ДКч Д ЦФ/ О АДФ/ t ДИФ VG/V4

Контроль (п = 10) М ± т 22,G7± ± 0,71 57,88± ± 1,54 25,72± ± G,79 64,S1± ± 1,92 2,62 ± ± G,GS 2,25 ± ± G,G5 1,64 ± ± G,14 S7,16± ± 4,93 2,54 ± ± G,G5 G,S6 ± ± G,G4

Доза 10 мг/кг (п = 8) М ± т 2G,55± ± G,S6 49,32± ±G,61* 22,36± ±G,44* 55,S3± ±1,32* 2,4G ± ± G,G9 2,21 ± ± G,14 1,56 ± ± G,13 S2,39± ± 3,67 2,51 ± ± G,G6 G,92 ± ± G,G5

Доза 25 мг/кг (п = 8) М ± т 15,43± ±G,73* 36,GS± ±1,14* 18,93± ±1,G2* 4G,5S± ±G,65* 2,34 ± ±G,G6* 1,91 ± ± G,G3 1,41 ± ± G,21 53,27± ±1,23* 2,35 ± ± G,11 G,S1 ± ± G,GS

Доза 50 мг/кг (п = 8) М ± т 12,24± ±G,95* 3G,G1± ±1,19* 17,37± ±G,77* 36,33± ±1,43* 2,45 ± ± G,1G 1,72 ± ±G,G3* 1,22 ± ±G,12* 37,96± ±2,G9* 2,G9 ± ±G,G5* G,7G ± ±G,G6*

Примечание: * — статистически достоверные различия по сравнению с контролем (р < 0,05).

7G: наног-атом О2/мин

А \/ —

6G \ \т А V3 -V4 ^^ДИФ

5G К\

4G

3G

т

2G É

^

1G

G i i i

N 1G 25 5G мг/кг

Рис.

Изменение скоростей дыхания митохондрий в различных метаболических состояниях (V, V, V4,

УДНФ) через 60 мин после введения вещества п01104.

По оси ординат — скорость дыхания митохондрий (в наног-атом О/мин/мг белка митохондрий). По оси абсцисс — доза вещества Ю1104, N — контроль

При введении вещества ^1104 в большей дозе (25 мг/кг) дыхание митохондрий становилось заметно слабее (см. рис.). Помимо дальнейшего снижения скорости фосфорилирующего окисления (У3) — на 37,66 %, скорости окисления после фосфорилирования (У4) — на 25,8 %, и скорости разобщенного окис-

достоверно снижались, соответственно, на 25,6 и

17,3 %. Показатель, отражающий способность митохондриальных мембран удерживать энергетический потенциал (V0/V4), также достоверно уменьшался и составлял 0,70.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Известно, что на определенном этапе гипоксии, развивающийся в тканях энергодефицит, становится причиной дополнительного повреждения клеточных мембран. Его негативное действие проявляется в нарушении работы ATФ-зависимыx ионных насосов [4], ослаблении пластических процессов по замене поврежденных мембранных структур, в дефос-форилировании мембранных белков [13]. Aдаптация клетки к новым условиям существования и, в частности, к острой или хронической гипоксии, может осуществляться только в случае непосредственного вовлечения внутриклеточных структур, ответственных за синтез и расход энергии, в комплекс развивающихся компенсаторно-приспособительных реакций.

Диализ полученных результатов показал, что уже в дозе 10 мг/кг вещество nQ1104 способно оказывать тормозящее влияние на функциональную активность митохондрий головного мозга. Это подтверждается достоверным снижением скорости фосфорилирующего окисления (V3) на 13,0 %, скорости потребления

О2 митохондриями после расходования добавки AДФ, т.е. скорости окисления после фосфорилирования (V4) на 14,8 %, а также скорости дыхания митохондрий в состоянии разобщения (т.е. после добавки 2,4-динитрофенола) на 13,9 %.

Следует отметить, что вещество nQ1104 в дозе 10 мг/кг не изменяло процессов сопряжения окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи митохондрий, о чем свидетельствуют устойчивые соотношения между соответствующими скоростями окисления, которые представлены в виде дыхательных коэффициентов — ДКЛ и ДКЧ, а также достаточно высокий показатель AДФ/лО. Продукция ATФ в митохондриях согласно расчетам ДДФ/лt оставалась на уровне исходного значения.

Введение вещества nQ1104 в дозах 25 и 50 мг/кг подтвердило его способность замедлять процессы внутриклеточного дыхания на уровне митохондрий клеточных элементов ткани мозга. Как было установлено, по мере увеличения дозы вводимого комплексного соединения происходит дальнейшее снижение всех изучаемых скоростей окисления. Например, после введения вещества nQ1104 в дозе 50 мг/кг

скорость окисления глутамата (V0) снижалась более чем на 30 % от своей исходной величины, а скорость фосфорилирующего окисления (V3) — почти в 2 раза. При этом V4 и ^НФ составляли всего 77,54 и

56,06 % от исходных показателей.

Настораживающим моментом, с нашей точки зрения, является отрицательный эффект вещества nQ1104 в дозах 25 и 50 мг/кг на реакции сопряжения процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях мозга крыс. Это нашло отражение в существенном понижении показателя дыхательного контроля по Чансу (ДКЧ), дающего представление о чувствительности митохондрий к приросту концентрации ОДФ, что предполагает уменьшение сродства дыхательной цепи к добавке ЛЦФ. Прогрессирующее снижение коэффициента ЛЦФ/лО также подтверждало частичное уменьшение энергоэффективности окисления митохондриями используемого субстрата.

Teм не менее, несмотря на то, что после введения вещества nQ1104 в дозе 25 мг/кг продукция ATФ в митохондриях снижалась на 38,9 %, соотношение скоростей окисления V0/V4, позволяющее судить о способности митохондриальных мембран удерживать энергетический потенциал, все еще оставалось на уровне контрольных величин. Однако после введения изучаемого вещества в дозе 50 мг/кг энергетический потенциал начинал понижаться и составил 81 % от исходного уровня, а образование ATФ в митохондриях мозговой ткани снижалось в

2,3 раза.

По мнению большинства исследователей, при решении вопроса о защите организма от повреждающего воздействия гипоксии на первый план выступают проблема коррекции аэробной компоненты энергетического обмена и устранение (или предупреждение) развития биоэнергетической гипоксии [7,

18, 36].

Общеизвестно, что в результате метаболических реакций все виды внутриклеточных энергетических трансформаций, в конечном итоге, аккумулируются в ATФ. В круговороте энергии именно ATФ является связующим звеном процессов, протекающих с выделением или потреблением энергии, и основным соединением, определяющим энергетическое состояние клеток организма. Основная масса ATФ образуется в результате окислительного фосфори-лирования в дыхательной цепи митохондрий (в так называемом митохондриальном компартменте), незначительная — в результате субстратного фосфорилирования (внемитохондриальный компартмент) [8, 35]. Следует отметить, что среди прочих клеточных органелл, митохондрии представляют собой

наиболее чувствительные к дефициту О2 внутриклеточные структуры и при развитии гипоксии повреждаются одними из первых [18].

Энергетический запас клетки в виде макроэрги-ческих соединений и субстратов особенно важен в условиях гипоксии, поскольку поддержание жизнедеятельности органов и организма в целом возможно только до тех пор, пока дефицит энергии не достигнет своего критического уровня [1, 15]. При этом, объективным показателем эффективности энергетического обмена служит соотношение между количеством синтезированных макроэргических соединений и количеством О2, потребленного в метаболических реакциях. Энергетические преобразования в клетке также во многом зависят от соотношения HAn/HAn,H в митохондриях, потенциала фосфорилирования в цитозоле клетки, значения внутримитохондриального рН, напряжения О2 в среде, а также от функционального состояния «шун-товых» механизмов синтеза энергии в клетке [16, 36].

Примат роли энергетического обмена в формировании «каскада» прочих метаболических нарушений, характерных для гипоксии (в частности, его первичность по отношению к свободнорадикальным процессам и увеличению проницаемости мембран), знание основных лимитирующих развитие гипоксии участков в дыхательной цепи митохондрий (ее «мишеней»), особенностей динамики процесса (распространение нарушений от субстратного участка дыхательной цепи к терминальному), а также их связь с проявлением системных нарушений позволили выделить три основные группы антигипоксан-тов-корректоров энергетического обмена: 1) вещества с акцепторными свойствами, формирующие шунтирующие потоки восстановительных эквивалентов на субстратном (HADH-^Q) участке дыхательной цепи (производные хинонов, рибофлавина, флавинсодержащие соединения растительного происхождения, никотинамид); 2) активаторы компенсаторных метаболических потоков (сукцинатокси-дазный путь окисления) — сукцинатсодержащие органические соединения (мексидол, лимонтар, ре-амберин); 3) корректоры электронно-транспортной функции цитохромного участка дыхательной цепи (экзогенные убихинон и цитохром С, аскорбиновая кислота) [19]. Применение антигипоксантов, способных регулировать энергетические потоки в дыхательной цепи митохондрий, позволяет достигнуть значительного уменьшения потерь ATФ при одновременном увеличении скорости окисления пиридинов, что приводит к нормализации редокс-потенциала клетки [18].

К числу наиболее известных на сегодняшний день классов органических веществ, способных модифицировать энергообразующие процессы в митохондриальном компартменте при гипоксических состояниях, относятся серосодержащие соединения, которые, главным образом, представлены производными тиобарбитуровой кислоты и аминотиола-ми — гутимином и амтизолом [2]. Феномен снижения энергосинтезирующей функции митохондрий клеток печени на фоне действия антигипоксических веществ аминотиолового ряда продемонстрирован в эксперименте [11], причем атом серы оказался абсолютно необходимым компонентом молекулы антигипоксанта. Согласно полученным данным, после введения амтизола (25 мг/кг) крысам, помещенным в условия острой гипоксической гипоксии, содержание АТФ в митохондриях снижалось на 45 % по сравнению с контрольной группой(гипоксия). Авторами было высказано предположение, что амтизол при острой гипоксии способствует сохранению адениннуклеотидного пула в энергопотребляющем и энергосинтезирующем компартментах клетки.

Изучаемое нами вещество nQ1104 также является серосодержащим химическим соединением, т. к. относится к производным аминотиолов (N-ацетил-L-цистеинато) Zn^-сульфат октагидрат). Однако особый интерес к нему, как и ко всему ряду исследуемых ФСАО, в значительной степени был обусловлен присутствием в структуре вещества переходного металла, в конкретном случае — двухвалентного цинка (Zn2+).

Сведения о перспективности разработки нового класса антигипоксантов на основе смешаннолиган-дных соединений металлов с аминокислотами, витаминами и другими антиоксидантами встречаются в целом ряде аналитических и экспериментальных научных работ, выполненных за последние 10—15 лет [17, 20, 22,]. Предполагалось, что интегрированный в структуру биологически активного вещества тот или иной незаменимый микроэлемент будет способен оказывать более существенное влияние на биоэнергетические процессы внутри клетки, чем самостоятельный лиганд.

Было установлено, что многие металлопротеины (в том числе и цинк-содержащие ферменты) принимают активное участие в синтезе нуклеиновых кислот, в белковом, жировом и углеводном видах обмена [34]. Однако, по нашему мнению, при остро развивающихся гипоксических состояниях указанные механизмы синтеза de novo металлоферментов в силу их инертности не могут вносить значительного вклада в совокупность процессов, обеспечивающих

142S

повышение резистентности организма к кислородной недостаточности.

Согласно полученным нами результатам, вещество nQ1104, по-видимому, обладает способностью оптимизировать работу лимитирующих звеньев энергетического обмена в клетке. Это подтверждается, в первую очередь, существенным замедлением после его введения крысам интенсивности протекания всех изученных видов внутримитохондриального дыхания (V0, V3, V4, V^), что приводило к ожидаемому снижению синтеза ATФ (50 мг/кг — на 56,4 %), но при этом протекало без существенной утраты митохондриями мозга способности сохранять собственный энергетический потенциал (V0/V4).

Из литературных источников следует, что подобного рода изменения на уровне митохондриального компартмента достаточно предсказуемы и закономерны при реализации защитных эффектов антиги-поксических веществ, т.к. они лежат в основе последующего экономичного расходования поступающих на матрикс митохондрий О2 и субстратов окисления [30, 33]. 2

По нашему мнению, внутриклеточными структурами-мишенями антигипоксического действия вещества nQ1104 могут являться прежде всего митохондрии головного мозга, сердца, печени. Как показали результаты исследования, принципиальным отличием изучаемого комплексного соединения цинка и ^ацетил^-цистеина от прочих антигипоксантов аминотиолового происхождения является его способность оказывать отчетливое влияние на метаболические процессы внутри клетки в условиях нормок-сии, в то время как гутимин, амтизол, бемитил, как правило, начинают демонстрировать свои защитные свойства только по мере усугубления гипоксическо-го состояния организма [5, 25].

Мы выдвигаем гипотезу о том, что наиболее вероятной точкой приложения антигипоксического действия вещества nQ1104 в дыхательной цепи митохондрий является ее цитохромный фрагмент. Предположение основывается на фактах, подтверждающих способность Zn2+ заметно ограничивать объемы электронных потоков в области цитохро-мов дыхательной цепи на участке b—c вплоть до их полной блокады [19, 29].

Указанный феномен позволяет обеспечить экономичность процессов окислительного фосфорилирова-ния, что в дальнейшем предотвращает преждевременное истощение внутриклеточных резервов, в первую очередь, за счет угнетения чрезмерно быст-рого окисления митохондриями HAД-зависимыx субстратов [19]. Присутствие Zn2+ в составе молекулы ^ацетил^-цистеина вещества nQ1104, на наш

взгляд, при развитии острой гипоксии ограничивает фазную активацию НАД-зависимого окисления в митохондриях головного мозга и, возможно, других энергоемких органов, что на следующем этапе развития гипоксии позволяет заметно отдалить развитие последующей фазы угнетения указанного процесса.

Литературные данные, в целом, косвенно подтверждают, высказанную гипотезу в отношении одного из вероятных механизмов антигипоксического действия вещества ^1104 в ЦНС. Так, Сергеева С.С. и соавт. [24] полагают, что на нейронном уровне протектив-ные эффекты аминотиоловых антигипоксантов могут существенно отличаться в способах их реализации. Например, если для гутимина в большей степени характерна пассивная защита нейронов от энергетического дефицита за счет снижения энерготрат на электрогенез, то, в свою очередь, амтизол способен активно перестраивать мембранные и внутриклеточные процессы для сохранения стабильного энергообеспечения импульсной активности нейронов.

На основании ранее высказанного предположения о возможности обеспечения энергосохраняющих эффектов антигипоксантов аминотиолового ряда за счет их способности напрямую оптимизировать работу электронно-транспортной функции дыхательной цепи в митохондриях на субстратном НАДН-зависимом ее участке [18] было проведено изучение влияния гутимина и амтизола на дыхательный метаболизм нейронов, что позволило выявить снижение потока электронов в митохондриях в сукцинат- и НАДН-дегидрогеназных путях, а также уменьшение энергетических затрат клетки на работу К+-Ыа+-насоса [24].

В последние годы у веществ этой группы обнаружена способность ограничивать активацию процессов ПОЛ и препятствовать угнетению антиокисли-тельных систем при остро развивающейся гипоксии [26]. Однако авторы полагают, что антиоксидантный эффект гутимина и амтизола является не столько результатом их прямого влияния на процессы ПОЛ, сколько опосредован стабилизацией энергетического обмена клетки.

По нашему мнению, вещество тс01104 также обладает способностью регулировать процессы свободно-радикального окисления в тканях. В отличие от эталонных аминотиоловых антигипоксантов и актоп-ротекторов (гутимина, амтизола, бемитила), вещество п01104 владеет свободной БН-группой (в составе молекулы Ы-ацетил-Ь-цистеина). Роль сульфгид-рильной группы как участника энзиматических и ан-тиокислительных реакций имеет большое значение в процессах сопряженного катализа, обеспечивающих синхронизацию событий в метаболических, энерге-

тических и информационных биологических потоках. Peдокс-прeвращeния SH-групп органических компонентов клетки способствуют сохранению показателей гомеостаза на оптимальном уровне [28]. Благодаря наличию SH-группы, изучаемое комплексное соединение вполне способно выступать в качестве редокс-бу-фера клетки, поддерживая в ней восстановленную среду, обеспечивая восстановление SH-групп энергообеспечивающих ферментов митохондрий при их окислении. В связи с этим, дефицит тиолового редок-с-контроля активности ферментов при развитии острой гипоксии, который выполняется в клетке преимущественно за счет использования тиолдисульфидных соединений (глутатионовая система) [3], вполне может быть частично компенсирован благодаря стабилизирующему влиянию вещества nQ1104, что можно рассматривать в качестве возможного дополнительного механизма его антигипоксического действия.

Присутствие цинка в составе вещества nQ1104 также может влиять на течение свободно-радикальных реакций в клетке. Установлено, что в отличие от целого ряда ионов металлов (кобальт, никель, хром), инициирующих реакции ПОЛ [6], цинк обладает ан-тиокислительным эффектом, являясь фактором стабилизации плазматических мембран, поврежденных продуктами ПОЛ, и, кроме того, препятствует всасыванию прооксидантных микроэлементов [23].

Следует также отметить, что лиганд химического соединения nQ1104 — ^ацетил^-цистеин — является природным метаболитом L-цистеина, в связи с чем его можно рассматривать как низкомолекулярное соединение способное выполнять и самостоятельные защитные функции. Например, этот агент регулирует активность факторов транскриптации AP-1 и NF-кВ в качестве хелатора ионов Zn2+ [31], а не выступает в качестве ловушки активных частиц, как считали ранее. Присутствие цинка в структуре молекулы ^ацетил^-цистеина априори предполагало возникновение качественно новых эффектов синтезируемого комплексного соединения, т.к. переходные металлы, к которым относится и цинк, в биологических системах выполняют множество функций, в том числе и функцию активного центра металлофермен-тов. В целом, комплексные соединения N-ацетил-L-цистеина с биометаллами можно рассматривать одновременно как метаболиты и металла и лиганда [21]. По этой причине вероятность обнаружения защитного эффекта у комплексного соединения, например при гипоксии, значительно выше, чем только у металла или отдельно у лиганда.

Tаким образом, изучаемое вещество nQ1104, благодаря своим особенностям, способно активно влиять на интенсивность энергосинтетических процес-

сов в клетке. Как следует из результатов проведенных экспериментов, наиболее вероятный механизм защитного действия изучаемого комплексного соединения реализуется на уровне митохондриального ком-партмента посредством обратимого уменьшения скорости протекания окислительных реакций в дыхательной цепи, что при развитии острой гипоксии оптимизирует расходование О2 и окисляемых биологических субстратов.

В целом, полученные данные свидетельствуют о наличии у вещества nQ1104 многокомпонентного нейропротективного действия, позволяющего обеспечить поддержание устойчивой деятельности митохондрий нервных клеток в условиях острого дефицита О2 в окружающей воздушной среде.

ЛИТЕРАТУРА__________

1. Аксенцев С.Л., Левко А.В., Федорович С.В. и др. Кальций, освобождаемый из внутриклеточных депо, ингибирует окислительное фосфорилирова-ние митохондрий в синаптосомах мозга крыс при ацидозе // Биофизика. — 1998. — Т. 43, Вып. 2. — С. 315-318.

2. Бакибаев А.А., Горшкова В.К., Саратиков А.С. Антигипоксические свойства органических соединений (обзор) // Хим.-фарм. журн. — 1997. — Т. 31, № 2. — С. 3-16.

3. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. — М.: Медицина, 1989. — 368 с.

4. Болдырев А.А. Парадоксы окислительного метаболизма мозга // Биохимия. — 1995. — Т. 60, № 9. — С. 1536-1543.

5. Виноградов В.М. Фармакологические средства для профилактики и лечения гипоксии (состояние проблемы) // Кислородный гомеостазис и кислородная недостаточность. — Киев: Наукова думка, 1978. — С. 183-192.

6. Владимиров Ю.А., Азизова О А., Деев О.А. и др. Свободные радикалы в живых системах // ВИНИТИ АН СССР. Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. — М., 1991. — Т. 29.

7. Владимиров Ю.А., Коган Э.М. Механизмы нарушения биоэнергетических функций мембран митохондрий при тканевой гипоксии // Кардиология. — 1981. — Т. 21. — С. 82-85.

8. Дынник В.В. Иерархия регуляторных механизмов во внутриклеточном обмене // Метаболическая регуляция физиологического состояния. — Пущи-но, 1984. — С. 15-18.

9. Евсеев А.В., Евсеева М.А., Парфенов Э.А., Прав-дивцев В.А., Шабанов П.Д. Антигипоксическая активность бис(1\1-ацетил-1_-цистеинато)цинк(П)сульфат октагидрата в динамике острой нормобарической гипоксии // Психофармакол. биол. наркол. — 2006. — Т. 6, № 3. — С. 1270-1274.

10. Евсеев А.В., Яснецов С.А., Сосин Д.В. Влияние новых комплексных соединений металлов и биоантиоксидантов на продолжительность жизни мышей в условиях острой экзогенной гипоксии с гиперкапнией // Здоровье и образование в XXI веке: Науч. труды VI Междунар. науч.-практ. конф. — М.: Изд. РУДН, 2005. — С. 560.

11. Зарубина И.В., Шабанов П.Д. Молекулярная фармакология антигипоксантов. — СПб.: Изд-во Н-Л, 2004. — 368 с.

12. Ивков И.Н., Панченко Л.Ф. Изучение функционального состояния митохондрий печени нормальных крыс // Структура и функции биологических мембран / Тр. 2-го МОЛГМИ им. Н.И. Пирогова. — М., 1971. — С. 94-103.

13. Кравцов А.В., Алексеенко И.Р. Механизмы регуляции векторных ферментов биомембран. — Киев: Наукова думка, 1990. — 176 с.

14. Кулагин К.Н., Новиков В.Е., Ковалева Л.А. Влияние мексидола на функцию митохондрий мозга в раннем посттравматическом периоде // Вестн. Смоленской мед. академии. — 2004. — № 3. — С. 24-26.

15. Короткина Р.Н., Коростелев А.Н., Ситников А.В. и др. Метаболические эффекты мексидола при кардиохирургических операциях с искусственным кровообращением // Анестезиол. и реаниматол. — 2005. — № 3. — С. 21-23.

16. Коттрелл Д.Е. Защита мозга // Анестезиол. и реаниматол. — 1996. — № 2. — С. 81-84.

17. Левченкова О.С. Изучение антигипоксической активности химических производных природных антиоксидантов: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. — Смоленск, 2006. — 21 с.

18. Лукьянова Л.Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и способы коррекции // Бюл. эксперим. биол. и мед. — 1997. — Т. 124, № 9. — С. 244-254.

19. Лукьянова Л.Д. Роль биоэнергетических нарушений в патогенезе гипоксии // Патол. физиол. и эксперим. тер. — 2004. — № 2. — С. 2-11.

20. Лукьянчук В.Д., Савченкова Л.В. Антигипоксан-ты: состояние и перспективы // Эксперим. и клин. фармакол. — 1998. — № 4. — С. 72-79.

21. Парфенов Э.А. Физиологически совместимые антиоксиданты. Молекулярно-механистический аспект биологической активности и повышение защитной эффективности природных антиоксидантов в результате химической модификации: Дис. ... д-ра хим. наук. — М., 2000. — 48 с.

22. Парфенов Э.А., Смирнов Л.Д. Успехи и перспективы создания лекарственных препаратов на основе аскорбиновой кислоты. Обзор // Хим.-фарм. журн. — 1993. — Т. 26, № 9-10. — С. 4-17.

23. Ракитский В.Н., Юдина Т.В. Антиоксидантный и микроэлементный статус организма: современные проблемы диагностики // Вестн. РАМН. — 2005. — № 3. — С. 33-36.

24. Сергеева С.С. Влияние гутимина и амтизола на

активность К, Na-насоса нервной клетки // Эксперим. и клин. фармакол. — 1994. — Т. 57, № 4. — С. 16-18.

25. Смирнов А.В., Криворучко Б.И. Антигипоксанты в неотложной медицине // Анестезиол. и реаниматол. — 1998. — № 2. — С. 50-55.

26. Шабанов П.Д., Зарубина И.В., Нурманбето-ва Ф.Н. Стратегия защиты мозга от гипоксии и ишемии // Гипоксия. Механизмы, адаптация, коррекция: Матер. IV Росс. конф. — М.: Изд-во ГУ НИИ ОПП РАМН, 2005. — С. 119.

27. Яснецов С.А., Евсеев А.В., Парфенов Э.А. Изучение антигипоксических эффектов медьсодержащих биологически активных веществ // Психо-фармакол. биол. наркол. — 2006. — Т. 6, № 4. — С. 1335-1340.

28. Bellomo G. Cell damage by oxygen free radicals // Cytotechnol. — 1991. — Vol. 1. — P. 71-73.

29. Cytochrome С: A multidisciplinary approach / Ed. by R.A. Scott, A.G. Mauk. — Sausalito (CA): Univ. science books, 1996. — 738 p.

30. Hochachka P.W. Living without oxygen: closed and open systems in hypoxia tolerance. Massachusetts, London, 1980. — 178 p.

31. Kim C.H., Kim J.H., Lee J. et al. // Biol. Chem. — 2003. — Vol. 384, N 1. — P. 143-150.

32. Lowry O.H., Rosebrough N.I., Farr A.L., Randall R.I. Protein measurement with the Follin phenol reagent// J. Biol. Chem. — 1951. — Vol. 193, N 1. — P. 265-275.

33. Siesjo B.K. Ischemia: A Complete, generalized ischemia // Brain energy metabolism / Ed. by J. Wiley. — New York, 1978. — P. 453-478.

34. Spiro T.G. Zinc enzymes. — New York: A. Wiley-In-terscience publ., 1983. — 359 p.

35. Szewczyk A., Wojtczak L. Mitochondria as a pharmacological target // Pharmacol. Rev. — 2002. — Vol. 54, N 1. — P. 101-127.

36. Wilson D.F. The role of peroxides in mitochondrial reduction of dioxygen to water // Bioelectrochem. and Bioenerg. — 1987. — Vol. 18, N 1-3. — P. 51-58.

Evseyev A.V.1, Parfenov E.A.1, Pravdivtsev V.A.1, Evseyeva M.A.1, Shabanov P.D.2 Zinc-containing aminothiol antihypoxant pQ1104, and its influence on the functional activity of brain cell mitochondria // Psychopharmacol. Biol. Narcol. — 2007 — Vol. 7, N 1. — P. 1423-1430.

1 Smolensk State Medical Academy, Krupskaya St., 28, Smolensk, 214019, Russia; 2 Military Medical Academy; 6 acad. Lebedev str., Saint-Petersburg, 194044, Russia.

Summary: The influence of a new antihypoxant, the substance nQ1104 (N-acetyl-L-cysteinato) Zn2+ sulfas octohydrate), on the processes of oxidative phosphorilation in mitochondria of rat brain cells was investigated. Intraperitoneal injection of the substance studied (10, 25 and 50 mg/kg) significantly and in dose-depended manner reduced the rates of mitochondrial respiration which took place in various metabolic conditions. That was accompanied by the decrease of ATP synthesis while the degree of oxidation and phosphorilation coupling was satisfactory. The hypothesis about a possible applying point of nQ1104 antihypoxic action in mitochondrial respiratory chain was discussed.

Key words: hypoxia; antihypoxants; mitochondria; neurons

электронная копия статьи — http://www.elibrary.ru, © Архив (стоимость коммерческого доступа в режиме full text — 55 руб./год)