CC BY
18
метах - вещественных доказательствах в результате действий следствия или экспертных поисков. На первом этапе экспертиза волос ставит своей задачей доказательство принадлежности волос человеку и установление их региональной природы.
Вопрос идентификации волос, то есть установления их происхождения от определенного лица, морфологическим исследованием не решается. Такая задача ставится перед молекулярно-генетической экспертизой. Эта экспертиза не является простой, так как даже вырванный волос может не содержать достаточного количества яд-росодержащих клеток, которые необходимы для мультиплексного STR-анализа. Еще меньше шансов предоставляют выпавшие и срезанные волосы. В процессе развития волоса происходит кератинизация эпителиальных клеток и в стержне волоса ядерная ДНК подвергается активной деструкции. Однако в редких случаях процесс деструкции может замедляться, оставляя в стержне волоса достаточное для анализа количество ядерной ДНК. Предполагается, что это связано с экспрессией ДНКазы 1L2, но механизм понижения ее активности не ясен.
Наличие в стержне волоса остатков ядерной ДНК делает перспективными попытки типировать расположенные на хромосомах маркеры. Показано, что для оценки целесообразности типирования стержня волоса может применяться окраска флуоресцентными красителями, такими как Hoechst 33258 или DAPI. Окрашенные ядра в этом случае могут быть визуализированы, количество их оценено и принято решение о рациональности STR-анализа. Если получение профиля ядерных локусов в стержне волоса остается достаточно непростой задачей, то определение митотипа может быть более успешным. Благодаря копийности митохондрий митохондри-альной ДНК в стержне волоса остается достаточно для проведения ее анализа. И хотя особенности наследования митохондриальной ДНК не обеспечивают индивидуализацию на уровне ядерных локусов, выявленный митотип несет весомую информацию и доказательную силу.
Экспертиза № 1 назначена по факту наезда легкового автомобиля на пешехода, двигавшегося по пешеходному переходу. После совершения наезда автомашина покинула место происшествия. Пострадавший мужчина скончался в больнице. В тот же день был обнаружен автомобиль, с ветрозащитного козырька которого изъят пучок фрагментов волос. На экспертизу поступили 30 фрагментов волос с головы человека, отделенные предметом с острым краем, длиной до 1,5 см. Требовалось установить принадлежность данных волос пострадавшему мужчине. Фрагменты волос отмывались в деионизованной воде и 95о-м этиловом спирте, были объединены по 10 штук в пробирку (объекты № № 1, 2, 3). Фрагменты лизировали в течение 18 часов при 56 °C с протеиназой К (к/к 0,3 мкг/мкл) и 0,039 М дитиотреитолом. Далее проводили депротеини-зацию (фенол: фенол/хлороформ: хлороформ) и концентрировали ДНК изопропиловым спиртом в присутствии ацетата натрия. Количественная оценка и качественный анализ полученных препаратов ДНК проводились методом полимеразной цепной реакции с применением наборов реагентов «Quantifiler Human DNA Quantification Kit» производства Applied Biosystems, США. Концентрация препаратов составила 0,06 нг/мкл, 0,03 нг/мкл и 0,02 нг/мкл. Все три объекта генотипированы по комплексу STR-систем, получен полный профиль каждого из объектов исследования. Сравнительный анализ генотипа фрагментов волос с генотипом потерпевшего мужчины выявил их идентичность. В результате проведения экспертизы фрагментов волос получены доказательства участия
автомобиля в данном дорожно-транспортном происшествии.
В экспертизе № 2 также необходимо было идентифицировать единичные волосы из салона автомобиля. Водитель автомобиля обвиняется в совершении столкновения с двумя мотоциклами со смертельным исходом для обоих водителей мотоциклов. По версии находившейся в автомобиле женщины Л., за рулем автомобиля был незнакомый ей мужчина, покинувший место происшествия. Для уточнения местонахождения в автомобиле гражданки Л. следствием представлены на исследование шесть волос с подголовника переднего пассажирского сидения автомашины. Все волосы длиной от 2,0 до 2,7 см имели ороговевшие колбовидные луковицы без влагалищных оболочек. Генетическому анализу были подвергнуты 3 волоса. Концентрация аутосомной ДНК составила от 0,003 до 0,006 нг/мкл. Попытка установить 8ТЯ-профиль не привела к положительному результату. Для анализа гипервариабельных последовательностей митохондриальной ДНК применяли набор реагентов М1ТОРЬБХ производства ООО «Гордиз», РФ. Для трех волос установлены одинаковые митотипы, отличающиеся от митотипа гражданки Л.
ВЫВОДЫ
Таким образом, исходя из собственного опыта работы и ряда литературных данных может быть предложен алгоритм работы с волосами-уликами.
• По возможности проводить 8ТК.-анализ волос-улик, в том числе не имеющих корневого конца, а только стержневую часть. Оценка шансов установить 8ТК.-профиль может быть осуществлена измерением концентрации хромосомной ДНК с помощью ПЦР в реальном времени и использованием технологии флуоресцентной окраски волоса для визуализации ядросодержащих клеток.
• Наиболее перспективным подходом для анализа волос-улик является установление статуса митохондриаль-ной ДНК - митотипа. Необходимо учитывать особенности матрилинейного наследования митохондриального генома.
ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТЬ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК
ИЗ БОЛЬШОГО ОБЪЕМА МАТЕРИАЛА.
СЛУЧАИ ИЗ ПРАКТИКИ_
А. А. Ермолаева
ГБУЗ ТО «Областное бюро судебно-медицинской экспертизы», Тюмень Доклад освещает различные подходы к выделению ДНК из большого объема материала, такого как тампоны и смывы, на примерах из судебно-медицинской экспертной практики.
Ключевые слова: выделение ДНК, большой объем материала, половые преступления В настоящее время молекулярно-генетическое исследование стало одним из важнейших методов судебно-медицинской экспертизы. Так, только в Тюменском областном бюро его доля в период с 2014 до 2019 год выросла в 2 раза. Широкое внедрение генетического метода исследования позволяет сокращать сроки расследования преступлений, повышать их раскрываемость и избегать следственных ошибок.
Между тем ряд вопросов, возникающих в практике судебно-медицинского эксперта, нуждается в обсуждении. Одним из них является вопрос о количестве материала, который следует взять на исследование. В случае, когда эксперту предоставлено предельно малое количество материала, эта проблема не актуальна, так как однозначно возникает необходимость полного уничтожения объекта
в процессе исследования. Однако если материала достаточно, эксперт избегает того, чтобы полностью забирать его на исследование, руководствуясь необходимостью сохранить часть материала для возможных дальнейших исследований, не допустить получения «перегруженного» препарата ДНК, а также избежать получения смеси различных генетических профилей в результате исследования. Тем не менее при исследовании останков человека (зубы, ногти, волосы), а также в тех случаях, когда заведомо известно, что подавляющее количество биологических следов на исследуемом объекте может принадлежать одному человеку (например, на предметах личной гигиены) или при проведении экспертизы по половым преступлениям, совершенным одним лицом, взятие минимального количества материала может привести к тому, что необходимое для идентификации количество ДНК не будет получено и, как следствие, будет сделан ошибочный вывод о непригодности материала для исследования.
Для рассмотрения данного вопроса нами произведен анализ материалов практических экспертиз ГБУЗ ТО «ОБСМЭ». В одной из них была поставлена задача исследовать останки трупа неустановленного мужчины. Исследовались препараты ДНК, выделенные из одного и из пяти зубов. Анализ первого препарата показал содержание в нем аутосомной ДНК в количестве 0,004 нг/мкл, в то время как исследование второго препарата (выделенного из пяти зубов) - 0,06 нг/мкл, что позволило получить профиль по 18 из 21 исследованного локуса.
В следующей экспертизе, назначенной по половому преступлению, исследованию подвергался тампон с содержимым влагалища 12-летней давности. Из тампона был взят на исследование кусочек размером 0,5x0,5 см. Оставшийся материал тампона был также исследован, но уже в полном объеме. При этом в первом препарате концентрация ДНК У-хромосомы составила 0,0006 нг/мкл, а во втором препарате - 0,005 нг/мкл, что позволило получить почти полный гапло-тип подозреваемого.
Еще одна экспертиза проводилась по факту мужеложства с последующим убийством. Следователем был взят смыв с полового члена обвиняемого, точечные вырезки из которого были подвергнуты молекулярно-генетическому исследованию. При этом ДНК в концентрации, достаточной для идентификации, выявлена не была. В результате исследования данного объекта повторно с использованием всего объема материала был получен смешанный профиль обвиняемого и потерпевшего.
Подобные результаты неоднократно были получены при исследовании аналогичных объектов.
Во всех упомянутых случаях выявленные нами генетические профили позволили правоохранительным органам успешно завершить расследование.
ВЫВОДЫ
Таким образом, при получении неудовлетворительных результатов при использовании стандартных протоколов для выделения ДНК в тех случаях, когда эксперт обладает достаточно большим количеством материала для исследования и при этом не предполагает наличия в нем генетического материала множества не интересующих следствие лиц, мы хотим показать целесообразность забирать для исследования как можно больший его объем, вплоть до полного, при этом грамотно модифицировать протоколы для выделения ДНК, рекомендованные фирмами-производителями современных методов идентификации личности.
СЛОЖНОСТИ АНАЛИЗА И ИНТЕРПРЕТАЦИИ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ ДЕГРАДИРОВАННОЙ ДНК. СЛУЧАИ ИЗ ПРАКТИКИ
Е. Н. Разумов
ГБУЗ ТО «Областное бюро судебно-медицинской экспертизы», Тюмень В докладе освещены трудности, с которыми сталкивается судебно-медицинский эксперт при работе с деградированной ДНК. На примерах из практики продемонстрированы случаи ошибочности первоначально полученных данных, доказана необходимость установления стабильности и воспроизводимости выдаваемых экспертом результатов, что достигается применением нескольких систем типирования ДНК.
Ключевые слова: деградированная ДНК, ПДАФ-анализ, ПЦР, молекулярно-генетические системы, типирование ДНК
С появлением в ГБУЗ ТО «ОБСМЭ» высокотехнологичного оборудования, позволяющего проводить судебно-медицинские экспертизы идентификации личности и установления родства с использованием индивидуализирующих молекулярно-генетических систем на основе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК, меченных флуоресцентными красителями, правоохранительными органами стали часто назначаться экспертизы по делам прошлых лет (в основном по установлению личности), где объектом исследования выступает биологический образец трупа неизвестного лица, содержащий существенно деградированную ДНК. При этом практически все предоставляемые образцы ранее исследовались в молекулярно-генетических лабораториях иных ведомств, но по каким-то причинам по ним не были получены удовлетворительные результаты. Большинством образцов, предоставляемых на исследование, являются костные останки, чаще всего черепа, которые подвергались длительной термической обработке (вывариванию) в течении нескольких суток с целью подготовки их к медико-криминалистическому исследованию (реконструкции лица, поиску повреждений). Вследствие этого, несмотря на относительно небольшое время, прошедшее с момента смерти (трупы обнаружены в первом десятке двухтысячных годов) и удовлетворительный внешний вид костных останков, выделенная из них ДНК, как правило, имеет высокую степень деградации.
При анализе ПДАФ-профиля препаратов ДНК, экстрагированных из такого рода объектов, эксперт сталкивается с рядом трудностей, обусловленных следующими феноменами: крайне низкий детекционный порог или же полное отсутствие флуоресцирующего сигнала «длинных» амплификационных фрагментов; дисбаланс и выявление более двух аллелей внутри локусов; выпадение одних и появление других аллелей в результате повтора ПЦР с применением тех же параметров. Использование в нашей практике не одной, а различных молекулярно-генетических систем типирования, в том числе и специализированных для деградированной ДНК, нередко позволяло получать стабильно воспроизводимые результаты и с высокой степенью уверенности высказываться об индивидуализирующих генотипических признаках, установленных в таких образцах. При этом было замечено, что достаточно часто некоторые первоначально полученные данные (аллели в некоторых локусах), представляющиеся вполне удовлетворительными, впоследствии при постановке повторных ПЦР, как с использованием тех же параметров и систем, так и при изменении таковых, не подтверждались. То есть данные амплификаци-онные фрагменты (аллели), по всей видимости, являются
