CC BY
66
МЕДИЦИНСКИЙ ВЕСТНИК СЕВЕРНОГО КАВКАЗА, № 2, 2011
© Коллектив авторов, 2011 УДК 599.731.1:611-013.85
ТРИПСИНИЗАЦИЯ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ТКАНИ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК, ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПАРОДОНТА
И. А. Базиков, А. Л. Гукасян, В. А. Зеленский Ставропольская государственная медицинская академия
Несмотря на большое количество методов лечения, ведение больных с патологией паро-донта является сложной и трудоёмкой задачей. В настоящее время нет оптимальных методов воздействия на патогенез воспалительных заболеваний пародонта, поэтому проблема адекватного лечения воспалительно-деструктивных процессов в нем продолжает оставаться актуальной.
Имеются данные, свидетельствующие о большой роли клеточных культур различного происхождения в эпителизации ран [2], в том числе о применении культивированных in vitro фибробластов. Разработан способ лечения воспалительно-деструктивной формы пародонтита с использованием культуры ал-лофибробластов человека, заселенных на твердую мозговую оболочку [1]. Пересаженные аллогенные фибробласты оказывают непосредственное влияние на заживление ран [6] и на эпителизацию [3], вероятно, за счет способности продуцировать коллагены I и II типов [7], компоненты внеклеточного матрикса: ламинин, нидоген, тинасцин, хондроитин-4-сульфат, протеогликан [4], фибронектин [5], некоторые факторы роста.
Для нивелирования этико-правовых моментов клеточной терапии и упрощения методики получения клеток целесообразно применение ксеногенных клеток - фибробластов животного происхождения, получаемых, в частности, из эмбриональных и плацентарных тканей, содержащих до 80-90% региональных стволовых клеток (фибробластов) и запускающих регенераторные процессы с помощью продуцируемых ими факторов роста (регуляторных пептидов) и цитокинов.
Для выращивания однослойных культур клеток необходима суспензия, полученная путём обработки тканей протеолитическим ферментами (трипсин, панкреатин, коллагеноза и др.). Трипсинизацией достигается получение отдельных клеток или небольших агрегатов путём переваривания трипсином межклеточного склеивающего белкового вещества.
Методика трипсинизации тканей постоянно усовершенствуется за счет способов перемешивания
Базиков Игорь Александрович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии СтГМА, тел.: (8652)352475; e-mail: [email protected].
Гукасян Арам Лаврентьевич, соискатель кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии СтГМА, главный врач МУЗ «Детская стоматологическая поликлиника №3», главный детский стоматолог г.Краснодара, тел.: (861)2260903; e-mail: [email protected].
Зеленский Владимир Александрович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой детской стоматологии и ортодонтии ИПДО СтГМА, тел.: (8652)263310; e-mail: [email protected].
фрагментов тканей, температурного режима, длительности переваривания трипсином и др. Для каждого типа тканей эти параметры должны быть подобраны индивидуально.
Цель настоящего исследования состояла в подборе оптимальных условий выделения и трипсинизации плацентарной ткани свиньи для получения однослойной культуры клеток ксенофибробластов.
Материал и методы. Объектом исследования служили плацентарные ткани здоровых животных элитной свиноводческой фермы «Кочубеевское» Ставропольского края. Забор ткани осуществлялся в стерильных условиях при опоросе, и в течение часа ткань доставлялась в лабораторию. Для выращивания тканевых культур отработаны варианты трипсинизации 30 плацент.
Плаценты транспортировал в стерильном сосуде с солевым раствором и антибиотиками. В лаборатории отделяли плаценту от хориона и амниотической оболочки, начиная с края отрыва в направлении места прикрепления пуповины, переносили в сосуд, содержащий 300 мл фосфатно-буферного раствора или раствора Хэнкса (рН 7,2), промывали в течение 1-2 минут, затем переносили в другой сосуд с раствором Хэнкса. После 3-4 кратного отмывания в растворе Хэнкса плаценту измельчали на кусочки, размером 2 х 2 см. Использовали фрагменты плаценты со стороны пуповины, содержащие максимальное количество клеток плода. Кусочки отмывали от эритроцитов и сыворотки, заливали 0,25% раствором трипсина и переносили в колбу, куда доливали 150 мл трипсина.
Эффективность трипсинизации плаценты свиньи изучали при различных температурах и различных режимах сбора трипсинизированной ткани. Трип-синизацию проводили 0,25% раствором Дифко (на фосфатном буфере) на магнитной мешалке. Раствор трипсина приготовляли следующим способом. Растворяли 1 г трипсина Дифко в 100 мл фосфатного буферного раствора, фильтровали через бумагу или слой марли и ваты, вторично фильтровали через фильтр Зейца. При фильтровании брали для посева на мясо-пептонный бульон по 0,5 мл из каждых 100 мл. Разливали по 50 мл во флаконы. В замороженном (-20° С) виде раствор хранили в холодильнике, перед употреблением оттаивали и разводили 1:4 стерильным фосфатно-буферным раствором или раствором Хэнкса.
Результаты и обсуждение. В сравнительных опытах на большом числе плацент свиней были использованы следующие варианты трипсинизации:
1. Трипсинизация с подогревом до 35-37° С со сбором сливов трипсина с клетками через каждые 3-5 минут, с последующей заменой свежей порцией подогретого трипсина. Длительность трипсинизации составляла 3-3,5 часа.
и ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
2. Трипсинизация при 4° С без сливов. Процесс трипсинизации продолжался 16-18 часов.
3. Трипсинизация при 4° С со сливами через каждые 2-3 часа. К остаткам ткани в колбе каждый раз добавляли по 100-150 мл трипсина.
4. Трипсинизация при 37° С со сливами. Сбор трипсинизированных клеток проводили по мере их накопления, обычно через каждый час. Длительность трипсинизации составляла 3-4 часа.
5. Трипсинизация при комнатной температуре. Сливы брались, как и в предыдущем варианте трипсинизации. Обычно брали 4-7 сливов в течение 3 часов.
Основным критерием выбора варианта трипсинизации являлось получение максимального количества клеточных структур в кратчайшие сроки. Особое внимание было обращено на возможно раннее отделение клеток от трипсина с помощью центрифугирования и последующее отмывание клеток. Сохранению жизнеспособности клеток способствовало предварительное разведение перед центрифугированием первичной взвеси клеток питательной средой с бычьей сывороткой в отношении 1:1.
Установлено, что трипсинизацию целесообразно проводить однократно на магнитной мешалке в течение 3 часов при 18-20° С или 50-60 минут при 37° С, после чего добавлять равный объём холодного (4° С) раствора Хэнкса для прекращения переваривания и уменьшения густоты желеобразной массы. Клеточную взвесь необходимо фильтровать через 2 слоя марли в большие центрифужные стаканы и центрифугировать при 600 об./мин. в течение 20 минут с последующим отмыванием клеток. Образовавшиеся осадки в последующем ресуспендировали в среде 199 с 10-15% телячьей сывороткой. Клеточную взвесь разливали по 300 000 клеток в пробирки или по 25-30 миллионов клеток в плоские матрасы емкостью 1000 мл с приготовленной экспериментальной средой.
Заключение. Отработаны оптимальные методы выделения, забора и обработки ткани плаценты
свиньи. Подобраны варианты трипсинизации ткани плаценты свиньи для наибольшего выхода клеток ксенофибробластов. При таком варианте трипси-низации клетки обладали высокой способностью к размножению. Средний выход клеток был максимален и составил 115 миллионов клеток на 1 г ткани. Проведённые исследования дают возможность перейти к этапу подбора состава питательных сред для культивирования стволовых клеток тканевого происхождения.
Литература
1. Рунова, Г.С. Использование культивированных аллофибробластов в комплексном лечении заболеваний пародонта (клиникоэкспериментальные исследования): Автореф. дисс. ... канд. мед. наук / Г.С. Рунова. - М.: РГБ, 2000. - 12 с.
2. Туманов, В.П. Морфологический анализ клеточного состава ожоговой раны при трансплантации культивированных аллофибробластов / В.П. Туманов // Материалы международного симпозиума. - Саратов, 1998. - 40 с.
3. Coulomb, B. Influence of human dermal fibroblasts on epidermalization / B. Coulomb, C. Lebreton, L. Dubertret // Invest. Dermatol. - 1989. - Vol.92, №1. - P. 122-125.
4. Halfter, W. Deposition of extracellular matrix along the pathways of migrating fibroblasts / W. Halfter,
D. Liverani, M. Vigny // Cell Tissue Res. - 1990. -Vol.262, №3. - Р 467-481.
5. Matsura, S. The biological effect of fibronektin /
S. Matsura, S. Hakamori // J. National Cancer Inst. - 1983. - Vol.71. - P. 231-251.
6. Ross, R. The connective tissue fiber forming cell / R. Ross // J. Cell. Biol. - 1968. - Vol.38. -P. 1-75.
7. Varga, E. Connective tissue metabolism including cytokines or proliferation by fibroblasts /
E. Varga // Biochem. J. - 1987. - Vol.247. -P. 597-604.
ТРИПСИНИЗАЦИЯ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ТКАНИ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК, ИСПОЛЬЗУЕМОЙ
ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПАРОДОНТА
И. А. БАЗИКОВ, А. Л. ГУКАСЯН,
В. А. ЗЕЛЕНСКИЙ
Подобраны оптимальные условия выделения и трипсинизации плацентарной ткани свиньи для получения однослойной культуры клеток ксенофибробла-стов. Для выращивания тканевых культур отработаны варианты трипсинизации 30 плацент. Подобранный вариант трипсинизации позволил получить клетки, обладающие высокой способностью к размножению. Средний выход клеток был максимален и составил 115 миллионов клеток на 1 грамм плацентарной ткани. Проведённые исследования дают возможность перейти к этапу подбора состава питательных сред для культивирования региональных стволовых клеток тканевого происхождения.
Ключевые слова: трипсинизация, плацентарная ткань, фибробласты
TRYPSINIZATION OF THE PLACENTAL TISSUE OF ANIMAL ORIGIN FOR RECEPTION OF SINGLE-LAYERED CULTURE OF CELLS XENOFIBROBLASTS BAZIKOV I. A., GUKASYAN A. L.,
ZELENSKI V. A.
Optimum conditions for isolation and trypsinization of placental tissue of a pig for reception of single-layered culture of cells xenofibroblasts are selected. For cultivation of tissue cultures some variants of trypsinization of 30 placentae are fulfilled. The selected variant of trypsinization has allowed to receive the cells having high ability to duplication. The average output of cells was maximal and has made 115 million cells per 1 gram of placental tissue. The carried out researches enable to proceed to a stage of selection of nutrient mediums structure for cultivation of regional stem cells of tissue origin.
Key words: trypsinization, placental tissue, fibroblasts
