CC BY-ND
23
октябрь МО (307) ЗНиСО
39
I—Г © Водопьянов С.О., Водопьянов А.С., Писанов Р.В., Иванов С.А., Мишанькин Б.Н., Олейников И.П., 2018
¡=£ УДК 579.843.1:575.25:612.017.4:002.5/6
ü ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ОСТРОВКА VcB ^ V. CHOLERAE МЕТОДОМ ПОЛНОГЕНОМНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ
С.О. Водопьянов, А.С. Водопьянов, Р.В. Писанов, С.А. Иванов, Б.Н. Мишанькин, И.П. Олейников
EJ ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора,
ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, Россия
Проведен анализ экспрессии генов V. cholerae, входящих в состав островка патогенности VcB, с помощью приема полногеномного секвенирования транскриптома. Островок обнаружен только у tcpA+ холерных вибрионов и расположен на второй хромосоме. В работе использовали два штамма V. cholerae Ol ctxA+ tcpA+ и один штамм V. cholerae Ol ctxA- tcpA-. Пул суммарной РНК выделяли по методике, основанной на дифференциальном осаждении, в присутствии ионов лития. В суммарном пуле секвенированной РНК была идентифицирована транслируемая РНК более 3 500 известных генов холерного вибриона. В составе пула суммарной
РНК, выс еленной из
двух токсигенных штаммов, обнаружены РНК-транскрипты пяти генов, входящих в островок патогенности VcB, исключая ген VCA0282, идентифицированный ранее как ISVch5-транс-
юй РНК из штамма V. cholerae Ol ctxA- tcpA- не обнаружены
пранскрипты двух генов - ранее описанного УСА0282-транспозазы и УСА0283. Возможным объяснением может быть существование копий этих генов в других участках генома вибрионов
позаза. В составе пула суммарной РНК из штамма т о
ctx- tcpA-.
Ключевые слова: V. cholerae, островок VcB, транскриптом, полногеномное секвенирование.
S.O. Vodop'janov, A.S. Vodop'janov, R.V. Pisanov, S.A. Ivanov, B.N. Mishan'kin, I.P. Olejnikov □ TRANSCRIPTION ANALYSIS OF GENE EXPRESSION ISLAND VcB V. CHOLERAE BY METHOD OF FULL-GENOMIC SEQUENCING □ Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute, 117/40, M. Gorky str., Rostov-on-Don, 344002, Russia.
The aim of the study was to analyze the expression of V. cholerae genes that are part of the VcB island by means of full-genomic sequencing of the transcnptome. The VcB island is localized on the second chromosome in all toxigenic vibrios studied and is absent in the atoxigenic apiliated strains. Two strains of V. cholerae O1 ctxA+ tcpA+ and one strain V. cholerae O1 ctxA- tcpA- were studied. The pool of total RNA vibrios was isolated by a technique based on differential precipitation in the presence of lithium ions. In the total pool of sequenced rNa, RNA encoded in the order of 3 500 by known cholera vibrio genes was identified. In a pool of total RNA from two ctx + tcpA + strains RNA transcripts were found for the five genes included in the VcB island, excluding the VCA0282 gene, previously identified as the ISVch5-transposase. In the the pool of total RNA from the ctx- tcpA- strain no transcripts of the two genes previously described as VCA0282-transposase and VCA0283 were detected. A possible explanation may be the existence of copies of these genes in other parts of the genome of the ctxA- tcpA-V. cholerae.
Key words: V. cholerae, VcB ISLAND, transcript, whole genomic sequencing.
На основании ежегодного мониторинга контаминации холерными вибрионами О1- и 0139-серогрупп поверхностных водоемов Российской Федерации получены данные о возможности длительного сохранения нетоксигенных холерных вибрионов в некоторых водных объектах с определенными эколого-гигиеническими условиями, что, однако, не исключает вероятность их заносов [3, 5]. Анализ УКТЯ-генотипов выделенных культур позволил сделать вывод о возможном длительном пребывании вибрионов в водных объектах [3, 5].
Одним из генетических признаков аутох-тонных о1хЛ- 1орЛ—штаммов V. еко1егае 01, выделенных на территории Российской Федерации, является отсутствие островка патоген-ности УоБ. У токсигенных штаммов эта генетическая структура локализована на второй хромосоме [1]. В составе островка УоБ локализовано шесть генов, возможная роль которых в реализации патогенных свойств вибрионов остается неизученной, что делает целесообразным их углубленное изучение с использованием современных методов молекулярной биологии. Одним из таких методов является транс-криптомный анализ экспрессии генов.
Транскриптом - совокупность всех транс-криптов, синтезируемых клеткой, включая ин-
формационные РНК и некодирующие РНК. Анализ транскриптома с помощью приема полногеномного секвенирования является одним из наиболее точных и чувствительных методов оценки тонких регуляторных механизмов бактериальной клетки. Изучение транскриптома позволило охарактеризовать ответ различных вибрионов на условия внешней среды и макроорганизма [7, 13].
Цель исследования - анализ экспрессии генов V. еко1егае, входящих в состав островка УоБ, с помощью приема полногеномного сек-венирования транскриптома.
Материалы и методы. В работе использовали клинические токсигенные (о1хЛ+ 1орЛ+) штаммы V. еко1егае О1 № 569В, 5879 и атокси-генный (ЛхА- 1орЛ-) штамм V. еко1егае О1 № 20000, выделенный из реки Темерник в 2016 году. Культуру каждого штамма засевали в 10 мл жидкой питательной среды (синказная, синтетическая, триптоновая, ЬБ, ЛК1) в концентрации 10 . Культивирование проводили с принудительной аэрацией на шейкере 1 200 об ./мин при 33 °С в течение 16 часов [2]. Далее из каждой пробы отбирали по 1 мл культуральной среды, клетки в планктонной фазе осаждали центрифугированием при 14 000 об./мин при 4 °С и использовали для
40
ЗНиСО октябрь №>10 (307)
выделения РНК по оригинальной авторской методике, основанной на дифференциальном осаждении в кислых условиях биополимеров бактерий в присутствии ионов лития. Синтез кДНК проводили с помощью набора «Реверта» (ИЛС, Москва). Полногеномное секвенирование проводили на секвенаторе MiSeq (Illumina) [4].
Оценку первичных данных секвенирования проводили с использованием программы FastQC [6]. Для тримминга и коррекции ридов использовали алгоритмы Trimmomatic [8] и Lighter [10]. Анализ транскриптома проводили с помощью программ TopHat [11] и Bowtie [9]. Авторское программное обеспечение для обработки данных разрабатывали на языках программирования Java и Python.
Количественный анализ экспрессии генов проводили по показателю FPKM (fragments per kilobase per million mapped reads), рассчитываемому по алгоритму Cufflinks [12].
Результаты исследования. В суммарном пуле секвенированной РНК трех исследованных штаммов в планктонной форме, выращенных в различных условиях, с помощью авторской программной обработки была идентифицирована РНК, кодируемая примерно 3 500 известными генами холерного вибриона. Следует отметить, что спектр экспрессируемых генов у различных изученных штаммов несколько варьировал. Так, в структуре генома штамма 5879, использованного в настоящем исследовании, ранее было идентифицировано 3 699 генов (GenBank Accession Number PQBQ00000000.1). В то же время в геномах некоторых штаммов V. cholerae различными группами авторов выявлено от 3 504 (штамм 16961, GenBank Accession Numbers AE003852.1, AE003853.1) до 3 907 (штаммы 2012EL-2176, CP007634.1, CP007635.1) генов. На основании этого можно сделать вывод, что у вибрионов, изученных в условиях эксперимента, экспрессируется абсолютное большинство известных генов.
Далее нами был изучен профиль транскрипции генов, входящих в состав островка патогенности VcB. Данный островок локализован на второй хромосоме у всех изученных ток-сигенных вибрионов и отсутствует у атокси-генных апилированных штаммов [1]. В его состав входят шесть генов VCA0281—VCA0286 (табл. 1). В составе пула суммарной РНК из двух штаммов ctxA+ tcpA+ V. cholerae O1,
культивированных на всех питательных средах, с=р РНК-транскрипты были обнаружены для всех генов, за исключением гена УСА0282, кодирующего 18УсЬ5-транспозазу (табл. 2) [1]. Учи- ^ тывая, что транспозаза - это фермент, катали- ^^ зирующий вырезание, перенос ДНК, связыва- с=р ющий одноцепочечную ДНК и встраивающий ^ последнюю в геномную ДНК, возможно, что в изученных условиях культивирования транспо-заза не экспрессируется клетками вибрионов и является «молчащим» геном, который не транслируется в белковую структуру. Это неудиви- ^^ тельно, поскольку экспрессия подобных ферментов реализуется в условиях стрессового ответа и включается в ответ на стрессовые условия, сопровождающиеся появлением в клетках одноцепочечной деградированной ДНК. Кроме того, учитывая присутствие гена УСА0282 в составе суммарной ДНК вибрионов 5879 и 569В, необнаружение транскриптов свидетельствует об отсутствии примеси ДНК вибрионов в препарате суммарной РНК, использованной для секвенирования. Отсутствие транскриптов гена УСА0282 при наличии этого гена в геноме анализируемого штамма может служить своего рода «отрицательным контролем» при проведении дальнейших исследований подобного рода на холерном вибрионе.
В составе пула суммарной РНК из планктонной формы атоксигенного (ЛхА- 1;срА-) штамма V. cholerae № 20000 отсутствовали транскрипты двух генов (УСА0282 и УСА0283). При этом ген УСА0283 содержит вариабельный тандемный повтор УсВ, отсутствие которого ранее неоднократно было показано у всех ЛхА- 1;срА—штаммов холерного вибриона [1, 3, 5]. Обнаружение в пуле РНК-транс-криптов у штамма V. cholerae № 20000 генов УСА0281 (кодирующий интегразу), УСА0284 (гипотетический уропатогенный белок) и УСА0285 (гипотетический белок) оказалось неожиданным, поскольку у штамма 20000 отсутствует островок УсВ. Возможным объяснением этому может быть либо наличие близких аналогов указанных генетических структур, либо существование делетированного островка УсВ в других участках генома вибрионов. Детальные дополнительные исследования на большом наборе ЛхА- 1;срА—штаммов, выделенных на территории Российской Федерации, позволят разобраться в этом интересном вопросе.
Таблица 1. Характеристика генов и их продуктов, находящихся внутри островка патогенности VcB V. cholerae Table 1. Characteristics of genes and their products inside the island of pathogenicity VcB V. cholerae
Обозначение генов островка VcB в полногеномных сиквенсах штаммов Размер (п.о.) Ген, возможный продукт
V. cholerae 5879 V. cholerae N16061 V. cholerae MJ-1236
- VCA0281 CDS 23 972 Интеграза*
C3B50 12975 VCA0282 CDS 24 981 КУсЬ5-транспозаза*
C3B50_12970 VCA0283 CDS 25 1 242 Гипотетический белок. Содержит вариабельный тандемный повтор УсВ
C3B50 12965 VCA0284 CDS 26 531 Уропатогенный белок*
C3B50 12960 VCA0285 CDS 27 672 Гипотетический белок
C3B50 12955 VCA0286 CDS 28 351 Гипотетический белок
* Функция генов определена по данным полногеномного сиквенса штамма V. cholerae MJ-1236. * The function of the genes identified according to the genome sequence of a strain of V. cholerae MJ-1236
OKIflíPb №10 (307)
ЗНиСО
41
Таблица 2. Количественный анализ экспрессии генов V. cholerae, входящих в островок VcB,
рассчитанный по показателю FPKM, определенному по алгоритму Cufflinks [11] Table 1. Quantitative analysis of the genes expression of V. cholerae included in the island of VcB calculated by the index FPKM defined by the algorithm Cufflinks [11]
Ген
Штамм V. cholerae и среда инкубации
V. cholerae 20000 V. cholerae 5879 V. cholerae 5б9В
1 2 3 4 5 2 3 4 3 4 5
337 414 481 282 420 222 299 373 315 351 361
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 б8 210 2б7 225 111 1бб
530 321 128 718 403 372 б52 195 245 230 219
471 305 2б0 458 333 289 304 241 203 357 217
333 219 187 0 231 272 0 0 247 225 218
VCA0281
VCA0282
VCA0283
VCA0284
VCA0285
VCA0286
Примечание. Жидкие питательные среды, использованные для культивирования: 1 - синказная, 2 - синтетическая, 3 - трипто-новая, 4 - LB, 5 - среда AKI.
Note. Liquid culture media used for cultivation: 1 - sinkazny, 2 - synthetic, 3 - triptonew, 4 - LB, 5 - the AKI environment
Заключение. Таким образом, на модели островка патогенности VcB разработан прием анализа суммарного пула РНК холерного вибриона с помощью полногеномного секвениро-вания. В случае расширения спектра анализируемых генов и условий культивирования данный метод будет полезен при изучении закономерностей ответа холерного вибриона на различные внешние факторы, включая условия макроорганизма. Кроме того, этот подход перспективен для поиска генов, продукты которых принимают участие в реализации патогенных свойств вибрионов, и для выявления возможных мишеней для серодиагностики, поскольку позволяет на первоначальном этапе биоинформационного анализа исключить из дальнейшей работы «молчащие» гены. Данный способ может быть использован и на модели других патогенных микроорганизмов.
ЛИТЕРАТУРА (п. 6-13 см. References)
1. Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Мишанькии Б.Н., Олейников И.П., Дуванова О.В. Корреляция между наличием области вариабельного тандемного повтора VcB и островком натогенности VPI-1 у Vibrio cholerae II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017. Т. 35. № 2. С. 49-52.
2. Кругликов В.Д, Ломов Ю.M., Рожков К.К., Maзру-хо А.Б., Mихaсь Н.К., Moнaхoвa Е.К., Каминский Д.И., Овсова Л.^ Влияние различных аминокислот и солей аммония в составе синтетической питательной среды на продукцию холерного энтеротоксина II Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 20O3. N° 3. С. 1б-21.
3. Мишаиькии Б.Н., Водопьянов А.С., Ломов Ю.М., Романова Л.В., Водопьянов С.О., Сучков И.Ю., Mишaнь-кин M-Б., Черепахииа И.Я., Дуванова О.В., Шишияну M.R Ретроспективный VNTR-анализ генотипов штаммов Vibrio cholerae O1, выделенных на территории Ростовской области в годы VII пандемии холеры II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2004. N° 4. С. 28-33.
4. Нисанов Р.В., Водопьянов А.С., Симакова Д.И. Роль малых РНК в контроле экспрессии генов, вовлеченных в реализацию натогенности Vibrio cholerae II Проблемы особо опасных инфекций. 2017. № 2. С. Зб-З9.
5. Титова С.В., Кругликов В. Д., Ежова M-И., Водопьянов А. С., Архангельская И. В., Водопьянов С. О., Moeквитииa Э.А. Анализ динамики выделения и биологических свойств штаммов V. cholerae O1 El-Tor, изолированных из водных объектов на территории Ростовской области с 2003-2014 гг. II Здоровье населения и среда обитания. 2015. № 2 (2бЗ). С. 39-41.
REFERENCES
1. Vodop'yanov A.S., Vodop'yanov S.O., Mishan'kin B.N., Olejnikov I.P., Duvanova O.V. Korrelyaciya mezhdu nalichiem oblasti variabel'-nogo tandemnogo povtora VcB i ostrovkom patogennosti VPI-1 u Vibrio cholerae [Correlation between presence of field of variable tandem repetition of VcB and an island of pathogenicity of VPI-1 at Vibrio cholera]. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i vi-rusologiya. 2017, vol. 35, no. 2, pp. 49-52. (In Russ.)
2. Kruglikov V.D, Lomov Yu.M., Rozhkov K.K., Mazruho A.B., Mi-has' N.K., Monahova E.K., Kaminskij D.I., Ovsova L.M. Vliyanie
razlichnyh aminokislot i solej ammoniya v sostave sinteticheskoj pitatel'noj sredy na produkciyu holernogo ehnterotoksina [Influence of various amino acids and salts of ammonium as a part of synthetic nutrient medium on production of a cholera enterotok-sin]. Zhurnal mikrobiologii, ehpidemiologii i immunobiologii, 2003, no. 3, pp. 16-21. (In Russ.)
3. Mishan'kin B.H., Vodop'yanov A.S., Lomov Yu.M., Romanova L.V., Vodop'yanov S.O., Suchkov I.Yu., Mishan'kin M.B., Cherepahina I.Ya., Duvanova O.V., Shishiyanu M.V. Retrospektivnyj VNTR-analiz genotipov shtammov Vibrio cholerae O1, vydelennyh na territorii Rostovskoj oblasti v gody VII pandemii holery [The retrospective VNTR analysis of genotypes of strains of Vibrio cholerae Ol allocated for territories of the Rostov region in days of the VII pandemic of cholera]. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya, 2004, no. 4, pp. 28-33. (In Russ.)
4. Pisanov R.V., Vodop'yanov A.S., Simakova D.I. Rol' malykh RNK v kontrole ehkspressii genov, vovlechennyh v realizeciyu patogen-nosti Vibrio cholerae [Role of small RNA in control of an expression of the genes involved in realization of pathogenicity of Vibrio cholerae]. Problemy osobo opasnykh infektsiy, 2017, no. 2, pp. 3639. (In Russ.)
5. Titova S.V., Kruglikov V.D., Ezhova M.I., Vodop'yanov A.S., Arhangel'skaya I.V., Vodop'yanov S.O., Moskvitina Eh.A. Analiz dinamiki vydeleniya i biologicheskikh svojstv shtammov V. chole-rae O1 El-Tor, izolirovannykh iz vodnykh obe'ktov na territorii Rostovskoj oblasti s 2003-2014 gg. [The analysis of dynamics of allocation and biological properties of the strains V. cholerae Ol El-Tor isolated from water objects in the territory of the Rostov region since 2003-2014]. Zdorovye naseleniya i sreda obitaniya, 2015, no. 2 (263). pp. 39-41. (In Russ.)
6. Andrews S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Available at: http://www.bioinformatics.babraham. ac.uk/projects/fastqc (accessed: 30.01.2018).
7. Beyhan S., Tischler A.D., Camilli A., Yildiz F.H. Differences in gene expression between the classical and El-Tor biotypes of Vibrio chol-erae Ol. Infect Immun., 2006, no. 74(6), pp. 3633-3642.
8. Bolger A.M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina Sequence Data. Bioinformatics, 2014, no. 30 (15), pp. 2114-2120.
9. Langmead B, Trapnell C., Pop M., Salzberg S.L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology, 2009, 10:R25. D0I:10.1186/gb-2009-10-3-r25
10. Song L., Florea L., Langm B.. Lighter: Fast and Memory-efficient Sequencing Error Correction without Counting. Genome Biology, 2014, no. 15 (11), p. 509.
11. Trapnell C., Pachter L. and Salzberg S.L. TopHat: Discovering Splice Junctions with RNA-Seq. Bioinformatics 25: 1105-1111. DOI: 10.1093/bioinformatics/btp120
12. Trapnell C., Williams B., Pertea G., Mortazavi A., Kwan G., Baren J., Salzberg S., Wold B., Pachter L. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology, 2010. DOI:10.1038/nbt.1621
13. Williams T.C., Elliot R., Blackman E.R., Morrison S.S., Gibas C.J., Oliver J.D. Transcriptome Sequencing Reveals the Virulence and Environmental Genetic Programs of Vibrio vulnificus Exposed to Host and Estuarine Conditions Plos one. 2014, no. 1 (27). DOI: 10.1371/journal.pone.0114376
Контактная информация:
Водопьянов Сергей Олегович, доктор медицинских наук, заведующий лабораторией биохимии микробов ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора e-mail: [email protected] Contact information:
Vodopyanov Sergey, Doctor of medical sciences, head of the laboratory biochemistry of microbes «Rostov-on-Don protivochumny institute» Rospotrebnadzor e-mail: [email protected]
