CC BY
50
experimental gastroenterology
ЦИКЛИЧЕСКОЕ ПОГЛОЩЕНИЕ КАЛЬЦИЯ МИТОХОНДРИЯМИ ПЕЧЕНИ В УСЛОВИЯХ ИММОБИЛИЗАЦИОННОГО СТРЕССА У КРЫС
Саакян И. Р.1, Саакян С. Г.2, Авакян В.М.2
1 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино
2 Национальный институт здравоохранения им. академика С.Х. Авдалбекяна, Минздрава Армении, Ереван
Саакян Ирина Рубеновна. Тел. 8 (903) 623 - 0802 E-mail: saakyan09@mail.ru
РЕЗЮМЕ
Показали вероятность контроля трансаминированием (ТА) Са2+-динамики, сукцинатзависимого накопления-освобождения Са2+, в митохондриях печени в условиях иммобилизационного стресса у крыс. Реализация колебательной динамики СЗ накопления Са2+ реципрокными субстратами ТА, гутаматом и а-кетоглутаратом, и вероятность его устранения ингибитором трансаминаз, аминооксиацетатом, утверждают ТА в роли регуляторного механизма Са2+-гомеостаза и защиты митохондрий от Са2+-перегрузки.
Ключевые слова: митохондрии; гомогенат печени; Са2+-регуляция; трансаминирование; стресс SUMMARY
Demonstrated the probability of control by transamination (ta) Ca2+-dynamics, succinate-dependent accumulation- release of Ca2+ in liver mitochondria in the immobilization stress in rats. Reciprocal regulation and implementation of the TA vibrational dynamics of accumulation of Ca2+ in mitochondria is considered as mechanism to protect the organelles from Ca2+-overload. Keywords: mitochondria;gomogenates liver; Ca2+-regulation; transamination, stress
ВВЕДЕНИЕ
Кальций (Са2+) необходим для активации митохон-дриальных ферментов и стимуляции энергообразования, как и энергия ATP для поглощения Са2+ [1 - 3]. Нарушение этих процессов ведет к структурно-функциональным сдвигам в митохондриях, выявление и коррекция которых представляется актуальным в исследовании физиологических функций и лечении болезней [1 - 3]. Отсюда актуальна разработка методов исследований митохондриальных процессов и выявление средств, делающих традиционную диагностику и лечение более успешным.
Нами был разработан способ исследования ре-ципрокной регуляции фосфорилирующего окисления сукцината и сукцинатзависимого (СЗ) накопления Са2+, чувствительных к изменениям концентрационных соотношений участвующих в трансаминировании (ТА) субстратов, глутамата (ГЛУ) и а-кетоглутарата (КГЛ), в выделенных митохондриях и гомогенатах тканей [4 - 7]. Установлено, что в условиях различных воздействий на организм
показатели поглощения Са2+ информативнее и более чувствительно отражают функциональное состояние тканей, чем традиционные показатели фосфорилирующего окисления [8; 9]. В свою очередь, работа на тканевых гомогенатах вместо стандартных (выделенных) препаратов митохондрий определяет ряд преимуществ: возможность использовать небольшие количества биоптата, приблизить условия функционирования митохондрий к условиям in vivo, повысить информативность в оценке состояния ткани и обеспечить быстроту получения результата.
С помощью рассматриваемого подхода исследовали вероятность управления ТА динамикой СЗ поглощения Са2+ в гомогенатах печени в условиях иммобилизационного стресса у крыс. Исследовали корригирующее действие «Бальзама доктора Мухина» (БМ) (экстракта личинок восковой моли Galleria mellonella, средства с уникальным набором натуральных биорегуляторов) активатора иммунной, антиоксидантной систем организма [10; 11].
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В эксперименте использовали крыс-самцов линии Wistar, содержащихся в виварии в условиях свободного доступа к воде и пище. Крысам раз в сутки в течение четырех недель в качестве пищевой добавки давали (капали на корку хлеба) по 100 мкл БМ, изготовленного [11] на 40%-ном этаноле, или 100 мкл этанола без БМ. Масса тела животных в начале кормления 80 г, в конце 280 - 330 г. В день опыта пищевую добавку не давали. Использовали (для сравнения) интактных, молодых, 200 г. и старых, 500 г. крыс.
Иммобилизацию осуществляли: крыс фиксировали (на брюшке) за конечности, голову — за верхние резцы на прямоугольных планшетах в течение 30 минут и 6 часов в помещении со стандартным освещением при температуре 18 - 20 °С и изоляции от посторонних шумов. В каждом исследовании использовали трех животных: контрольное — подопытное с 30-минутной и 6-часовой фиксацией. Интервал времени между работой с каждой крысой — 1 час. Серии опытов с употреблением БМ и без него чередовали. После декапитации животного печень быстро извлекали и помещали в ледяной буфер гомогенизации, содержащий 120 мМ КС1, 10 мМ КН2РО4, 10 мМ Hepes, ЭДТА1 мМ; pH 7,4. Процедура приготовления, хранения и отбора гомогената дана в работе [8].
Для оценки состояния животного учитывали вид органов-маркеров стресса, тимуса и селезенки, рассчитывали массовые индексы (ИМ органа, мг/г). Ткань тимуса, обычно блестящая, опалового тона, у подопытных крыс (не получавших БМ) выглядела синюшной, тургор слабым, селезенка (чаще в поздние сроки фиксации) красно-багровой, кровенаполненной.
Поглощение Са2+ измеряли с помощью водородного электрода (по противофазному изменению Н+/Са2+-обмена в среде инкубации). СаС12 добавляли порциями по 100 мкМ до спонтанного выброса из митохондрий. Сумма поглощенных катионов характеризует Са2+-емкость. Измерение Са2+-емкости проводили при окислении добавленного: 1) сукцина-та 4 мМ, 2) сукцината + ГЛУ 1мМ, 3) сукцината + ГЛУ + КГЛ 10 мМ, 4) сукцината + ГЛУ10 мМ + КГЛ 10 мМ, 5) сукцината + ГЛУ + аминооксиацетата (АОА) — ингибитора трансаминаз, 2 мМ, 6) сукцината + ГЛУ + малоната 2 мМ. Пробы 2 - 6 ставили до и после синтеза ATP добавленной ADP. Добавление ADP повышает Са2+-емкость, отодвигает (благодаря протекторному действию) время освобождения Са2+ — открытие мембранной поры [12]. Это действие ADP сопоставимо с таковым антиоксиданта ионола [13]. Определенную роль играет и увеличение энергиза-ции органелл ATP. Синтез АТР из ADP приводит к стабильному увеличению Са2+-емкости и времени удержания катиона — повышению устойчивости органелл к Са2+-нагрузкам. Использование ГЛУ и КГЛ повышает чувствительность измерения состояния митохондрий [4; 6; 7]. Среда инкубации общим объем 2 мл содержала: КС1 120 мМ, КН2РО4 1,5 мМ, Hepes 1 мМ; pH 7,4. Измерения проводили в течение
не более 45 минут (после получения гомогената) при 23 °С. Везде Са2+-емкость при окислении только сукцината у контрольных (интактных) крыс принята за 100%. Белок измеряли методом Лоури. Результаты обрабатывали по ¿-критерию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Из данных табл. 1 видно, что у крыс, не употребивших БМ, через 30 минут после стрессового воздействия масса тимуса уменьшилась относительно контроля на 12,3%, селезенки — на 29,5%. При этом у крыс, употребивших БМ, уменьшение массы тканей было незначимым и составило 0,4 и 1,2% соответственно.
У крыс, не получивших БМ, через 6 часов после стрессового воздействия масса тимуса уменьшилась на 23,4%, селезенки, наоборот, возросла на 41,6% от контроля. Отношение массы селезенки к тимусу превышало таковое других групп крыс. При этом у крыс с 6-часовой стресс-реакцией, употребивших БМ, массы тимуса и селезенки незначимо отличались от уровня таковых у крыс с 30-минутным стрессом, не употребивших БМ. Стало быть, прием крысами препарата БМ до иммобилизации способствует снижению выраженности инволюции тимуса и гемостаза в селезенке.
В табл. 2 приводятся среднестатистические данные по накоплению и удержанию Са2+ в гомогена-тах печени у интактных и подвергнутых стресс-реакции крыс, употребивших и не употребивших БМ. Сравниваются результаты по приросту СЗ Са2+ на воздействие реципрокных субстратов ТА, ГЛУ и КГЛ, в пробах до фосфорилирования ADP и после него.
У интактных крыс накопление (и время удержания) Са2+ при использовании сукцината минимальное и, стимулируется при совместном добавлении к сукцинату ГЛУ (+ 85%) и особенно ГЛУ и ADP (+ 163%). Эту активацию КГЛ притормаживает (-43 ± 1,0%). Тормозящее действие КГЛ подвергается обращению избытком ГЛУ и углубляется под влиянием ингибитора трансаминаз, АОА (-54 ± 1,3%). Сходные ответы получены у крыс, употребивших БМ (табл. 2). Реализация значительно большей Са2+-емкости на ГЛУ и меньшей на КГЛ ассоциируется с включением митохондриальной аспартаттранса-миназы (АсТА) печени в управление Са2+-балансом [3 - 6]. Проверка действия этого механизма в условиях стресса показала следующее.
У подвергнутых краткосрочному (30-минутному) стрессу крыс прирост СЗ Са2+-емкости на внесение ГЛУ и ГЛУ+ADP превышает таковой у интактных животных, составив в аналогичных пробах у крыс, употребивших БМ, 128% и 226%, не употребивших БМ — 127 и 204% соответственно.
У крыс с продолжительным (6-часовым) стрессом, употребивших БМ, прирост СЗ Са2+-емкости
Б >■
о
So
1_ ° О К <S 02
U о
Нв п ^
О b
^
I- S
и
га
L Б
га
X
л
<
га
I-
х ш 2 s а ш с и
Таблица 1
МАССЫ ТЕЛА, ТИМУСА И СЕЛЕЗЕНКИ ПРИ ИММОБИЛИЗАЦИОННОМ СТРЕСС У КРЫС. ВЛИЯНИЕ БАЛЬЗАМА МУХИНА (БМ) (М ± m)
Показатели Группы животных (п = 5):
контроль иммобилизационный стресс:
30 минут 6 часов
Масса тела, г
БМ+ 303 ± 5,9 314 ± 9,5 315 ± 5,4
БМ — 323 ± 1,25 322 ± 5,5 310 ± 22,8
Масса тимуса, мг
БМ+ 620 ± 69,5 100% 617 ± 59,5 -0,4 *510 ± 49,0 -17,7
БМ — 627 ± 37,1 100% 550 ± 50,0 -12,3 *480 ± 16,0 -23,4
ИМ тимуса, мг/г
БМ+ 2,04 1,96 1,66
БМ — 2,03 1,71 *1,48
Масса селезенки, г
БМ+ 1,64 ± 0,1 100% 1,62 ± 0,2 -1,2 *1,30 ± 0,15 -20,7
БМ — 1,73 ± 0,1 100% *1,22 ± 0,1 -29,5 *2,44 ± 0,5 +41,0
ИМ селезенки, мг/г
БМ+ 5,41 5,34 *4,29
БМ — 5,35 *3,77 *7,55
Примечание: % соотнесен к весу органа в контроле соответствующей группы (100%); *p = 0,01 к контролю.
Таблица 2
СА2+-ЕМКОСТЬ И ВРЕМЯ УДЕРЖАНИЯ СА2+ В ГОМОГЕНАТАХ ПЕЧЕНИ ПРИ ИММОБИЛИЗАЦИОННОМ СТРЕССЕ У КРЫС. ВЛИЯНИЕ БАЛЬЗАМА МУХИНА (БМ) (М ± т)
Субстрат окисления, мМ Са2+-емкость, %. Время удержания Са2+, минут, п = 5
контроль иммобилизационный стресс
30 минут 6 часов
БМ
- + - + - +
1. С4 + ГЛУ1 185 ± 12,0 / 2,1 ± 0,25 197 ± 6,0 / 2,1 ± 0,4 227 ± 14,0 2,8 ± 0,1 228 ± 4,9 / 3,5 ± 0,2 140 ± 11,0 / 1,7 ± 0,3 240 ± 4,1 / 3,8 ± 0,7
2. С + ГЛУ1 + ADP 261 ± 20,0 / 3,3 ± 0,27 285 ± 10,0 / 3,6 ± 0,3 304 ± 29,0 / 4,1 ± 0,1 326 ± 6,0 / 4,1 ± 0,2 230 ± 14,9 / 2,8 ± 0,16 320 ± 18,0 / 4,5 ± 0,5
3. С + ГЛУ1 + КГЛ 10 + ADP *139 ± 11,0 / 1,8 ± 0,40 *155 ± 7,4 / 1,8 ± 0,10 *173 ± 24,0 / 2,1 ± 0,03 *175 ± 7,1 / 2,3 ± 0,3 *133 ± 12,0 / 1,7 ± 0,03 *168 ± 1,1 / 2,7 ± 0,26
4. С + ГЛУ10 + КГЛ 10 + ADP 228 ± 29,0 / 3,1 ± 0,02 270 ± 6,5 / 3,9 ± 0,2 *192 ± 31,0 / 2,5 ± 0,1 305 ± 17,0 / 4,1 ± 0,1
сэ
1-Л
Примечание: везде % (числитель) рассчитан по отношению к величине Cа2+-емкости с добавленным сукцинатом (С) в контроле (равной 47,0 ± 1,8 нмоль Н+ на мг белка гомогената; Т = 1,1 мин, 100%). Время (знаменатель) в минутах. * p = 0,01 к величине емкости на субстратах (С + ГЛУ + ADP) в соответствующей группе.
на ГЛУ (+ 140%) и ГЛУ+ADP (+ 220%) сходен с таковым у крыс с 30-минутным стрессом, а у крыс, не употребивших БМ, ниже контрольных. Различия между ответами митохондрий названных групп крыс соответствует таковым по введению в организм крысе активирующих (25 мкг на 100 г веса) и/или тормозящих (35 - 100 мкг на 100 г) физиологические функции доз адреналина [8; 9].
Важно заметить, что КГЛ у всех подвергнутых иммобилизационному стрессу крыс ограничивает (-43,6 ± 1,4%) накопление катиона, переводит значение СЗ Са2+-емкости и время удержания катиона в промежуточное положение между относительно высоким уровнем на сукцинате и ГЛУ и низким на одном сукцинате. Под влиянием превышающих доз ГЛУ ограничивающее СЗ Са2+-емкость действие КГЛ обращается, ее показатели возвращаются к уровню, близкому исходному (табл. 2). Амплитуда этих изменений в пробах с внесением ADP относительно проб без ADP высокая и сужается у особей с негативными явлениями в органах-маркерах стресса; напоминает таковые в старости, что ассоциируется с уменьшением активности АсТА в печени. Заметим, у интактных старых крыс (с низкими значениями ИМ тимуса: 0,41 мг/г против 3,1 мг/г у молодых) дозу ГЛУ для полноценного снятия торможения КГЛ СЗ накопления Са2+ потребовалось превысить на 1 - 2 мМ, относительно к таковой у молодых крыс.
Выявлено, что у подвергнутых стресс-реакции крыс ингибитор трансаминаз АОА уменьшает скорость (-23 ± 0,5%) и величину накопления Са2+ (-57 ± 1,2%), сокращает время удержания катиона (-59 ± 2,0%). В то же время АОА не оказывает какого-либо влияния на фосфорилирование ADP в отличие от действия сильного ингибитора окисления сук-цината, малоната, подавляющего и фосфорилирование ADP (-42 ± 0,3%), и накопление Са2+ (-89 ± 0,4%). Действие АОА в отличие от действия КГЛ необратимое. Чувствительность СЗ-накопления Са2+ к влиянию АОА подтверждает вероятность управления ТА Са2+-балансом в условиях стресса у крыс.
Итак, в работе сообщается о реципрокной регуляции ТА активности СЗ-накопления Са2+ в митохондрии печени при иммобилизационном стрессе,
характеризующемся преобладанием адре-нергических влияний [8]. Природные регуляторы реципрокного действия, ГЛУ и КГЛ, при участии АсТА реализуют смену между активацией-торможением СЗ накопления Са2+ (вероятно в «унисон» открытию-закрытию мембранной поры pore flicking); обуславливают стабильность работы и защиту митохондрий от Са2+-перегрузки [7]. Известно, что перегрузка Са2+ путем инициации серии деструктивных циклов приводит к деактивации (с участием Са2+-чувствительных протеаз) митохондриальной АсТА и запуску митоптоза [2; 5; 14]. В работе показано, что устойчивость митохондрий печени к нагрузкам Са2+ среди крыс, подвергшихся интенсивной стресс-реакции на фоне курса приема БМ, выше, чем без БМ (табл. 2). Выявленное нами мембранопротекторное действие препарата БМ ассоциируется с благотворным влиянием известных природных антиокси-дантов на эндогенные мембранные системы и биоэнергетику печени [15; 16]. Физическая и функциональная сохранность митохондри-альной мембраны предполагает удовлетворительную регуляцию ТА Са2+-гомеостаза.
ВЫВОДЫ
Показали высокую чувствительность и информативность показателя Са2+-емкости и времени удержания Са2+ в тестировании функционального состояния митохондрий печени. Показали вероятность контроля ТА Са2+-динамики, СЗ накопления-освобождения Са2+ в митохондриях печени в условиях иммобилизационного стресса у крыс. Реципрокная регуляция и реализация с участием субстратов ТА (ГЛУ и КГЛ) переключения между накоплением-освобождением Са2+ и вероятность устранения накопления Са2+ ингибитором трансаминаз, аминооксиацетатом, утверждают ТА в роли естественного регуляторного механизма Са2+-гомеостаза и защиты митохондрий печени от Са2+-перегрузки.
Б >■
о
So
1_ о о а <S 02
U о
Нв
n È
О ¡D
^
I- ä
и
га
L Б
га
X
л
<
га
IX
ш 2 s а ш с и
ЛИТЕРАТУРА
1. Brookes, P. S, Yisang, Y., Robotham, J. L., et. al. // Am. J. Physiol. — 2004. — Vol. 287. — C817 — C833.
2. Chen, X., Zharig, X., Kubo, H., et. al. // Circ. Res. — 2005. — Vol. 11. — P. 1009 - 1017.
3. Contreras, L., Satrustegui, J. // J. Biol. Chem. — 2009. — Vol. 284. — P. 7091 - 7099.
4. Саакян Г. Г., Саакян И. Р. // Биомед. Химия. — 2008. — Т. 54,
№ 6. — С. 696 - 705.
5. Саакян Г. Г., Саакян И. Р., Шердукалова Л. Ф. // Мед. наука Армении. — 2011. — Т. 11, № 3. — С. 62 - 74.
6. Саакян И. Р., Камалян Р. Г. // Доклады НАН Армении. — 2004. — Т. 104, № 3. — С. 234 - 241.
7. Саакян И. Р., Саакян Г. Г. // Биомед. Химия. — 2006. — Т. 52,
№ 3. — С. 287 - 297.
8. Саакян И. Р., Саакян Г. Г., Кондрашова М. Н. // Биохимия. — 2001. —
Т. 66, № 7. — С. 976 - 984.
9. Саакян И. Р., Шердукалова Л. Ф., Саакян Г. Г. // Биомед. Химия. — 2003. — Т. 49, № 5. — С. 463 - 469.
10. Овсепян А. А., Бенедиктова Н., ЗахарченкоМ. В. и соавт. // Вест. нов. мед. технологий. — 2009. — Т. 14, № 1. — С. 170 - 179.
11. Патент 2038086 РФ. Способ получения биологического продукта из личинок большой восковой моли / Н. А. Спиридонов, А. К. Рачков, С. А. Мухин, М. Н. Кондрашова / 27.06.1995 Бюлл. № 18.
12. AndreevaL., Crompton V. // Eur. J. Biochem. — 1994. — Vol. 221. — P. 262 - 268.
13. Саакян И. Р., Гогвадзе В. Г., Сирота Т. В., Кондрашова М. Н. // Биофизика. — 1998. — Т. 43, No. 4. — С. 580 - 587.
14. Ozaki T., Vamas T., Ishiguro S. // Archiv Biochem. Biophys. — 2011. —
Vol. 507, No. 2. — P. 254 - 261.
15. Lenaz G., D'Aurelio V., Pich V. et al. // Biochim. Biophys. Acta. — 2000. — Vol. 1459. — P. 397 - 404.
16. Fernandez-Ayala, D. J. M., Brea-Calvo, G., Llopez-Lluch, G., Navas, P. // Biochim. Biophys. Acta. — 2005. — Vol. 1713. — P. 129 - 137.
LH
