CC BY
24
УДК619:615.9:636.087.7
ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРЕБИОТИЧЕСКОЙ ДОБАВКИ ГИДРОГЕМОЛ
Т. И. ПАШНИК, С.Н. КОЛОМИЕЦ, Е. А. ЧЕТВЕРИКОВА
ФГБОУВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина», г. Москва, Российская Федерация
(Поступила в редакцию 19.01.2018)
В статье приведены токсикологические исследования пребиотика гидрогемол на лабораторных животных (белых мышах, крысах, кроликах, морских свинках). Опреде-лены:токсичность, острая токсичность, хроническая токсичность, раздражающее действие, микробиоценоз кишечника. В опыте на токсичность приведены данные учета сохранности поголовья и изменения в функционально-поведенческом статусе белых мышей. При определении острой токсичности - клиническое состояние, динамика массы тела и выживаемость животных. Установлено, что пребиотик гидрогемол не оказывает токсического и раздражающего действия. В опытах при определении острой и хронической токсичности гибели животных не наблюдалось. Не оказывает негативного влияния на обменные процессы, морфологические и биохимические показатели крови. Внутренние органы лабораторных животных без признаков патологии. В кишечнике мышей увеличивается количество бифидобактерий, энтерококков.
Ключевые слова: токсичность, гидрогемол, лабораторные животные, морфология, биохимия крови, бифидобактерии.
The article presents toxicological studies of prebiotic hydrogens on laboratory animals (white mice, rats, rabbits, guinea pigs). Detected: toxicity, acute toxicity, chronic toxicity, irritant effect, intestinal microbiocenosis. In the toxicity test, the data on the keeping of the livestock population and changes in the functional-behavioral status of white mice are presented. In determining acute toxicity - the clinical state, the dynamics of body weight and survival of animals. It has been established that the prebiotic hydrohemol does not have a toxic and disabling effect. In experiments in the determination of acute and chronic toxicity, the death of animals was not observed. Does not have a negative effect on metabolic processes, morphological and biochemical indicators of blood. Internal organs of laboratory animals without signs ofpathology. In the intestines of mice, the number of bifidobacteria and enterococci increases.
Key words: toxicity, hydrohemol, laboratory animals, morphology, blood biochemistry, bifidobacteria.
Введение. По классификации, предложенной кафедрой фармакологии и токсикологии СПбГАВМ, кишечные стабилизаторы включают пробиотики и органические кислоты. Эти препараты являются наиболее безвредными: нормализуют состав микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте, повышают иммунитет, сохранность поголовья, обладают ростостимулирующим эффектом [1, 3-6, 8, 9, 11-13] Но про-биотики и добавки с пребиотическими эффектом не следует использовать бесконтрольно, так как разный состав препарата, дозировка, длительность применения, возрастной период птицы по-разному определяют фармакодинамику и соответствующее влияние препарата на организм. В связи с этим изучение фармакологических свойств нового отечественного препарата гидрогемол является актуальным.
Анализ источников. Из литературных данных известны такие добавки с пребиотическим эффектом, как молочная кислота, лактит, аг-римос и другие. Ежедневное скармливание курам-несушкам молочной кислоты в течение первых трех месяцев продуктивного периода влияет на иммунологический статус, в результате чего активность лизоцима, Р-лизина, бактерицидная активность и содержание иммуноглобулина-в в сыворотке крови существенно возрастают (сравнение 34,0 и 29,8; 49,5 и 46,4; 70,2 и 65,3 %, 10,5 и 8,5 мг/мл) [10].
При совместном применении препаратов гидротривита (содержащий жирорастворимые витамины А, Дз, Е), цинка глюконата (взаимодействие глюконовой кислоты с гидроксидом цинка), селенометиони-на (соединение микроэлемента селена и незаменимой аминокислоты метионина) бактерицидная активность сыворотки крови во всех опытных группах оказалась выше на 28,9-34,2 %, а фагоцитарная активность псевдоэозинофилов - на 20,4-24,6 % по сравнению с контрольной группой [2].
Лактит (лактитол) - это структурообразующий сахарозаменитель (4-О-бета-В-галактопиранозил-Э-сорбит) с низким гликемическим индексом (6), не влияет на уровень глюкозы в крови и инсулина. Пре-биотические свойства проявляет в стимуляции в толстом кишечнике роста сахаролитических бактерий, ответственных за такие механизмы, как стимулирование иммунной системы, синтез витаминов, усвоение микронутриентов, снижение содержания холестерина в сыворотке крови и др. [7, 14].
Препарат агримос, полученный из стенок дрожжевых клеток и содержащий активные полисахариды - маннанолигосахариды, или МО-Сы и бета-глюканы, связывает в кишечнике патогенные грам-отрицательные микроорганизмы, выводя их из пищеварительного тракта. Также он положительно влияет на морфологию кишечника и целостность защитного слизистого барьера.
Таким образом, пребиотики разного состава оказывают различное влияние на организм. Создание новых пребиотиков и изучение их фармакодинамики, является актуальным.
Цель работы - дать токсикологическую оценку новой пребиотиче-ской кормовой добавки гидрогемол.
Материал и методика исследований. Научно-производственные опыты и апробацию результатов научных исследований проводили в Межрайонной ветеринарной лаборатории г. Новороссийска. В экспериментах использовано 25 крыс-самцов, 115 белых мышей, 28 кроликов, 10 морских свинок.
При постановке экспериментов были использованы токсикологические, микробиологические, фармакологические, биохимические, морфологические, иммунологические, клинические, патологоанатомиче-ские, зоотехнические методы исследования и методы вариационной
статистики. Объектами лабораторных исследований были: кровь, содержимое подвздошной кишки, толстого кишечника.
На базе Межрайонной ветеринарной лаборатории г. Новороссийска. Испытание препарата на токсичность в опыте 2.1 проводили на здоровых лабораторных белых мышах. Вели учет клинического состояния и выживаемости животных. Острую токсичность пребиотика определяли в опыте 2.2 на крольчихах. Учитывали: клиническое состояние (термометрию), динамику массы тела и выживаемость животных. Определение хронической токсичности в опыте 1.3 препарата гидрогемол проводили в течении 3-х месяцев на белых мышах, морских свинках, кроликах, беспородных крысах-самцах. В период наблюдения учитывали: прирост массы тела, гематологические и биохимические показатели, патологоанатомические изменения и массу внутренних органов. Раздражающее действие изучали в опыте 1.4 на белых кроликах самцах. Учитывали реакцию по наличию покраснения, появления кожной складки. Влияние пребиотика на микробиоциноз кишечника изучали на белых мышах в опыте 1.5. Определяли популя-ционный уровень микроорганизмов до и через 5, 10 дней в течение опыта, и через 3-и дня после окончания скармливания пребиотика (табл. 1).
Токсикологические исследования пребиотика были проведены на лабораторных животных (белых мышах, крысах, кроликах, морских свинках) на определение токсичности, острой токсичности, хронической токсичности, раздражающего действия, микробиоценоза кишечника. В опыте на токсичность вели учет сохранности поголовья и изменения в функционально-поведенческом статусе белых мышей. При определении острой токсичности учитывали клиническое состояние, динамику массы тела и выживаемость животных. Изучение раздражающего действия пребиотика учитывалось по наличию покраснения, появления кожной складки. Влияние препарата на микробиоциноз кишечника изучено при проведении эксперимента на белых мышах массой 18-20 г, подобранных по принципу аналогов, которые получали в течение 10 дней пребиотик из расчета 0,1мл. Были выделены в качестве доминирующих групп микроорганизмов: бактерии рода Lactobacillus, энтерококки и Bifidobacterium. Популяционный уровень этих микроорганизмов определяли методом количественного группового анализа до и через 5, 10 дней и через 3 дня после окончания скармливания пребиотика.
Подсчет общего количества микроорганизмов вели по Бриду. Посевы для бактерий делали из разведений и вносили на среды по 0,1 мл. Для количественного учета молочнокислых бактерий и их выделения, была использована среда Квасникова Е. И. Бифидобактерии культивировали на среде Бифидум, лактобактерии - на лактобакагаре, бактероиды гр. B. fragilis - на кровяном анаэробном бактоагаре с ка-намицином и желчью.
Груп па Число, гол. Продолжит. опыта, дней Условия кормления
Опыт № 2 (лабораторные животные)
Опыт № 2.1 (белые мыши)
с 1 по 10-0 50 24 ОР + гтдрогемол (1-я группа - 0,1 мл/10 мл физраствора, 2-я - 0,2 мл/10 мл, 3-я - 0,3 мл/10 мл, 4-я - 0,4 мл/10 мл, 5-я - 0,5 мл/ 10 мл, 6-я - 0,6 мл/10 мл, 7-я -0,7 мл/10 мл, 8-я - 0,8 мл/10 мл, 9-я - 0,9 мл/10 мл, 10-я - 1,0 мл/10 мл по 0,5 мл на голову в течение 14-и дней)
11-К 5 24 ОР
Опыт № 2.2 (крольчихи)
1-0 5 10 ОР + гидрогемол (5,0 мл на голову перед кормлением)
2-0 5 10 ОР + гидрогемол (10 мл на голову )
3-К 5 10 ОР + (водопроводная вода в объеме 3 мл перед кормлением)
Опыт № 2.3 (лабораторные животные)
1-0 10 62 ОР + гидрогемол (0,5 мл/кг белым мышам)
2-О 10 62 ОР + гтдрогемол (2,0 мл/кг морским свинкам)
3-О 10 62 ОР + гтдрогемол (2,5 мл/кг кроликам)
4-О 10 62 ОР + гтдрогемол (2,0 мл/кг беспородным крысам-самцам)
5-К 10 62 ОР (белые мыши)
6-К 10 62 ОР (морские свинки)
7-К 10 62 ОР (кролики)
8-К 10 62 ОР (беспородные крысы-самцы)
Опыт № 2.4 (белые кролики самцы)
1-О 1 3 Кожная проба пребиотика (0,01 мл)
2-О 1 3 Кожная проба пребиотика (0,1 мл)
3-О 1 3 Кожная проба пребиотика (1,0 мл)
Опыт № 2.5 (белые мыши)
1-О 50 13 ОР + гидрогемол (0,1 мл с 1-го по 10-й день)
Выделение лактатферментирующих микроорганизмов и подсчет их проводили на среде Кистнера. На среде Эндо выделяли бактерии группы кишечной палочки. Энтерококки выделяли и культивировали на среде энтерококкагаре, стафилококки - на желточно-солевом агаре, гемолитические микроорганизмы - на 5 % кровяном агаре, дрожже-подобные грибы - на агаре Сабуро, клостридии - на среде Вильсона-Блера Г41. Статистическая обработка микробиологических данных проводилась по В. С. Асатиани. Результаты исследований обрабатывали биометрическим методом.
Результаты исследований и их обсуждение. В опыте 2 проводили исследования на определение острой и хронической токсичности, кожно-резорбтивного действия, кишечной микрофлоры на базе Межрайонной ветеринарной лаборатории г. Новороссийска. Испытание препарата осуществлено на лабораторных животных с обеспечением идентичных условий кормления и содержания, использования в эксперименте. Для определения острой и хронической токсичности использованы клинически здоровые мыши, морские свинки, кролики, крысы.
Испытание на токсичность опыта 2.1 проводили на здоровых лабораторных белых мышах. Для опыта готовили пребиотик гидрогемол в различной концентрации - от 0,1 мл/10 мл физраствора; до 1 мл/10 мл физраствора (1-я группа - 0,1 мл/10 мл физраствора, 2-я - 0,2 мл/10 мл, 3-я - 0,3 мл/10 мл, 4-я - 0,4 мл/10 мл, 5-я - 0,5 мл/ 10 мл, 6-я -0,6 мл/10 мл, 7-я - 0,7 мл/10 мл, 8-я - 0,8 мл/10 мл, 9-я - 0,9 мл/10 мл, 10-я - 1,0 мл/10 мл). Мыши методом случайной выборки были разбиты на 11 групп по 5 голов в каждой. Первые десять групп были использованы для оценки токсичности, 11 группа была контрольной. Мышам опытных групп пребиотик вводили перорально в количестве 0,5 мл ежедневно, в течение 14 дней. Мышам контрольной группы аналогичным образом давали водопроводную воду. Наблюдения вели в период опыта и в течение 10 дней после окончания выпаивания гидрогемола. В течение 24-х дней в опытных и контрольной группе падежа не было. Признаков токсикоза у мышей, получавших пребиотик, не наблюдалось. Острую токсичность определяли в опыте 2.2 на клинически здоровых крольчихах, находящихся в одинаковых условиях содержания и кормления. Группы животных подбирались по принципу аналогов по 5 голов (табл. 2).
Таблица 2. Динамика изменения живой массы и температуры тела крольчих
Группы животных и дозы
Живая масса кроликов перед введением препарата, грамм
1 группа - 5,0мл/голову 2 группа - 10,0 мл/голову Згруппа - контроль
4390,0±10,41*** 4464,0±2,7*** 4519,0±5,95
Живая масса кроликов через 10 дней после введения препарата, грамм
4790,0±52,91* 4920,0±12,05* 4885,0±7,98
Динамика температуры тела крольчих
Группа Доза добавки Средние показатели ректальной температуры
Фон 2 часа 8 часов 24 часа 10 дней
1опытная 5,0 40,0± 39,0± 0,11 39,2± 38,9± 39,0±
мл/голову 0,0! 0,12 0,16 0,18
2опытная 10,0 39,9± 39,7±0,06*** 38,6± 38,8± 38,7±
мл/голову 0,06 0,17 0,20 0,17
контрольная 40,0± 0,15 39,2± 0,09 38,9± 0,13 38,8± 0,17 38,9± 0,09
Функционально-поведенческий статус крольчих по группам
Функциональные изменения 1 опытная 2 опытная контроль
Настороженность 2 1 2
Беспокойство 0 1 1
Груминг 0 1 0
Спонтанная двиг. активность 0 0 0
Нервно э-мышечная возбудимо сть
Реакция на прикосновение 5 5 5
Реакция на боль 5 5 5
Реакция на стук 2 1 2
Вегетативные эффекты
Птоз 0 0 0
Величина зрачка 3 2 3
Саливация 1 2 2
Мочеиспускание 0 0 1
Дефекация 3 2 4
Частота дыхания 5 5 5
Животным опытных групп перорально вводили препарат в течение 10 дней. Крольчихам контрольной группы аналогично вводили питьевую воду. Учитывали клиническое состояние, динамику массы тела и выживаемость животных. Пребиотик не обладал острой токсичностью.
За период проведения опыта гибели животных не наблюдалось. Живая масса тела во 2-й опытной группе на 35 г больше, чем в контрольной и на 130 г больше, чем в 1-й опытной группе. Температурные показатели в группах находились в пределах физиологической нормы. Клинические признаки интоксикации: внешний вид, поведенческие реакции не выявлены.
Определение хронической токсичности препарата проводили в опыте 2.3 в течение 3-х месяцев при ежедневном включении в рацион лабораторным животным. В период наблюдения учитывались: прирост массы тела, гематологические и биохимические показатели, патолого-анатомические исследования и определение весовых коэффициентов внутренних органов.
Массовая доля сырого протеина в печени белых мышей контрольной группы была на 2,95 % больше, чем во 2-й группе, что свидетельствует о лучшем усвоении белков и амидов корма животными 1 -й группы. Но, несмотря на это, живая масса тела и вес печени белых мышей во 2-й группе был больше. Применение гидрогемола во 2-й группе привело к снижению массовой доли жира, что свидетельствует об уменьшении усвоения истинных жиров и жироподобных веществ. Сырой жир в качестве структурного материала входит в состав протоплазмы всех клеток, и необходим для нормальной работы пищевых желез и играет роль основного запасного вещества. Массовая доля сырой золы в печени белых мышей опытной группы была на 0,05 % больше, чем в контрольной группе, что говорит о лучшем усвоении минеральных веществ корма. Клинические признаки интоксикации: внешний вид, поведенческие реакции не выявлены.
При проведении гематологических исследований крови морских свинок наблюдалось достоверное увеличение количества лейкоцитов и тромбоцитов, но данные показатели, согласно Вирту, находились в пределах физиологической нормы. Анализ показал, что длительное скармливание пребиотика не оказало негативного влияния на обменные процессы и гематологические показатели у лабораторных животных, не оказало негативного влияния на гемопоэз животных. Отмечено увеличение гемоглобина и эритроцитов, ускоренное созревание лейкоцитов крови морских свинок.
Длительное скармливание гидрогемола оказало положительное влияние на биохимические показатели сыворотки крови животных и привело к увеличению общего белка в сыворотке крови кроликов.
Пребиотик не вызывал обменных нарушений, поскольку статистически достоверных различий в уровне мочевины, щелочной фосфотазы не выявлено. Так как гибели и заболевания животных не отмечалось, установить среднесмертельную, абсолютно смертельную и максимально переносимую дозу для лабораторных животных не представлялось возможным. По истечении 7 дней после последнего введения препарата 5 крыс-самцов из каждой группы было вскрыто и изучено состояние внутренних органов. Длительное применение пребиотика в опыте на хроническую токсичность не позволило выявить отрицательного воздействия на организм животных: регионарные и мезентери-альные лимфатические узлы, внутренние органы лабораторных животных, ответственные за метаболизм и элиминацию чужеродных соединений, были без признаков патологии, у опытных и контрольных животных не имелось статистически достоверных отличий. Гидроге-мол в исследуемых дозах не оказывал отрицательного влияния на развитие внутренних органов крыс-самцов. Отмеченное увеличение массового индекса легких статистически недостоверно. Массовые коэффициенты остальных органов у опытных животных были ниже, чем у контрольных, и таким образом пребиотик вызывал увеличение массы тела животных без нарушения развития внутренних органов.
Изучение раздражающего действия пребиотика проводили в опыте 2.4 на 3-х белых кроликах самцах массой 25,5-25,8 г, которым за сутки до эксперимента тщательно выстригали шерсть на симметричных участках обоих боков, один из которых служит контролем. Площадь обрабатываемой поверхности кожи составляла 5-8 % поверхности тела животного. Втирали препарат в течение 3-х дней. Оценка местного действия препарата на кожу оценивалась сразу после окончания экспозиции, а также через 24, 48 и 72 часа. Реакцию учитывали по наличию покраснения, появления кожной складки. Признаков воспалительного и раздражающего действия пребиотика не наблюдалось.
Влияние гидрогемола на микробиоциноз кишечника изучено в опыте 2.5 при проведении эксперимента на белых мышах массой 1820 г. Опытная группа (50 голов) в течение 10 дней получала пребиотик. Определяли популяционный уровень микроорганизмов до и через 5, 10 дней в течение опыта, и через 3-и дня после окончания скармливания пребиотика. Были выделены в качестве доминирующих групп микроорганизмов бактерии рода Lactobacillus, энтерококки и Bifidobacterium.
Заключение. Пребиотик гидрогемол не оказывает токсического и раздражающего действия. В опытах при определении острой и хронической токсичности гибели животных не наблюдалось. Не оказывает негативного влияния на обменные процессы, морфологические и био-
химические показатели крови. Внутренние органы лабораторных животных без признаков патологии. В кишечнике мышей увеличивается количество бифидобактерий, энтерококков.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воробьев, А. В. Опыт применения пробиотика биоспорин для лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней молодняка / А. В. Воробьев, А. А. Фадеев // Актуальные проблемы производства продуктов животноводства. сб. науч. трудов. -Самара, 2001. - С. 86-88.
2. Гурвич, А.Е. Иммуногенез и клеточная дифференцировка / А.Е. Гурвич. - М.: Наука, 1978. - 231 с.
3. Зацепилова, Т. А. Препараты, восстанавливающие нормальную микрофлору / Т. А. Зацепилова // [Электронный ресурс]. - 1999. - Режим доступа: http: // www.mosapteki.ru.
4. Каблучеева, Т. И. Использование пробиотиков в птицеводстве / Т. И. Каблучеева. - Краснодар, 2004. - С. 3-78.
5. Каноев, Б. Оптимизация микрофлоры кишечника у цыплят и кур / Б. Каноев // Птицеводство. - 2003. - №3. - С. 11.
6. Красочко, П. А. Становление микробиоценоза кишечника цыплят-бройлеров под действием иммуномодуляторов, пробиотиков и пребиотиков / П. А. Красочко, Е. А. Копитанова, А. А. Гласкович // Эпизоотология, иммунология, фармакология, санитария. - 2008. - №3. - С. 6-14.
7. Куликова, И. К. Лактит (лактитол) - функциональный пребиотик / И. К. Куликова, М. В. Папина, В. Г. Папин // [Электронный ресурс]. - 1999. - Режим доступа: http: // www.normoflorin .ru.
8. Панин, А.Н. Формирование кишечного микробиоценоза у цыплят / А.Н. Панин, Н. И. Малик // Ветеринария. - 2000. - №7. - С. 7-8.
9. Скворцова, Л. Нетрадиционное сырье в кормлении птицы / Л.Скворцова // [Электронный ресурс]. - 2009. - Режим доступа: http: //www.pressa.kuban.info.
10. Соколов, В. Молочная кислота как кормовая добавка / В. Соколов, А. Андреева, В. Евелева, А. Касаткин // Птицеводство. - 1995. - №5. - С. 17-18.
11. Тараканов, Б. Новый пробиотик / Б. Тараканов, А. Соловьев, Т. Николечева, Т. Боброва // Птицеводство. - 1999. - № 6. - С. 32-33.
12. Хисамов, Р. Р. Влияние препарата «Янтарос плюс» на обменные процессы, продуктивность и сохранность цыплят и кур-несушек : автореф. дис. ... канд. ветеринар наук : 16.00.01 / Хисамов Ренат Рустямович - Казань - 2001 - С. 3-19.
13. Barrow, P.A. Probities for chickens / P.A. Barrow // Probities: the Scientific Basis (Ed. Fuller R.). - Chapman and Hall, London. - 1992. - Р. 225-227.
14. Kitler, M.E. Lactitol and Lactulose. An in vivo and in vitro comparison of their effects on human intestinal flora / M.E. Kitler, M. Luginbuhl, O. Lang // Drug Invest. - 1992. - 4 (1): 73-82.
