CC BY
96
дочный сок и, таким образом, остаются плавать на поверхности в течение длительного времени, не завися от скорости опорожнения. Пока система плавает, ЛВ медленно высвобождается с необходимой скоростью. После высвобождения ЛВ, матрица удаляется из желудка. В результате увеличения времени пребывания в желудке, улучшается контроль колебаний концентрации ЛВ в плазме.
Основная абсорбция веществ осуществляется в верхней трети тонкого кишечника. Время пребывания в этом отделе кишечника составляет 2-3 ч, где активность панкреатических ферментов высокая при данном значении рН=6-7, и выделятся желчные кислоты, способствующие эмульгированию жиров. При создании ЛФ, содержащей мукоадгезивный полимер и липидный компонент, время пребывания в кишечнике увеличивается, и образуется тонкая эмульсия ЛВ (липидный компонент, желчные кислоты и увеличенное время пребывания). Эмульсии имеют высокую проницаемость через биологические мембраны.
Одним из методов улучшения растворимости является применение систем доставки - липосом, представляющие везикулы (пузырьки), построенные на основе природных (натуральных) или синтетических фосфолипидов. Особенности их строения (бислойность, малый размер, наличие внутренней полости) позволяют получить липосомальную лекарственную форму (ЛЛФ) как гидрофильного (включается во внутренне пространство), так и гидрофобного (встраивается в липосомальный бислой) вещества, а также препарат, содержащий обе субстанции одновременно.
Липосомы обладают меньшей стабильностью по сравнению с микрочастицами и циклодекстринами, но их способность укреплять барьерную функцию, амфифильность оболочки и биодоступность свидетельствуют о явном преимуществе как наиболее безопасного, относительно недорогого и прогрессивного в фармацевтической технологии объекта инкапсулирования. Солюбилизирующая способность липосом определяется строением фосфолипида (наличие или отсутствие заряда, длина углеродного скелета), его количественным содержанием, наличием в структуре бислоя холестерина, размером везикул и рН липосомальной дисперсии.
Развивается направление получения систем направленной доставки, к которым можно отнести наносистемы на основе полимерных носителей. Данные наносистемы, способные транспортировать ЛВ внутрь клеток [2]. При циркуляции таких носителей содержащееся в них ЛФ защищено от инактивации, а их действие пролонгируется. Кроме того, наносистемы доставки ЛВ на основе полимерных носителей имеют следующие преимущества: быстрое и воспроизводимое получение в больших количествах, возможность включения плохорастворимых в воде ЛВ, регулирование накопления препарата в различных органах и тканях организма в зависимости от размера частиц.
Выводы. Для улучшени биологической и
фармацевтической доступности ЛВ применяются следующие методы: химический (модификация структуры ЛВ), физический (получение твердых дисперсных систем), физическо-химические (ионозиция ЛВ, солюбилизация, введение ВВ липидной природы, введение в рецептуру (со)растворителей, и др.), а также технологические приемы (эмуьгирование, получение нано- и микрочастиц, липосом, введение дезинтегрантов). На разных этапах взаимодействия ЛВ с организмом, эти приемы позволяют улучшить растворимость и проницаемость через естественные барьеры ЛВ. Перечисленные подходы реализуются в фармацевтической технологии.
Литература
1. Алексеев, К.В. Применение биофармацевтической классификационной системы для установления корреляции in vivo и in vitro / К.В. Алексеев, Е.В. Блынская, Е.А. Литвин //Вестник новых медицинских технологий.- 2009.- т. XVI.- №3.- С. 136-13.
2. Основные направления в технологии получения наноносителей лекарственных веществ / К.В. Алексеев [и др.] // Вестник новых медицинских технологий.- 2009.- №2.- С. 142- 145.
3. Adessi, C. Strategies to improve stability and bioavailability of peptide drugs / C. Adessi, C. Sotto // Frontiers Med Chem.- 2004.-
1.- P. 513-27.
4. Floating drug delivery systems: A review / S. Arora [et al]// AAPS PharmSciTech.- 2005.- 6 (3).
5. Challa, R.. Cyclodextrins in Drug Delivery: An Updated
Review / R. Challa, A. Ahuja, J. Ali, R.K. Khar // AAPS PharmSciTech.- 2005.- № 6 (2) Article 43.
6. M-L, Chen. Lipid based oral dosage forms-regulatory perspective / M-L, Chen. // Am. Pharm. Rev. 5:30-35 (2002).
7. Madgulkar, A. Studies on formulation development of mu-coadhesive sustained release Itraconazole tablet using response surface methodology / A. Madgulkar, S. Kadam, V.. Pokharkar // AAPS PharmSciTech.- Vol. 9.- No. 3, September 2008.
8. Miller, D.A. Targeted intestinal delivery of supersaturated Itraconazole for improved oral absorption / D.A. Miller, J.C. DiNunzio, W. Yang // Pharmaceutical Research.- Vol. 25.- No.
6.- June 2008.
9. Organic solvents for pharmaceutical parenterals and embolic liquids: a review of toxicity data / F. Mottu [et al.]// J. Parent. Sci. Tech. 54:456-469 (2000).
10. Rick, S. Oral protein and peptide drug delivery. In: Binghe W, Teruna S, Richard S, editors. Drug delivery: Principles and applications / S. Rick// New Jersey: Wiley Interscience; 2005. p. 189.
11. Rowe, R.C. Handbook of Pharmaceutical Excipients, Fourth Edition, Pharmaceutical Press, London, United Kingdom, and the American Pharmaceutical Association, Washington / R.C. Rowe, P.J. Sheskey, P.J. Weller // DC, 2003.
12. Strickley, R.G.. Solubilizing Excipients in Oral and Injectable Formulations / R.G. Strickley// Pharmaceutical Research.- Vol. 21.- No. 2.- February 2004.
13. Takano, R. Oral Absorption of Poorly Water-Soluble Drugs / R. Takano, K. Sugano, A. Higashida // Pharmaceutical Research, Vol. 23, No. 6, June 2006.
14. Williams, III R.O. Method to recover a lipophilic drug from hydroxypropy methylcellulose matrix tablets / R.O. Williams III, M.A. Sykora, V. Mahaguna // AAPS PharmSciTech, 2001; 2 (2) article 8.
TECHNOLOGY OF RAISING THE AVALIABILITY OF BIOLOGIC AND PHARMACEUTICAL DRUGS
K.V. ALEKSEEV, N.V. TIKHONOVA, YE.V. BLINSKAYA,
YE.U. KARBUSHEVA, K.G. TURCHINSKAYA, A.C. MIKHEEVA,
V.K. ALEKSEEV, N.A. UVAROV
Research Institute of Pharmacology after V.V. Zakusov, Moscow Close corporation “F-Sintez”, Moscow
A great number of drugs (up to 40%) has low bio- and pharmaceutical avaliability. It is connected with their physicochemical properties. There are numerous methods improving low drug dissolution property and drug permeability through biomembrans. These methods include physical, chemical and physicochemical, and technologic techniques.
Key words: bioavailability, dissolution, permeability.
УДК 612.26-092.4/.9:615.72
УГНЕТЕНИЕ ДЫХАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ МИТОХОНДРИЙ КАК ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ ПРОТЕКТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ АНТИГИПОКСАНТОВ
Д.В. СОСИН, А.В. ЕВСЕЕВ, В.А. ПРАВДИВЦЕВ, М.А. ЕВСЕЕВА*
В опытах на крысах обнаружено угнетающее действие нового металлокомплексного соединения пР1104 на дыхательную активность митохондрий головного мозга. Предполагается, что механизм защитного действия вещества лр1104 при угрозе формирования острого гипоксического состояния реализуется на уровне митохондриального компартмента посредством обратимого уменьшения скорости окислительных реакций в дыхательной цепи, что в условиях острой гипоксии оптимизирует расходование кислорода и окисляемых биологических субстратов.
Ключевые слова: крыса, митохондрия, окислительное фосфорили-рование, острая гипоксия, антигипоксант.
Многие авторы допускают, что перспективным способом увеличения резистентности организма к острой экзогенной гипоксии является ограничение уровня его физической активности, что гарантирует экономный расход доступного для дыхания О2 и наличного резерва субстратов биологического окисления [2,12]. Установлено, что снижение метаболических запросов организма может быть обеспечено применением антигипоксантов [1,2,3,15].
* Смоленская государственная медицинская академия, Россия, ул. Крупской, 28, г. Смоленск, 214019, e-mail: adm@sgma.info
Перспективной группой антигипоксантов заслуженно считают вещества метаболического типа действия - гутимин, амти-зол, бемитил и др. [5,10].
С появлением в поле зрения исследователей новой группы химических веществ - комплексных соединений биометаллов с природными антиоксидантами - открылись дополнительные возможности для изыскания антигипоксических средств. Синтезированные доктором хим. наук. Э.А. Парфёновым, вещества этой группы положительно зарекомендовали себя в опытах с моделированием острой гипоксии на животных различных видов [4,8].
Цель исследования - изучение влияния нового перспективного антигипоксанта - вещества nQ1104 (комплексное соединение цинка и N-ацетил-Ь-цистеина) - на процессы окисления и фосфорилирования в митохондриях головного мозга.
Материалы и методы исследования. Опыты проведены на 32 крысах-самцах линии Wistar массой 150-180 г. Животных делили на 4 группы (1 контрольная и 3 опытных) по 8 в группе. Умерщвление животных (декапитацию) осуществляли строго в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными приказом Минздрава СССР.
За 60 мин до декапитации крысам опытных групп в/б вводили вещество nQ1104 в дозе 10, 25 и 50 мг/кг. Субстанцию растворяли в 1 мл физиологического раствора хлорида натрия. Крысы контрольной группы получали ложные инъекции физиологического раствора. У животных измеряли ректальную температуру в исходном состоянии, а также через 10, 30 и 60 мин после инъекции антигипоксанта.
Окислительное фосфорилирование в митохондриях головного мозга изучали полярографическим методом [7]. Предварительно на ленте самописца регистрировали нулевую линию с построением шкалы содержания в среде инкубации молекулярного кислорода, для чего в ячейку электрода Кларка вносили
0.015 мл глутамата натрия. Длина шкалы при температуре среды 27оС и объёме ячейки 1 мл соответствовала 240 нмолям О2.
Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования. В среду инкубации добавляли 0,12 мл суспензии митохондрий, после чего регистрировали начальную скорость дыхания V0 - скорость поглощения О2 при окислении глу-тамата. Затем регистрировали скорость потребления О2 после добавки АДФ (0,004 мл раствора) - V3, а также скорость окисления после фосфорилирования - V4. После внесения в среду инкубации разобщителя - 2,4-динитрофенола (0,021 мл раствора) регистрировали скорость разобщённого дыхания - ^НФ.
На основании полученных данных рассчитывали показатели сопряжения процессов окисления и фосфорилирования, такие как дыхательный контроль по Ларди (ДКЛ = V3/V0), дыхательный контроль по Чансу (ДКЧ = V3/V4), коэффициент АДФ/АО, стимуляцию дыхания 2,4-динитрофенолом (ДНФ = V№e/V4), скорость фосфорилирования добавки АДФ (АДФ/At), способность мембран митохондрий сохранять энергетический потенциал (V0/V4). Общий вид полярограммы представлен на рис.
1.
Скорости дыхания митохондрий выражали в нанограмм-атомах О2 за 1 мин на 1 мг белка митохондрий. АДФ/At - в нмолях АДФ за 1 мин на 1 мг белка. Количественное определение белка выполняли по общеизвестному методу Lowry et al. (1951).
Статистический анализ данных осуществляли с помощью пакета программ Statgraphics plus, версия 2.2. Различия между параметрами считали значимыми при p<0,05.
Результаты и их обсуждение. Данные, характеризующие динамику изменения ректальной температуры у животных, представлены в табл. 1. Как видно из таблицы, после введения вещества nQ1104 в дозах 25 и 50 мг/кг ректальная температура достоверно снижалась. При этом доза 25 мг/кг обеспечивала значимые изменения (снижение температуры на 3,2 оС) только к концу периода инкубации. В свою очередь, после дозы 50 мг/кг статистически достоверные изменения отмечались уже через 30 мин после введения вещества, а к 60 мин наблюдения температура снижалась на 4,5 оС.
Рис. 1. Общий вид полярограммы.
Примечание: Мх - момент добавления суспензии митохондрий;
АДФ - момент внесения АДФ; ДНФ - момент внесения динитрофенола. У0 , У3, У4, Уднф. - скорости дыхания митохондрий в разных метаболических состояниях в нмолях АДФ за 1 мин на 1 мг белка.
(У0 - скорость поглощения О2 при окислении глутамата;
У3 - скорость поглощения О2 после добавки АДФ; У4 - скорость окисления после фосфорилирования; Уднф - скорость разобщённого дыхания)
Таблица 1
Ректальная температура у крыс до и после в/б введения вещества лО1104 в дозах 10, 25 и 50 мг/кг
Доза Время Контроль (n=8) 10 мг/кг (n=8) 25 мг/кг (n=8) 50 мг/кг (n=8)
Исходное Состояние 36,9±0,4 оС 36,8±0,3оС 36,6±0,4 оС 36,6±0,3 оС
10 мин 36,8±0,3 оС 36,7±0,3 оС 35,8±0,4 оС 35,2±0,4 оС
30 мин 36,7±0,3 оС 36,2±0,4 оС 35,0±0,3 оС 34,4±0,5 оС*
60 мин 36,8±0,3 оС 36,3±0,4 оС 33,6±0,3 оС* 32,3±0,3 оС*
Примечание: * - достоверные изменения в сравнении с контролем (р<0,05).
наног-атом 02/мин
_п_ vo
V4 -¿s- Уо.Нф
Ч-'—
N Ю 25 50 мг^кг
Рис. 2. Изменение скоростей дыхания митохондрий головного мозга в различных метаболических состояниях на фоне вещества пр1104. У0 -скорость поглощения О2 при окислении глутамата; У3 - скорость поглощения О2 после добавки АДФ; У4 - скорость окисления после фосфорилиро-вания; УдНФ - скорость разобщённого дыхания.
По оси ординат - скорость дыхания в нанограмм-атом О2/мин на 1 мг белка. По оси абсцисс - доза вещества пр1104. N - контроль
По данным, представленным на рис. 2 и в табл. 2, после введения вещества пр1104 в дозе 10 мг/кг начальная скорость окисления субстрата У0 не изменялась. Тем не менее прочие показатели свидетельствовали об ослаблении энергетической функции митохондрий. Так, У4 замедлилась на 13,1%. У3 и УдНФ снизились соответственно на 14,8 и 13,9%. Однако сопряжение процессов окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи существенно не страдало. Это было подтверждено стабильностью коэффициентов дыхательного контроля и сохранением исходной скорости фосфорилирования добавки АДФ, что свидетельствовало о достаточном образовании АТФ в митохондриях головного мозга (АДФ/Д^. Показатель отношения скоростей нефосфорили-рующего окисления У0/У4 в этой группе исследования был достоверно выше, чем в контроле, и составил 0,92.
Рис. 2 позволяет проследить динамику изменения дыхания митохондрий на фоне действия вещества лф1104.
Таблица 2
Влияние вещества яР1104 после в/б введения на расчётные показатели процессов окислительного фосфорилирования в митохондриях головного мозга крыс
Группы животных ДКл ДКч АДФ/ДО АДФ/Д1 ДНФ V0/V4
Контроль (n=10) 2,62±0,08 2,25±0,05 1,64±0,14 87,16±4,93 2,54±0,05 0,86±0,04
Доза 10 мг/кг (n=8) 2,40±0,09 2,21±0,14 1,56±0,13 82,39±3,67 2,51±0,06 0,92±0,05
Доза 25 мг/кг (n=8) 2,34±0,06* 1,91±0,03 1,41±0,21 53,27±1,23* 2,35±0,11 0,81±0,08
Доза 50 мг/кг (n=8) 2,45±0,10 1,72±0,03* 1,22±0,12* 37,96±2,09* 2,09±0,05* 0,70±0,06*
Примечание: * - статистически достоверные различия по сравнению с контролем (р<0,05)
После введения вещества лф1104 в дозе 25 мг/кг дыхание митохондрий заметно ослаблялось. Уз снижалось на 37,7% от исходного значения, У4 - на 25,8%, Уднф - на 37,4%. Также наблюдали существенное угнетение скорости окисления глутамата натрия Уо до 30,1%. Отмечали разобщение процессов окисления и фосфорилирования, которое выражалось в снижении ДКл на 10,7%, ДКч - на 15,1%. Образование АТФ (АДФ/Д1;) по сравнению с контрольным значением уменьшалось на 38,9%. Наблюдали тенденцию уменьшения коэффициентов АДФ/ДО и ДНФ. При этом соотношение У0/У4 значимо не отличалось от исходного.
Введение вещества лф1104 в максимальной из 3-х изученных доз 50 мг/кг приводило к наибольшему угнетению скорости окисления субстрата У Показатель снижался ещё на 14,5% и по сравнению с контрольным значением составил всего 55,4%. Скорость фосфорилирующего окисления У3 в конечном счёте уменьшалась на 48,2%, скорость окисления после фосфорилирования У4 - на 32,5%, а скорость разобщённого окисления Уднф - на 43,9%.
Тем не менее, даже на фоне указанной дозы антигипок-санта, величина ДКл восстанавливалась до исходного уровня, в то время как ДКч продолжал уменьшаться и составлял 76,4% от исходного значения. Образование АТФ при этом снижалось более чем в 2 раза. Коэффициенты АДФ/ДО и ДНФ достоверно уменьшались на 25,6 и 17,3% соответственно. Показатель энергетического потенциала мембран У0/У4, также продолжал падать и составлял 0,70.
Результаты и их обсуждение. Как показали результаты исследования, антигипоксический эффект вещества лф1104 тесно связан с его способностью угнетать процессы окисления биологических субстратов в митохондриях головного мозга.
Известно, что лимитирование потребности в О2 при развитии гипоксии способствует более стабильному и продолжительному протеканию энергетических процессов в тканях [13].
Использование химических соединений, способных оптимизировать деятельность внутриклеточных механизмов саморегуляции за счёт рационального использования энергетических и пластических ресурсов, позволяет сохранить необходимый и достаточный уровень активности жизненно важных органов на протяжении всего гипоксического эпизода [4,12].
Анализ собственных данных показал, что уже в дозе 10 мг/кг вещество лф1104 способно оказывать заметное угнетающее влияние на функциональную активность митохондрий головного мозга. Следует отметить, что применение вещества в указанной дозе не нарушало сопряжения процессов окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи митохондрий, о чём свидетельствовали устойчивые соотношения дыхательных коэффициентов ДКл и ДКч, а также высокий показатель АДФ/ДО. Продукция АТФ в митохондриях, согласно показателю АДФ/Д1, сохранялась на исходном уровне.
Последствия применения вещества лф1104 в дозах 25 и 50 мг/кг подтвердили его способность замедлять процессы внутриклеточного дыхания на уровне митохондрий клеточных элементов ткани головного мозга. По мере увеличения дозы вводимого вещества отмечали дальнейшее снижение всех изучавшихся скоростей окисления.
С нашей точки зрения настораживающим моментом представляется отрицательный эффект вещества лф1104 на реакции сопряжения процессов окисления и фосфорилирования в мито-
хондриях, наблюдавшийся после его введения в дозах 25 и 50 мг/кг. Негативное влияние соединения проявилось в существенном понижении показателя дыхательного контроля по Чансу, дающего представление о чувствительности митохондрий к приросту концентрации АДФ. Последнее предполагало уменьшение сродства дыхательной цепи к добавке АДФ. Прогрессирующее снижение коэффициента АДФ/ДО также подтверждало частичное уменьшение энергоэффективности окисления митохондриями используемого субстрата.
Тем не менее, несмотря на то, что после введения вещества nQ1104 в дозе 25 мг/кг продукция АТФ в митохондриях снижалась на 38,9%, соотношение скоростей окисления V0/V4, позволяющее судить о способности митохондриальных мембран удерживать энергетический потенциал, всё ещё оставалось на уровне контрольных величин. Однако после применения изученного вещества в дозе 50 мг/кг энергетический потенциал начинал понижаться и составлял 81% от исходного уровня, а образование АТФ в митохондриях мозговой ткани снижалось в 2,3 раза.
По мнению большинства исследователей, при решении вопроса о защите организма от повреждающего воздействия дефицита О2, на первый план выступает проблема коррекции аэробной компоненты энергетического обмена в сочетании с проведением комплекса мероприятий по устранению (или предупреждению) развития биоэнергетической гипоксии [6].
Общеизвестно, что в результате метаболических реакций все виды внутриклеточных энергетических трансформаций в конечном счёте аккумулируются в АТФ. В круговороте энергии именно АТФ выступает в качестве связующего звена процессов, протекающих с выделением или потреблением энергии, и является главным соединением, определяющим энергетическое состояние клеток организма. Основная масса АТФ образуется в результате процессов окислительного фосфорилирования, протекающих в дыхательной цепи митохондрий в так называемом «митохондриальном компартменте», незначительная - в результате субстратного фосфорилирования во внемитохондриальном компартменте. Следует отметить, что среди прочих клеточных органелл, митохондрии представляют собой наиболее чувствительные к дефициту О2 внутриклеточные структуры и при развитии гипоксии повреждаются одними из первых [6,14].
Энергетический запас клетки в виде макроэргических соединений и субстратов особенно важен в условиях гипоксии, поскольку поддержание жизнедеятельности органов, тканей и организма в целом возможно только до тех пор, пока дефицит энергии находится на уровне выше критического. При этом объективным показателем эффективности энергетического обмена служит соотношение между количеством синтезированных мак-роэргических соединений и количеством О2, потреблённого в метаболических реакциях. Энергетические преобразования в клетке также во многом зависят от соотношения НАД/НАДН в митохондриях, потенциала фосфорилирования в цитозоле клетки, значения внутримитохондриального рН, напряжения О2 в среде, а также от функционального состояния шунтовых механизмов синтеза энергии в клетке [2,9,12].
Примат роли энергетического обмена в формировании каскада прочих метаболических нарушений, характерных для гипоксии (в частности, его первичность по отношению к свободнорадикальным процессам), знание основных лимитирующих развитие гипоксии участков дыхательной цепи митохондрий (её мишеней), особенностей динамики процесса (распространение нарушений от субстратного участка дыхательной цепи к терминальному), а также их связь с проявлением системных нарушений, позволили выделить 3 основные группы антигипоксантов -корректоров энергетического обмена.
1. Вещества с акцепторными свойствами, формирующие шунтирующие потоки восстановительных эквивалентов на субстратном (НАДН-KbQ) участке дыхательной цепи. Это производные хинонов, рибофлавина, флавинсодержащие соединения растительного происхождения, никотинамид.
2. Активаторы компенсаторных метаболических потоков (сук-цинатоксидазный путь окисления) - сукцинатсодержащие органические соединения, такие как мексидол, лимонтар, реамбирин.
3. Корректоры электронно-транспортной функции цито-хромного участка дыхательной цепи - экзогенные убихинон и цитохром с, аскорбиновая кислота.
Следует отметить, что применение антигипоксантов, способных регулировать энергетические потоки в дыхательной цепи
митохондрий, позволяет достигнуть значительного уменьшения потерь АТФ при одновременном увеличении скорости окисления пиридинов. Всё это также способствует нормализации редокс-потенциала клетки [6,9].
К числу наиболее известных на сегодняшний день классов органических веществ, способных модифицировать энергообразующие процессы в митохондриальном компартменте при гипок-сических состояниях, относятся серосодержащие соединения, которые главным образом представлены аминотиолами - гути-мином и амтизолом [5,12,13].
Изученное нами вещество nQ1104 также является серосодержащим химическим соединением, так как относится к производным аминотиолов - бис^-ацетил-Ь-цистеинато)цинк(П) сульфат октагидрат. Однако особый интерес к нему, как и ко всему ряду исследованных веществ, в значительной степени был обусловлен присутствием в структуре данного комплексного соединения двухвалентного цинка (Zn2+).
Сведения о перспективах разработки нового класса антиги-поксантов на основе смешаннолигандных соединений металлов с аминокислотами, витаминами и другими антиоксидантами встречаются в ряде аналитических и экспериментальных научных работ, выполненных за последние 15-20 лет [4,8,11].
Как ранее было установлено, многие металлопротеины, в том числе и цинксодержащие ферменты, способны принимать активное участие в синтезе нуклеиновых кислот, в белковом, жировом и углеводном видах обмена. Однако, по нашему мнению, при остроразвивающихся гипоксических состояниях указанные механизмы синтеза de novo металлоферментов в силу их инертности не могут вносить значительного вклада в совокупность процессов, обеспечивающих повышение резистентности организма к кислородной недостаточности.
Согласно полученным нами результатам, вещество nQ1104, по-видимому, обладает способностью оптимизировать работу лимитирующих звеньев энергетического обмена в клетке. Это подтверждается в первую очередь существенным замедлением после его введения крысам интенсивности протекания всех изучавшихся видов внутримитохондриального дыхания (Vo, V3 , V4, ^днф), что сопровождалось ожидаемым снижением синтеза АТФ (50 мг/кг - снижение на 56,4%), но при этом протекало без существенной утраты митохондриями мозга способности сохранять собственный энергетический потенциал (V0/V4).
По нашему мнению, внутриклеточными структурами-мишенями антигипоксического действия вещества nQ1104 могут являться, прежде всего, митохондрии головного мозга, сердца, печени. Как показали результаты нашего исследования, принципиальным отличием изученного комплексного соединения цинка с N-ацетил-Ь-цистеином от прочих антигипоксантов аминотио-лового происхождения является его способность оказывать отчётливое угнетающее влияние на скорость протекания метаболических процессов внутри клетки в условиях нормоксии, в то время как гутимин, амтизол, бемитил, как правило, демонстрируют свои защитные свойства только по мере нарастания гипок-сического состояния [13].
Мы выдвигаем гипотезу о том, что наиболее вероятной точкой приложения антигипоксического действия вещества nQ1104 в дыхательной цепи митохондрий является её цитохром-ный фрагмент. Данное предположение основывается на известных фактах, подтверждающих способность Zn2+ заметно ограничивать объёмы электронных потоков в области цитохромов дыхательной цепи на участке b-c вплоть до их полной блокады. Указанный феномен позволяет обеспечить экономичность процессов окислительного фосфорилирования, что в предотвращает преждевременное истощение внутриклеточных резервов, и, в первую очередь, за счёт угнетения чрезмерно быстрого окисления митохондриями НАД-зависимых субстратов. Присутствие Zn2+ в составе молекулы вещества nQ1104, на наш взгляд, при развитии острой гипоксии ограничивает фазную активацию НАД-зависимого окисления в митохондриях головного мозга и, возможно, других энергоёмких органов, что на следующем этапе формирования гипоксии позволяет заметно отдалить развитие последующей фазы угнетения указанного процесса.
Литературные данные косвенно подтверждают высказанную гипотезу в отношении одного из вероятных механизмов антигипоксического действия вещества nQ1104 в ЦНС. Так, С. С. Сергеева и соавт. полагают, что на нейронном уровне про-тективные эффекты аминотиоловых антигипоксантов могут су-
щественно отличаться в способах их реализации. Например, если для гутимина в большей степени характерна пассивная защита нейронов от энергетического дефицита за счёт снижения энерготрат на электрогенез, то, в свою очередь, амтизол способен активно перестраивать мембранные и внутриклеточные процессы для сохранения стабильного энергообеспечения импульсной активности нейронов.
По нашему мнению, вещество л^1104, в соответствии с его структурными особенностями, помимо вышеописанных эффектов, также способно принимать участие в регулировании процессов свободнорадикального окисления в тканях. В отличие от эталонных аминотиоловых антигипоксантов (гутимина, амтизола, бемитила), вещество л^1104 владеет двумя свободными 8Н-группами в составе 2 молекул К-ацетил-Ь-цистеина. Роль сульф-гидрильной группы как участника энзиматических и антиокисли-тельных реакций имеет большое значение в процессах сопряженного катализа, обеспечивающих синхронизацию событий в метаболических, энергетических и информационных биологических потоках. Редокс-превращения 8Н-групп органических компонентов клетки способствуют сохранению показателей гомеостаза на оптимальном уровне. Благодаря наличию 8Н-группы, изученное комплексное соединение способно выступать в качестве редокс-буфера клетки за счёт поддержания в ней восстановленной среды и обеспечения своевременного восстановления 8Н-групп энергообеспечивающих ферментов митохондрий при их окислении. В связи с этим дефицит тиолового редокс-контроля активности ферментов при развитии острой гипоксии, который восполняется в клетке преимущественно в ходе использования тиолдисуль-фидных соединений [8], вполне может быть до определённой степени компенсирован в результате стабилизирующих влияниий вещества л^1104, что можно рассматривать в качестве дополнительного механизма его антигипоксического действия.
Заключение. Таким образом, изученное комплексное соединение - вещество л^1104, благодаря своим особенностям, способно напрямую угнетать интенсивность энергосинтетических процессов в клетках головного мозга. Наиболее вероятный механизм защитного действия комплексного соединения л^1104 реализуется на уровне митохондриального компартмента посредством обратимого уменьшения скорости протекания окислительных реакций в дыхательной цепи, что при развитии острой гипоксии оптимизирует расходование О2 и окисляемых биологических субстратов. Полученные данные свидетельствуют о наличии у вещества л^1104 многокомпонентного нейропротективного действия, обеспечивающего поддержание устойчивой деятельности митохондрий нервных клеток в условиях острого дефицита О2 в окружающей воздушной среде.
Литература
1. Виноградов, В.М. Фармакологическая защита головного мозга от гипоксии / В.М. Виноградов, Б.И. Криворучко // Психофармакология и биологическая наркология.- 2001.- Т.1.- № 1.- С. 27-37.
2. Мембранные механизмы действия антигипоксантов бе-митила и алмида на нейроны моллюсков /А.И. Вислобоков [и др.]// Экспериментальная и клиническая фармакология.- 2003.-Т.66.- №6.- С. 9-11.
3. Грек, О.Р. Метаболизм лекарств и устойчивость к гипоксии / О.Р. Грек // Фундаментальные проблемы фармакологии: Тез. 2-го Съезда Рос. науч. общества фармакологов.- М., 2003.-
Ч. 1-2.- С. 141.
4. Острая гипоксия: механизмы развития и коррекция антиоксидантами / А.В. Евсеев [и др.].- СПб.: Элби-СПб, 2007.- 224 с.
5. Зарубина, И.В. Молекулярная фармакология антигипоксантов / И.В. Зарубина, П.Д. Шабанов.- СПб.: ООО «Изд. Н-Л», 2004.- 368 с.
6. Лукьянова, Л.Д. Митохондриальная дисфункция- типовой патологический процесс, молекулярный механизм гипоксии / Л.Д. Лукьянова // Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспекты.- Москва-Воронеж: Истоки, 2004.- С. 8-51.
7. Новиков, В.Е. Влияние ГАМК-ергических средств на окислительное фосфорилирование в митохондриях мозга при его травматическом отеке / В.Е. Новиков, А.Н. Шаров // Фармакология и токсикология.- 1991.- Т.54, №6.- С. 44^6.
8. Парфёнов, Э.А. Стратегические направления медицинского применения антиоксидантов / Э.А. Парфёнов, Л.Д. Смир-
нов, К.М. Дюмаев // Человек и лекарство: Тез. докл. IX Рос. нац. конгр.- М., 2002.- С. 765.
9. Фактор транскрипции HIF-1-альфа, белки срочного ответа и резистентность мембранных структур в динамике после острой гипоксии / Т.Г. Сазонтова [и др.]// Вестник Российской академии медицинских наук.- 2007.- №2.- С. 17-25.
10. Сергеева, С.С. Действие амтизола и гутимина на дыхательный метаболизм нейрона / С.С. Сергеева, И.Н. Январёва, О.Ю. Урюпов // Фармакология и токсикология.- 1991.- Т.54, №3.- С. 22-24.
11. Сосин, Д.В. Возможность профилактики острой гипоксии новым металлокомплексным соединением nQ1983 /
Д.В. Сосин, А.В. Евсеев, В. А. Правдивцев // Мат. V Всерос. конф. молодых учёных-медиков, организованной Воронежским, Курским и Казанским мед. вузами. 25-26 фев., 2011 г.- Воронеж-2011.- С. 260-261.
12. Шабанов, П.Д. Гипоксия и антигипоксанты / П.Д. Шабанов // Вестник Российской военно-медицинской академии.-2003.- № 1(9).- С. 111-121.
13. Метаболические корректоры гипоксии / П.Д. Шабанов [и др].- СПб.: Информ-Новигатор, 2010.- С. 347-458.
14. Deborah, R.C. Treatment of mitochondrial cytopathies / R.C. Deborah, H.C. Bruce // Seminars in Neurology.- 2001.- Vol.21, N3.- P. 309-325.
15. Mering, T.A. The action of mexidol on the state of conditioned reflex activity after traumatic brain lesions / T.A. Mering // Neuroscience and Behavioral Physiology.- 2003.- Vol.33, N2.-P. 133-138.
INHIBITION OF MITOCHONDRION RESPIRATIVE ACTIVITY AS A POSSIBLE MECHANISM OF THE ANTIHYPOXANT PROTECTIVE
EFFECT
D.V. SOSIN, A.V. YEVSEEV, V.A. PRAVDIVTSEV, M.A. YEVSEEVA
Smolensk State Medical Academy
The inhibitory effect on the brain mitochondrion respiration of the new metal-complex substance nQ1104 was found in experiments on rats. Presumably the protective mechanism of the substance nQ1104 at the threat of acute hypoxia is based on the mitochondria compartment via the reversible decrease of oxidative reactions in the respiratory chain, which optimizes the consumption of oxygen and oxidative biologic substrates under реу conditions of acute hypoxia.
Key words: rat, mitochondrion, oxidative phosphorylation, acute hypoxia, antihypoxant.
УДК 616.728.2-056.2:616-073.75
НОВЫЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ ДИСПЛАЗИИ ТАЗОБЕДРЕННЫХ СУСТАВОВ У ДЕТЕЙ
А.В. СЕРТАКОВА*., О.Л. МОРОЗОВА*, С.А. РУБАШКИН**,
Е.В. ГЛАДКОВА**
Проведено изучение маркеров ремоделирования костной и хрящевой ткани по уровню содержания коллагена I типа, коллагена II типа, аг-грекана, гиалуронана и ростовых факторов (VEGF, FGF) в сыворотке крови и моче у детей с дисплазией тазобедренных суставов в возрасте от 4 мес до 13 лет и у практически здоровых детей без патологии тазобедренных суставов. Показано, что изменение содержания маркеров ремоделирования костной и хрящевой ткани коррелирует со степенью тяжести дисплазии тазобедренных суставов у детей. Использование предложенных маркеров перспективно для оценки степени тяжести и прогнозирования течения заболевания.
Ключевые слова: маркеры ремоделирования костной и хрящевой ткани, дисплазия тазобедренных суставов, дети, ростовые факторы.
В настоящее время распространенность дисплазии тазобедренных суставов (ДТС) составляет 7-25% случаев на 100 новорождённых [5], а частота выявления в роддомах составляет 2-16% [1]. Ряд авторов рассматривает дисплазию тазобедренных суставов как частный случай недифференцированной дисплазии со-
* ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразви-тия России, адрес: ул. Большая Казачья, 112, г. Саратов, 410012, тел.: (8452) 51-15-32, e-mail: meduniv@sgmu.ru.
ФГБУ СарНИИТО (Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии) Минздравсоцразвития, адрес: ул. Чернышевского, 148, г. Саратов, 410002, тел.: (8452) 39-30-51, e-mail: sarniito@yandex.ru
единительной ткани (НДСТ) [2], главным фенотипическим проявлением которого является гипермобильный синдром (пред-вывих, подвывих и вывих сустава). Последствием гипермобильности и диспластических изменений в суставах развиваются различные локомоторные нарушения: вторичные изменения структур тазобедренного сустава с дефектом опорной и двигательной функции, изменение положения таза и нарушение его фронтальной инклинации, искривление позвоночника с развитием сколио-тических деформаций, появление остеохондроза и развитие кок-сартроза [3,8]. В основе феномена НДСТ лежит мутация коллагена и аномальная продукция матрикса соединительной ткани с мультифакториальным типом наследования и различной экспрессивностью генов [2]. Мультифакториальное воздействие неблагоприятных условий среды и плейотропное действие дефектных генов на этапы формирования костно-мышечной системы приводят к дефектам синтеза коллагеновых и матриксных структур тазобедренных суставов, нарушению пространственной конформации, что приводит к грубому нарушению строения [2]. Несмотря на расширение ранних диагностических возможностей выявления патологии тазобедренных суставов (ультразвуковое исследование с допплерометрией, магнитно-резонансная томография), существующие методы имеют ряд недостатков: возрастное ограничение, лучевая нагрузка, отсутствие комплексной оценки состояния отдельных компонентов тазобедренных суставов [4]. В исследовании предлагается использовать в качестве диагностических критериев маркеры ремоделирования костной и хрящевой ткани, а также ростовые факторы, как маркеры ангиогенеза. Биомаркеры ремоделирования костной и хрящевой ткани (коллаген I типа, коллаген II типа, аггрекан, гиалуронан) и факторы роста (УБОР, БОР) имеют важное значение в нормальной формировании и функционировании всех элементов тазобедренного сустава. Так, коллагены I и II типов относятся к «мажорному» семейству коллагенов и организуют более 90% соответственно костной и хрящевой ткани [6]. Повышенная экскреция коллагена I и II типов, свидетельствует о динамическом разрушении костной и хрящевой ткани тазобедренных суставов при дисплазии. Аггрекан в комплексе с полианионом гиалуронаном является базовым протеогликаном гиалинового хряща тазобедренных суставов и обеспечивает способность хряща к динамической деформации при нагрузке. Каркасная сеть из аггрекана и гиалу-ронана ответственна за равномерное распределение питательных веществ в надхрящнице, а также защиту коллагеновых волокон от действия металлопротеиназ [7]. Одними из ключевых маркеров ангиогенеза являются васкулоэндотелиальный фактор роста (УБОР) и фактор роста фибробластов (РОР). По данным ряда авторов нарушение экспрессирования этих факторов приводит к развитию дегенеративных изменений в суставах по типу остеоартрита, остеопороза и остеонекроза [9].
Определение комплексного содержания выше перечисленных маркеров дополняет представления о механизмах инициации диспластических изменений в структурах тазобедренного сустава, позволяет дать наиболее полное представление о механизмах альтерации хрящевой и костной ткани, а также степени ремоделирования кровотока в области сустава.
Цель исследования — изучение изменения содержания маркеров ремоделирования костной (коллаген I типа), хрящевой ткани (коллаген II типа, аггрекан, гиалуронан) и факторов ангиогенеза (УБОР, РОР) у детей с различной степенью тяжести дисплазии тазобедренных суставов.
Материалы и методы исследования. В исследовании были включены 78 детей с дисплазией тазобедренных суставов и 30 здоровых детей (в качестве контрольной группы) без патологии тазобедренных суставов в возрасте от 4 месяцев до 13 лет. В зависимости от клинических проявлений и рентгенологической картины все пациенты были разделены на три группы по степени тяжести дисплазии тазобедренных суставов [1].
Первую группу составили 34 ребенка с легкой степенью тяжести ДТС. При клиническом осмотре имелись следующие признаки заболевания: асимметрия паховых и бедренных складок, гипотония мышц нижних конечностей. На рентгенограммах тазобедренных суставов отмечалось увеличение ацетабулярного индекса до 30°.
Вторая группа включала 28 детей со средней степенью тяжести ДТС с ограничением разведения в тазобедренных суставах. На рентгенограммах были выявлены следующие признаки: дефицит покрытия головки тазобедренного сустава, субхондральный склероз ацетабулярной впадины, торсионно-вальгусная деформация проксималь-
