CC BY
124
Фармакология, токсикология
УДК 619:615.9
ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СУСПЕНЗИИ ТРИКЛАБЕНДАЗОЛА
В.Е. АБРАМОВ доктор ветеринарных наук
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина, 117218, г. Москва, ул. Б. Черемушкинская, д. 28, e-mail: vigis@ncport. ru В.В. НАПАЛКОВА кандидат биологических наук
Н.П. БИРЮКОВА кандидат ветеринарных наук Всероссийский государственный научный контрольный институт
Изучены токсикологические свойства 5%-ной суспензии триклабендазола. Препарат относится к малоопасным веществам. ЛД50 равна 28000 мг/кг при введении в желудок белым мышам. Не проявляет сенсибилизирующего и местно-раздражающего действия на кожу. При введении в трехкратно увеличенной дозе оказывает слабовыраженное кратковременное и обратимое влияние на обезвреживающую функцию печени.
Ключевые слова: триклабендазол, суспензия, острая и субхроническая токсичность, антитоксическая функция печени, раздражающее действие.
Цель доклинических токсикологических исследований лекарственных средств - установление характера и выраженности токсического действия на организм экспериментальных животных и оценка их безопасности [2, 3].
Доклиническое изучение токсикологических свойств лекарственных средств для животных включает определение токсических доз и переносимости препарата лабораторными животными; выявление наиболее чувствительных к препарату органов и систем организма, характера и степени патологических изменений в них и обратимости вызываемых повреждений; определение зависимости токсических эффектов от дозы и длительности применения фармакологического средства.
Учитывая требования, предъявляемые к безопасности антигельминтных лекарственных средств для животных [4], одним из этапов наших исследований было изучение в опытах на лабораторных животных токсикологических свойств триклабендазола в форме 5%-ной суспензии, предназначенной для лечения и профилактики фасциолеза крупного рогатого скота.
Триклабендазол - 6-хлор-5-(2,3-дихлорфенокси-)-2-метилтио-бензими-дазол относится к группе бензимидазолов с присутствием атомов хлора, что отличает его от других представителей этой группы по фармакологическим свойствам и механизму действия.
Материалы и методы В опытах использовали образцы опытной серии 5%-ной суспензии триклабендазола, которая содержит в качестве действующего вещества 5 % триклабендазола, а в качестве вспомогательных компонентов: твин-80 - 0,2 %,
сорбитол - 0,5, желатин - 0,05, сахарозу - 10 и воду очищенную - до 100 %.
В опытах использовали 120 белых мышей, 126 крыс, 12 морских свинок и 12 кроликов.
Исследования проводили в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [4].
Для определения параметров острой токсичности препарата использовали белых мышей обоего пола массой 19-21 г. Животных содержали в виварии согласно санитарным правилам и на стандартном рационе с использованием сухого брикетированного корма. Подготовку к опыту белых мышей проводили в соответствии с указаниями ОФС «Испытание на токсичность» ГФ XI.
Перед опытом животных в течение 6 ч выдерживали на голодной диете, после чего взвешивали и распределяли по группам. Устанавливали переносимые и токсические дозы, выявляли наиболее чувствительные к триклабенда-золу органы и системы организма, характер и степень патологических изменений в них, обратимость вызываемых поражений.
Для установления параметров острой токсичности препарат вводили однократно (в максимальной дозе дробно с интервалом 1 ч) в желудок с помощью шприца с оливой в дозах: 8000 мг/кг; 10000; 15000; 20000; 25000; 30000; 35000; 40000; 45000; 50000; 55000 и 60000 мг/кг.
Каждую дозу препарата испытывали на 7 животных, контрольным мышам вводили воду в том же объеме. Наблюдения проводили в течение 14 сут; в первые сутки - непрерывно. Фиксировали общее состояние животных, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, координацию движений, тонус скелетных мышц, реакцию на тактильные, звуковые и световые раздражители, частоту и глубину дыхательных движений, ритм сердечных сокращений, состояние кожно-волосяного покрова, окраску слизистых оболочек, положение хвоста, количество и консистенцию фекальных масс, частоту мочеиспускания, окраску мочи, потребление корма и воды. Регистрировали сроки развития интоксикации и гибели мышей; трупы павших животных подвергали патологоанатомическому вскрытию для установления степени поражения органов и причин гибели, проводили макроскопическое исследование внутренних органов (степень кровенаполнения, наличие кровоизлияний, изъязвлений слизистых оболочек).
На основе полученных данных методом Кербера и Першина рассчитывали значения параметров острой токсичности препарата: ЛД0 (максимально-переносимая доза), ЛД50 (среднесмертельная доза), а для установления доверительных границ средней смертельной дозы определяли ЛД16 и ЛД84 [1]. Степень опасности препарата определяли согласно ГОСТ 12.1.007-76.
Исследование субхронической токсичности препарата провели на белых мышах исходной массой 19-23 г, из которых сформировали 4 группы по 10 животных в каждой. Препарат вводили мышам ежедневно в течение 15 сут в дозах 1/5, 1/10 и 1/20 от ЛД50, установленной в остром опыте. Животным контрольной группы ежедневно вводили 1%-ный крахмальный клейстер в объеме 0,5 мл. В процессе опыта ежедневно регистрировали массу мышей, выявляли наиболее чувствительные к препарату органы и системы организма, характер, степень и обратимость патологических изменений. На 16-е сутки мышей декапитировали и отбирали пробы крови (с и без антикоагулянта) для последующих гематологических и биохимических исследований. Извлекали печень, почки, сердце, легкие, селезенку и проводили взвешивание.
Влияние суспензии на организм животных оценивали по количеству эритроцитов и лейкоцитов, которое определяли с помощью камеры Горяева, уровень гемоглобина - фотометрическим методом.
Биохимические исследования проводили на анализаторе «Spekol 220/221» (Германия). В сыворотке крови определяли активность аланинами-нотрансферазы (АлАТ) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ), уровень пиро-
виноградной кислоты (ПВК), молочной кислоты.
Влияние триклабендазола на антитоксическую функцию печени изучали методом гексеналовой пробы в опыте на 36 белых крысах-самцах, которых распределили на подопытную и контрольную (по 18 животных) группы. Животным подопытной группы вводили препарат в дозе 36 мг/кг (3-кратная терапевтическая доза для крупного рогатого скота). Крысам контрольной группы препарат не вводили. Через 1,5; 3 и 6 ч животным обеих групп вводили гексенал внутрибрюшинно в дозе 60 мг/кг в объеме 1 мл свежеприготовленного раствора на 100 г массы животного. Продолжительность сна учитывали в минутах от момента развития бокового положения до первых попыток крыс изменить положение «спиной вверх». Сокращение длительности сна указывает на индукцию, а увеличение - на ингибирование микросомальных моно-оксигеназ печени.
Для определения массового коэффициента печени на 1, 3 и 7-е сутки белых крыс подопытной и контрольной групп декапитировали, вскрывали брюшную полость и извлекали печень. Печень взвешивали и вычисляли массовый коэффициент.
Местнораздражающее действие триклабендазола изучали в опытах на 6 кроликах. Для оценки действия препарата на кожу суспензию наносили на выстриженный участок кожи (10 см2) боковой поверхности туловища 3 кроликов в дозе 1 мл. Остальные животные (3 головы) служили контролем (наносили дистиллированную воду). Аппликацию осуществляли в течение 4 нед по 5 раз в неделю. Суспензию слегка втирали в кожу, а через 4 ч смывали теплой водой без мыла. Реакцию кожи учитывали ежедневно, используя шкалу кожных проб [6].
Для изучения раздражающего действия препарата на слизистые оболочки 1 каплю суспензии однократно вносили в конъюнктивальный мешок левого глаза кроликов (6 голов). Правый глаз служил контролем, и в него вносили 1 каплю физиологического раствора. Оценку раздражающего действия проводили через 15 мин, 2 ч (быстрая реакция) и через 24-48 ч (гиперчувствительность замедленного типа) по изменению кровенаполнения конъюнктивы, наличию лакримации и состоянию века и роговицы.
Аллергизирующие свойства триклабендазола изучали на морских свинках методом гистаминного шока. Сущность метода заключается в том, что у морских свинок подкожное введение гистамина в дозе 5 мг/кг вызывает гис-таминный шок, который заканчивается смертью животного. Если тестируемый препарат обладает антигистаминным действием, то его предварительное введение должно предотвратить гибель животного от гистамина, в противном случае смерть животного наступает в более короткие сроки.
В опыте использовали 12 клинически здоровых морских свинок массой 250-300 г. Шести подопытным морским свинкам вводили триклабендазол перорально в терапевтической дозе 12 мг/кг по ДВ. Контрольным животным препарат не применяли. Гистамин вводили подкожно в дозе 5 мг/кг одновременно как подопытным, так и контрольным морским свинкам через 6 и 12 ч после введения лекарственного средства.
Полученные экспериментальные данные были обработаны статистически с вычислением средних величин (М), ошибки (±m) и уровня величины Р.
Результаты и обсуждение
Однократное введение в желудок белым мышам суспензии триклабенда-зола показало, что максимально переносимая доза препарата, при которой не отмечено гибели мышей, составила более 8000 мг/кг. Доза суспензии 60000 мг/кг массы животного была «абсолютно» смертельной (вызывала гибель всех подопытных животных).
Введение суспензии триклабендазола в токсических дозах (в интервале 10000-60000 мг/кг) вызывало появление первых признаков интоксикации в
период от 40 мин до 3 ч. Клиническая картина интоксикации, в основном, проявлялась в кратковременном возбуждении, которое сменялось угнетением; отмечали отказ от корма, учащенное дыхание, нарушение двигательной активности, отсутствие реакции на внешние раздражители.
Основную гибель животных наблюдали течение 1-2 сут после введения препарата.
При вскрытии павших мышей отмечали патологические изменения в пищеварительном тракте, характерные для острого отравления: геморрагическое воспаление слизистой оболочки желудка и кишечника, переполнение брыжеечных сосудов кровью, незначительное увеличение печени и селезенки.
На основе полученных данных (табл. 1) были рассчитаны параметры острого токсического действия суспензии триклабендазола для мышей: ЛД50 составила 27000±2429 мг/кг массы животного.
1. Результаты изучения острой токсичности 5%-ной суспензии _ триклабендазола на белых мышах_
Доза препарата, Число животных Число животных
мг/кг в группе выжило пало
8000 7 7 0
10000 7 6 1
15000 7 5 2
20000 7 4 3
25000 7 3 4
30000 7 3 4
35000 7 2 5
40000 7 1 6
45000 7 1 6
50000 7 1 6
55000 7 1 6
60000 7 0 7
Согласно гигиенической классификации ГОСТ 12.1.007-76 5%-ная суспензия триклабендазола по параметрам острой токсичности относится к 4 классу опасности - «вещества малоопасные».
Для оценки субхронической токсичности суспензию триклабендазола вводили животным подопытных групп ежедневно в течение 15 сут в дозах, указанных в таблице 2. Многократное введении суспензии в трех тестируемых дозах гибели животных не вызывало, общее состояние и поведение подопытных животных, видимые физиологические функции оставались без изменений.
2. Дозы суспензии триклабендазола при изучении субхронической токсичности
Группа животных Доза (часть) от ЛД50 (мг/кг/сут) Число животных в группе
I 1/5 (5400) 10
II 1/10 (2700) 10
III 1/20 (1350) 10
IV Контроль 10
(1%-ный крахмальный клейстер)
В таблице 3 приведена динамика прироста массы тела мышей подопытных и контрольной групп. Из таблицы 3 следует, что введение суспензии в дозе 1/5 от ЛД50 приводило к замедлению динамики прироста массы животного: процент прироста массы к исходной составил 112 % по сравнению с 123 % в контроле. В то же время при введении препарата в более низких дозах - 1/10 и 1/20 от ЛД50 динамика прироста массы тела мышей практически не отличалась от динамики в контрольной группе.
Срок исследо- Группы животных
вания, сут 1/5 от ЛД50 (5400 мг/кг) 1/10 от ЛД50 (2700 мг/кг) 1/20 от ЛД50 (1350 мг/кг) контроль
0 20,2±0,25 21,3±0,15 22,00±0,16 22,3±0,37
3 20,9±0,23 22,7±0,30 23,40±0,31 23,7±0,26
5 21,3±0,15 23,8±0,25 23,90±0,22 24,5±0,34
7 21,8±0,20 24,9±0,28 25,30±0,39 25,9±0,38
10 22,1±0,23 25,6±0,22 25,9±0,31 26,7±0,37
15 22,6±0,16 26,0±0,26 27,2±0,37 27,5±0,26
% к исходной 112 122 123 123
массе
Значения массовых коэффициентов внутренних органов мышей после перорального введения препарата приведены в таблице 4.
4. Влияние суспензии триклабендазола на относительную массу _внутренних органов мышей_
Масса органа Группы животных
1/5 от ЛД50 (5400 мг/кг) 1/10 от ЛД50 (2700 мг/кг) 1/20 от ЛД50 (1350 мг/кг) контроль
Печень 37,47±0,84 34,72±2,16 39,14±1,70 38,49±3,02
Почки 13,43±0,88 11,23±0,46 12,18±0,52 11,78±0,31
Сердце 4,44±0,17 4,28±0,13 4,71±0,13 4,66±0,10
Легкие 8,99±0,22 8,07±0,38 7,90±0,49 8,25±0,40
Селезенка 5,56±0,18 5,65±0,20 5,54±0,20 5,77±0,41
Значения массовых коэффициентов сердца, легких, печени, почек и селезенки у мышей трех подопытных и контрольной групп достоверно не отличаются друг от друга. Так, массовый коэффициент печени у мышей, которым препарат вводили в дозах 1/5; 1/10 и 1/20 от ЛД50, составил соответственно 37,47±0,84; 34,72±2,16 и 39,14+1,70 (в контроле - 38,49±3,02); почек 13,43±0,88; 11,23+0,46 и 12,18+0,52 (в контроле 11,78+0,31); легких 8,99+0,22; 8,07+0,38 и 7,90+0,49 (в контроле 8,25+0,40).
Результаты исследования гематологических показателей приведены в таблице 5.
5. Влияние суспензии триклабендазола на гематологические показатели мышей
Показатель Группы животных
1/5 от ЛД50 (5400 мг/кг) 1/10 от ЛД50 (2700 мг/кг) 1/20 от ЛД50 (1350 мг/кг) контроль
Гемоглобин, г/л 142,80±2,17* 141,1±2,08* 152,50±1,84 153,3±3,13
Эритроциты, 1012/л 8,80±0,09 8,73±0,12 8,71±0,22 8,53±0,10
Тромбоциты, 109/л 273,10±9,76 279,6±6,77 323,00±10,06 290,80±10,07
СОЭ, мм/ч 1,80±0,20 2,00±0,26 1,50±0,17 1,50±0,17
Цветовой показатель 0,94±0,01 0,94±0,02 0,97±0,01 0,97±0,01
Лейкоциты, 109/л 6,89±0,38 7,10±0,06 7,46±0,16 7,50±0,15
Лейкограмма, % Сегментоядерные Моноциты Эозинофилы Лимфоциты Палочкоядерные 32,20±0,65* 2,30±0,26* 2,00±0,26* 62,60±0,70* 0,90±0Д0 27,10±1,48 2,70±0,42 1,40±0,27 68,80±1,30 30,00±1,98 3,60±0,40 1,20±0,20 65,20±2,00 32,30±2,62 3,50±2,17 1,20±0,13 63,00±2,53
■я-1-
Различие достоверно (Р < 0,05).
При введении препарата в дозах 1/5 и 1/10 от ЛД50 незначительно снижалась концентрация гемоглобина, а в дозе 1/5 от ЛД50 отмечали появление в лейкограмме палочкоядерных нейтрофилов. Количество эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, цветной показатель, СОЭ достоверных изменений не претерпели.
Введение суспензии в дозе 1/20 от ЛД^0 не оказало достоверного влияния на гематологические показатели: уровень гемоглобина, количество эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов и СОЭ составили соответственно 152,5±1,84; 8,71±0,22; 323,0±10,06; 7,46±0,16 и 1,50±0,17 против 153,3+3,13 (г/л); 8,53+0,10 (102/л); 290,8±10,07 (109/л); 7,50±0,15 (109/л) и 1,50±0,17 (мм/ч).
В таблице 6 приведены результаты определения биохимических показателей сыворотки крови мышей после введения суспензии в тестируемых дозах в сравнении с контрольными животными.
6. Влияние суспензии триклабендазола на биохимические показатели _ крови мышей_
Показатель Группы животных
1/5 от ЛД50 (5400 мг/кг) 1/10 от ЛДзо (2700 мг/кг) 1/20 от ЛДзо (1350 мг/кг) контроль
Белок, мг/мл 56,30±0,29 55,10± 0,36 54,70±0,11 55,50±034
Щелочная фосфатаза, Е/л 10,42±0,09 10,18±0,23 10,04±0,15 9,73 ± 0,25
Холестерин, мг/дл 117,50±0,31 115,10±0,46 114,80±0,62 116,40±0,42
Аспартатаминотрансфераза, Ед/л 40,70±0,85 41,00±0,90 40,23±0,41 38,50±0,50
Аланинаминотрансфераза, Ед/л 41,60±0,77 39,30±0,38 38,90±0,54 39,50±0,32
Креатинин, мкмоль/л 106,2±0,89 107,8±1,21 107,10±1,25 109,50±1,45
Суспензия триклабендазола в испытанных дозах не оказала достоверного влияния на концентрацию белка, холестерина, креатинина, а также активность аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы - ферментов, активность которых является показателем функционального состояния печени и почек.
Антитоксическую функцию печени после введении суспензии триклабендазола в дозе 36 мг/кг (3-кратная терапевтическая доза по ДВ для крупного рогатого скота) оценивали через 1,5; 3 и 6 ч после введения гексенала общепринятым тестом. Продолжительность гексеналового сна у подопытных животных через 1,5 ч после введения препарата не отличалась от данного показателя животных контрольной группы (табл. 7, Р > 0,05). При введении гек-сенала через 3 ч после введения препарата продолжительность гексеналового сна была достоверно выше по сравнению с контрольными животными и составила соответственно 28,42±2,25 и 24,20±1,22 мин (Р < 0,05). Однако уже через 6 ч после введения испытуемого препарата результаты у подопытных животных были аналогичны с контролем, что может свидетельствовать об ингибировании триклабендазолом микросомальных ферментов гепатоцитов и замедлении метаболизма гексенала. Восстановление антитоксической активности печени происходило через 6 ч, т. е. изменения носили кратковременный и обратимый характер (табл. 7).
7. Влияние суспензии триклабендазола на антитоксическую функцию печени __крыс__
Интервал после введения препарата, ч Длительность гексеналового сна, мин, в группе Р
подопытной контрольной
1,5 26,20±0,52 25,40±1,16 > 0,05
3 28,42±2,25 24,20±1,22 < 0,05
6 25,540±2,10 24,45±1,03 > 0,05
Массовый коэффициент печени определяли в динамике в различные сроки после введения препарата (табл. 8).
8. Влияние суспензии триклабендазола на массовый коэффициент печени __крыс___
Вводимая доза препа- Период после введе- Массовый коэф- Р
рата (по ДВ), мг/кг ния препарата, сут фициент печени
36 1 3 5 , 82±0 , 5 7 < 0,05
36 3 3 1 , 2 3 ±0 ,2 6 > 0 , 0 5
36 7 3 1 , 7 1 ±0 ,2 9 > 0 , 0 5
Контроль 1 32,63±1 ,4 8 -
Контроль 3 33,10±1,31 -
Контроль 7 32,00±0,93 -
Через 1 сут после введения препарата в дозе 36 мг/кг наблюдали незначительное, но достоверное, увеличение относительной массы печени у животных подопытной группы - 35,82±0,57 против 32,63±1,48 в контроле (Р < 0,05). Однако, через 3 и 7 сут после введения препарата значения массового коэффициента печени у подопытных крыс не отличались от показателей животных контрольных групп. Учитывая, что изменение показателя относительной массы печени отмечали только через 1 сут после введения суспензии триклабендазола, а его восстановление до нормы происходит в последующие сроки, можно предположить, что указанные изменения носят временный характер и связаны с реакцией организма на введение чужеродного вещества.
Местно-раздражающее действие суспензии триклабендазола при нанесении на кожу изучали в опытах на кроликах при 20-кратных аппликациях на-тивного препарата на кожу. Каких-либо изменений в состоянии кожного покрова животных, в том числе покраснений, расчесов, отека, утолщения кожной складки, изменения цвета, не отмечали. Не наблюдали также проявления беспокойства в поведении подопытных животных, что свидетельствует о том, что препарат при многократном нанесении на кожу не вызывает раздражения.
Оценку раздражающего действия на слизистые оболочки проводили по изменению кровенаполнения конъюнктивы, наличию лакримации, состоянию века и роговицы после инстилляции нативного препарата в конъюнктиваль-ный мешок кроликам. После введения препарата кролики закрыли глаза и не открывали их в течение 15 мин; при этом сами животные были спокойны. Через 2 ч наблюдали незначительное покраснение конъюнктивы (слабое расширение сосудов), а через 24 ч и в последующие сроки наблюдений признаков раздражения слизистой оболочки глаз ни у одного из подопытных кроликов не отмечали. Суммарный балл выраженности раздражающего эффекта препарата на глаза кроликов составил 1, что позволяет отнести тестируемый препарат по выраженности раздражающего действия на глаза к 4 классу - раздражение «слабое».
Аллергизирующее действие суспензии триклабендазола изучали в опыте на морских свинках методом гистаминного шока. Препарат в терапевтической дозе не обладает антигистаминной активностью, так как не предотвращает смерть животных от введенной дозы гистамина, а также и не ускоряет ее, что указывало бы на сенсибилизирующее действие (табл. 9).
9. Результаты изучения аллергизирующих свойств суспензии триклабендазола
Группа животных Срок введения гистамина после введения препарата, ч Время наступления гистаминного шока, мин
Подопытная 6 19,3±0,24
Контрольная 6 19,0±0,25
Подопытная 12 18,4±0,22
Контрольная 12 19,1±0,24
Все животные подопытной и контрольной групп пали приблизительно в одни и те же сроки. Так, при введении гистамина морским свинкам через 6 ч после введения препарата время наступления гистаминного шока составило 19,3±0,24, а через 12 ч - 18,4±0,22 мин, у контрольных животных соответственно 19,0±0,25 и 19,1±0,24 мин. Разница показателей контрольных и подопытных групп оказалась недостоверной (Р > 0,05). Следовательно, препарат аллергизирующими свойствами не обладает.
Литература
1. Беленький М.Д. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л.: Медгиз, 1963. - С. 151.
2. Веселова Т.П. К вопросу сравнительной токсичности антгельминти-ков // Матер. докл. науч. конф. Всес. о-ва гельминтол. - М., 1964. - Ч. 1. - С. 58-61.
3. Веселова Т.П. Проблемы фармакологии и токсикологии антгельмин-тиков, применяемых в ветеринарии // Животноводство и ветеринария. Паразитарные заболевания. - М., 1978. - Т.10. - С. 92-108.
4. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2000.
5. Степанова Н.Г. Модифицированный метод исследования функции печени у мелких лабораторных животных // Лабораторное дело. - 1962. - № 5. - С. 49-52.
6. Суворов С.В., Чернышова В.И. К вопросу о количественной оценке гиперемии, как показателя интенсивности и воспаления // Вестник дерматологии и венерологии. - 1974. - № 6. - С. 22-24.
Toxicological property of triclabendazole suspension V.E. Abramov, V.V. Napalkov, N.P. Biryukova
Toxicological property of triclabendazole 5 % suspension are studied. The drug do not exhibit sensitization and locally irritating to the skin. It has mild short-term and reversible impact on neutralizing the function of liver.
Keywords: 5 % suspension of triclabendazole, acute and subchronic toxicity, antitoxic function of the liver, stimulating effect of the drug.
