CC BY
29
УДК 636.96.087.7:[606:63
БИОТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА И ТОКСИКО-ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ВЛИЯНИЕ ПРЕБИОТИЧЕСКОЙ ДОБАВКИ ГИДРОГЕМОЛ НА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
В. И. ТЕРЕХОВ, Т. И. ПАШНИК, Е. А. ЧЕТВЕРИКОВА
ФГБОУВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К. И. Скрябина», г. Москва, Российская Федерация
(Поступила в редакцию 19.01.2018)
В статье представлена разработка и токсикологическая оценка новой пребиоти-ческой кормовой добавки гидрогемол. Изучены состав, токсикологические свойства препарата. Был изучен: состав микрофлоры ЖКТ, гематологический, биохимический состав крови, иммунный статус лабораторных крыс, поедаемость и переносимость препарата.
Гидрогемол является гидролизатом крови убойных животных, не оказывает токсического действия; при длительном применении не установлено отрицательного влияния препарата в испытуемых дозах на обмен веществ лабораторных животных; способствует угнетению развития условно-патогенных бактерий (кишечной палочки, стафило- и энтерококков), а также грибов рода кандида; стимулирует рост молочнокислых бактерий.
Ключевые слова: биотехнология, фармакология, токсикология, микрофлора, биохимия крови, лабораторные животные.
The article presents the development and toxicological evaluation of the new prebiotic fodder additive hydrogemol. The composition, toxicological properties of the preparation were studied. Has been studied: the composition of the gastrointestinal tract, hematological, biochemical composition of blood, the immune status of laboratory rats, eating and tolerability of the drug.
Hydrohemol is a hydrolyzate of blood of slaughter animals, it does not have toxic effects; with prolonged use, there is no negative effect of the drug in the test doses on the metabolism of laboratory animals; promotes oppression of the development of opportunistic bacteria (E. coli, staphylococcus and enterococci), as well as fungi of the genus Candida; stimulates the growth of lactic acid bacteria.
Key words: biotechnology, pharmacology, toxicology, microflora, blood biochemistry, laboratory animals.
Введение. Развитие птицеводства основывается на максимальном обеспечении населения страны пищевым яйцом и мясом птицы отечественного производства, что необходимо для решения проблемы продовольственной безопасности страны. [6] В условиях промышленного ведения птицеводства содержание, кормление и другие факторы технологических приемов не соответствуют биологическим потребностям птицы, что негативно отражается на их физиологическом состоянии. Воздействие неблагоприятных факторов часто отрицательно влияет на иммунитет птицы, что приводит, в первую очередь, к снижению продуктивности и ослаблению устойчивости птицы к различным болезням. Кроме этого, массовое использование антибактериальных препа-
ратов в период промышленного выращивания птицы негативно отражается на организме и здоровье человека. В связи с этим возникает необходимость в создании препаратов, которые можно использовать для повышения продуктивности, сохранности поголовья, коррекции иммунитета птицы и при этом не вызывающих какого-либо отрицательного воздействия на организм человека. Всемирной организацией здравоохранения давно ставится вопрос о замене антибактериальных препаратов, их бесконтрольном применении у людей, животных и птиц. Поэтому разработка новых отечественных пребиотических препаратов, биологически активных добавок является актуальным.
Анализ источников. Пребиотики - это неперевариваемые компоненты пищи, которые благоприятно воздействуют на организм, избирательно стимулируя рост и/или метаболическую активность одного или нескольких видов полезных бактерий в толстом кишечнике [1]. Пребиотическими препаратами являются полисахариды, относящиеся к классу b-гликанов, т. е. полисахариды, не гидролизуемые собственными пищеварительными ферментами организма и являющиеся пищевым субстратом анаэробной микрофлоры кишечника. К пребиотикам относится лактулоза, инулин, фруктоолигосахариды, хитозан и др. Механизм их действия сводится к следующему: будучи неферменти-руемыми углеводами они в неизмененном виде легко достигают толстой кишки, где избирательно становятся промоутерами (стимуляторами роста и жизнедеятельности) нормофлоры микробного пула, т. е., пребиотики, восстанавливая разрушенные звенья в системе молекулярного обмена «хозяин-микробиота», восстанавливают тем самым ее гомеостатическое состояние [14]. Ключевым моментом в характеристике пребиотиков является их избирательное стимулирование полезных для животного организма представителями кишечной микрофлоры, к которым в первую очередь относятся бифидобактерии и лакто-бациллы [12]. Попадая в толстый кишечник, препараты ферментируются сахаролитической микрофлорой (бифидобактериями и лактоба-циллами) до уксусной, молочной и других кислот, что ведет к снижению рН внутри толстой кишки, и создает неблагоприятные условия для развития других родов бактерий, например сальмонелл. Образовавшиеся кислые продукты, другие метаболиты подавляют развитие гнилостной микрофлоры. В результате этого уменьшается количество колоний патогенных бактерий и токсичных метаболитов (аммиака, скатола, индола и др) [1]. Лактулоза (в препаратах Дюфалак, Нормазе, Порталак, Ветелакт) - синтетический олигосахарид, состоящий из остатков галактозы и фруктозы. Лактулоза попадает в толстый кишечник в неизмененном виде. Микрофлора толстой кишки гидролизует лакту-лозу с образованием кислот (молочной, частично муравьиной и уксусной). Органические кислоты препятствуют проникновению патогенной микроорганизмов (Salmonella, Campylobacter) в эпителиальные клетки кишечника [11]. На фоне лактулозы идет активное размноже-
ние вводимых извне бифидобактерий и лактобактерий, а также стимуляция роста естественной микрофлоры кишечника [2, 10]. Инулин -полисахарид, содержащийся в клубнях и корнях георгинов, артишоков и одуванчиков. Он представляет собой фруктозан, так как при его гидролизе образуется фруктоза. Пребиотик стимулирует рост и активность бифидо- и лактобактерий [15]. Маннаноолигосахаридный препарат кливеролак на основе клеточных стенок дрожжей Kluyveromyces lactis, введенный в рацион цыплят, способствует восстановлению структуры микробиоценоза кишечника за счет усиленной колонизации слизистой лактобациллами, бифидобактериями до 9,83±0,07 КОЕ/г и 8,52±0,07 КОЕ/г соответственно. Механизм действия добавки проявляется блокадой рецепторов адгезии у условно-патогенных бактерий, в том числе эшерихий. Это приводит к снижению уровня колонизации кишечной стенки условно-патогенной микрофлорой. [13] Лактит (лак-титол) - это структурообразующий сахарозаменитель(4-О-бета-Э-галактопиранозил-Э-сорбит) с низким гликемическим индексом (6), не влияет на уровень глюкозы в крови и инсулина. По типу метаболизма лактит похож на пищевые волокна, не расщепляется и не всасывается в желудке и в тонком кишечнике, а ферментируется сахаролитической микрофлорой в толстом кишечнике, преобразуясь на короткоцепочные жирные кислоты, водород, углекислый газ и биомассу. Жирные кислоты снижают рН в толстом кишечнике до слабокислой, что приводит к подавлению роста протеолитических условно-патогенных бактерий (таких как энтеробактерии и энтерококки), отвечающих за синтез про-канцерогенных ферментов. Лактит ингибирует адгезию условно-патогенных энтеробактерий (таких как кишечная палочка и клебсиел-ла) к эпителию клеток толстого кишечника [9]. Подкисление кормов органическими кислотами (5,7 % молочной и 0,7 % уксусной кислот), является одним из путей предотвращения распространения Campylobacter, по сравнению с цыплятами-бройлерами, потребляющими традиционный рацион. В подкисленном и ферментированном корме полная инактивация кампилобактерий отмечается через 20 минут; общее число сальмонелл начинает снижаться через 1 час, и полная инактивация наблюдается через 2 часа [14]. Молочная кислота— (а-оксипропионовая кислота, CH3CH(OH)COOH) является натуральным продуктом и может рассматриваться как биологически безопасный продукт, поскольку является метаболитом обмена веществ организма человека, животных и растений. В результате 3-месячного срока скармливания молочной кислоты в кишечнике у кур-несушек суммарное количество условно-патогенных микроорганизмов (грибов, протея, кишечной палочки) уменьшается с 45-47 до 25-29 %, а молочнокислых бактерий увеличивается с 35-40 до 62-65 %.
Цель работы - разработка и токсикологическая оценка новой пре-биотической кормовой добавки гидрогемол. Задачи: изучить состав, токсикологические свойства препарата.
Материал и методика исследований. Научно-производственные опыты и апробацию результатов научных исследований проводили в лабораториях терапии, микробиологии и микологии, фармакологии Краснодарского научно исследовательского ветеринарного института РАСХН; в Межрайонной ветеринарной лаборатории г. Новороссийска. В экспериментах использовано 25 крыс-самцов.
Токсико-фармакологическое влияние кормовой добавки пребиоти-ческого действия гидрогемол на организм молодых белых крыс изучали в опыте 1 на базе лаборатории Краснодарского НИВИ. Был изучен: состав микрофлоры ЖКТ, гематологический, биохимический состав крови, иммунный статус лабораторных крыс, поедаемость и переносимость препарата (табл. 1).
Таблица 1. Схема опытов
Груп- Число Продолжительность Условия кормления
па голов опыта, дней
Опыт 1 (белые крысы)
1-О 5 7 ОР + гидрогемол (4,0 мл/кг)
2-О 5 7 ОР + гидрогемол (8,0 мл/кг)
3-К 5 7 ОР (основной рацион)
Токсикологические исследования гидрогемола изучали на молодых белых крысах. В опыте были проведены исследования: состава микрофлоры ЖКТ, гематологические, биохимические исследования крови, иммунный статус лабораторных крыс, поедаемость и переносимость препарата. Данные показатели определяли согласно методическим рекомендациям по изучению общетоксического действия фармакологических средств, методическим указаниям по токсикологической оценке новых препаратов для лечения и профилактики незаразных болезней животных; ГОСТу Р 54063-2010 «Средства лекарственные для животных. Методы определения безвредности»; Методическим указанием по изучению общетоксического действия фармакологических средств. Влияние препарата на микробиоциноз кишечника изучено при проведении эксперимента на белых мышах массой 18-20 г, подобранных по принципу аналогов, которые получали в течение 10 дней пребиотик из расчета 0,1мл. Были выделены в качестве доминирующих групп микроорганизмов: бактерии рода Lactobacillus, энтерококки и Bifidobacterium. Популяционный уровень этих микроорганизмов определяли методом количественного группового анализа до и через 5, 10 дней и через 3 дня после окончания скармливания пребио-тика.
Бифидобактерии культивировали на среде Бифидум, лактобакте-рии - на лактобакагаре, бактероиды гр. B. fragilis - на кровяном анаэробном бактоагаре с канамицином и желчью. Выделение лактатфер-ментирующих микроорганизмов и подсчет их проводили на среде Ки-стнера. На среде Эндо выделяли бактерии группы кишечной палочки. Энтерококки выделяли и культивировали на среде энтерококкагаре, стафилококки - на желточно-солевом агаре, гемолитические микро-
организмы - на 5 % кровяном агаре, дрожжеподобные грибы - на агаре Сабуро, клостридии - на среде Вильсона-Блера Г81. Статистическая обработка микробиологических данных проводилась по В. С. Асатиани. Результаты исследований обрабатывали с применением компьютерной программы с определением критерия достоверности.
Результаты исследований и их обсуждение. Гидрогемол является гидролизатом крови убойных животных, полученным путем кислотного гидролиза, и представляет собой прозрачную жидкость темно-коричневого цвета, кисловато-вяжущего вкуса со специфическим запахом, рН 3,5-4,0. Гидрогемол содержит свободные заменимые и незаменимые аминокислоты, микроэлементы, молочную, янтарную и бензойные кислоты. В состав препарата входят аминокислоты: аспара-гиновая, глутаминовая, серин, глицин, гистидин, треонин, аланин, пролин, аргинин, тирозин, метионин, валин, изолейцин, лейцин, фени-лаланин, лизин. Минералы: кальций, магний, железо, цинк, медь. Инструкция по применению кормовой добавки гидрогемол утвержденная заместителем руководителя управления Россельхознадзора по Краснодарскому краю и Республике Адыгея О. В. Сизоновым от 21 января 2012 года.
Исследования по влиянию гидрогемола на организм и отработка оптимальных доз проводилась в опыте 1 на молодых белых крысах со средней массой 90-100 г. В ходе опыта оценивали поедаемость и переносимость препарата, его действие на кишечную микрофлору, гематологические, биохимические и иммунологические показатели. С этой целью было сформировано 3 группы животных по 5 голов в каждой. 1 -я группа получала гидрогемол в дозе 4,0 мл/кг, 2-я - 8,0 мл/кг, 3-я -контрольная (интактная). Препарат задавали индивидуально каждому животному с помощью катетера один раз в сутки в течение 7 дней подряд. По окончании дачи кормовой добавки пребиотического действия был изучен состав микрофлоры ЖКТ, гематологический, биохимический состав крови и иммунный статус лабораторных крыс 3 -х групп. При исследовании кала у опытных животных обнаружили позитивный сдвиг в качественном и количественном составе кишечной микрофлоры. Концентрация эшерихий, стафилококков, энтерококов, дрожжеподобных грибов в первой опытной группе снизилась на 44,7 %; 14,8 %, 42,3 %, 36,9 % (р<0,05) по отношению к контролю и составила 5,4±0,6, 5,0±0,12, 4,7±0,38, 6,5±0,12 Lg КОЕ соответственно. А во второй группе с дозой препарата 8 мл/кг живого веса, на 94,5 %, 30,9 %, 54,5 %, 24,8 % (р<0,01). Тогда как число лактококков и лакто-бактерий достоверно выросло в первой на 23,8 % и 13,5 %, а во второй опытной на 18,3 % и 12,1 % соответственно (р<0,01) по отношению к данным 3-й контрольной группы. Из результатов микробиологических исследований следует, что применение гидрогемола способствует угнетению развития условно-патогенных бактерий (кишечной палочки, стафило- и энтерококков), а также грибов рода кандида. И стимулиру-
ет рост молочнокислых бактерий, тем самым выправляет количественный и качественный состав экосистемы желудочно-кишечного тракта животных.
По результатам биохимического исследования сыворотки крови было выявлено, что в группах где применяли гидрогемол, повышение содержания общего белка, гамма-глобулинов, глюкозы, АЛТ по отношению к интактной группе на 0,5 %, 32,2 %, 11,5 %, 31 % (р<0,01) в 1-й и на 6,6 % (р<0,01), 43,4 % (р<0,05), 14,6 % (р<0,05), 31 % (р<0,05), соответственно во 2-й опытной группах. Отмечалось снижение у 2-й группы по отношению к контролю АСТ на 17,5 % (р<0,05). Другие показатели достоверно не отличались от таковых, интактной группы. В результате биохимических исследований не установлено отрицательного влияния препарата на обмен веществ лабораторных животных. Наоборот испытуемые дозы гидрогемола благотворно действуют на организм крыс, увеличивая белковый и углеводный обмен и повышая общую резистентность организма, о чем косвенно свидетельствует рост гамма-глобулинов.
Показатели клеточного и гуморального звена иммунитета, подтверждают позитивные моменты действия препарата на иммунитет животных. По окончании опыта количество Т- и В-лимфоцитов в относительных значениях были на 12,3 % (р<0,01) и 21,3 % (р<0,05) выше в 1-й опытной группе, по сравнению с контролем, а во 2-й - на 20,1 % (р<0,01) и 12,2 % соответственно. Причем во второй группе с дозой 8 мл/кг больше активизируется Т-клеточное звено иммунитета, о чем свидетельствует их повышение на 32,1 % (р<0,05). Сохраняется увеличение популяции и в абсолютных значениях. Так, число Т-клеток на 80,2 %; 82,7 % (р<0,01) и В-лимфоцитов на 45,4 %; 81,4 % (р<0,05) соответственно, выше в 1-й и 2-й группах по сравнению с контролем. Механизмы специфической защиты организма (фагоцитоз) достоверно изменяются двумя показателями, в первой группе животных: повышенным числом активных фагоцитов на 7,6 % и процентом перевари-ваемости бактерий на 11,5 % (р<0,05). Эта тенденция наблюдается и у животных 2-й группы, но их данные подлинно не отличаются от показателей интактных крыс. Гематологические исследования крови показали, что у опытных животных препарат позитивно влияет на лейкопо-эз и эритропоэз, с увеличением доли гемоглабина на 7,0 % и 25,0 %, соответственно в 1 -й и 2-й группах. Во второй опытной группе достоверно (р<0,05) повышалось количество моноцитов на 53,3 %, что связанно с действием препарата на функциональную активность лимфо-идных органов и стимуляцию гуморального звена иммунитета.
Поэтому из вышеизложенного можно предположить, что препарат гидрогемол действует комплексно как на микроорганизмы, так и на макроорганизм в целом. Повышая иммунитет, обмен веществ у животных за счет биологически активных веществ (аминокислот, микро-,
макроэлементов и органических кислот). Это и дало основание к более серьезным клиническим испытаниям препарата.
Заключение. Гидрогемол является гидролизатом крови убойных животных, не оказывает токсического действия; при длительном применении не установлено отрицательного влияния препарата в испытуемых дозах на обмен веществ лабораторных животных; способствует угнетению развития условно-патогенных бактерий (кишечной палочки, стафило- и энтерококков), а также грибов рода кандида; стимулирует рост молочнокислых бактерий.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алешин, С. Н. Пребиотики - одно из важнейших открытий в области современного питания / С. Н. Алешин // [Электронный ресурс]. - 2006. - Режим доступа: http: //www.ortho.ru.
2. Бельмер, С. В. Лактулоза (Дюфалак) как пребиотик: от теоретического обоснования к практическому применению / С. В. Бельмер // [Электронный ресурс]. - 1997. -Режим доступа: http: //www.gastroportal.ru.
3. Горячковский, А. М. Справочное пособие по клинической биохимии / А. М. Го-рячковский // Днепропетровск: АО «Реагент», 1994. - С. 162-165.
4. Грошева, Г. А. Новые методы оценки естественной резистентности и реактивности организма птиц / Г. А. Грошева, Н. Р. Есаков // Ветеринария. - 1996. - № 9. - С. 3435.
5. Гурвич, А. Е. Иммуногенез и клеточная дифференцировка / А. Е. Гурвич. // М.: Наука. - 1978. - 231 с.
6. Данилевская, Н. В. Фармакостимуляция продуктивности животных пробиотиче-кими препаратами : автореф. дис. ... д-ра ветеринар. наук: 16.00.04 / Н. В. Данилевская.
- М., 2007. - 36 с.
7. Жуковская, Н. А. К вопросу о неспецифическом защитном действии лизоцима / Н. А. Жуковская, Г. Н. Ликина // Антибиотики. - 1966. - № 11(10). - С. 920-924.
8. Каблучеева, Т. И. Использование пробиотиков в птицеводстве / Т. И. Каблучеева.
- Краснодар, 2004. - С. 3-78.
9. Куликова, И. К. Лактит (лактитол) - функциональный пребиотик / И. К. Куликова, М. В. Папина, В. Г. Папин // [Электронный ресурс]. - 1999. - Режим доступа: http: // www.normoflorin .ru.
10. Основы фармацевтической биотехнологии / Т. П. Прищеп [и др.]. - Ростов н/Д.: Феникс, 2006. - С. 256.
11. Скворцова, Л. Нетрадиционное сырье в кормлении птицы / Л. Скворцова // [Электронный ресурс]. - 2009. - Режим доступа: http: //www.pressa.kuban.info.
12. Субботин, И. Г. Сравнительная морфофункциональная характеристика желудочно-кишечного тракта крыс при применении некоторых пребиотиков : автореф. дис. ... канд. ветеринар. наук : 16.00.02 / И. Г. Субботин. - Саратов, 2009. - С. 7-18.
13. Чупахина, Н. А. Применение маннаноолигосахаридной пребиотической добавки «Кливеролак» для коррекции микробиоценоза кишечника и стимуляции неспецифической резистентности цыплят: автореф. дис. ... канд. биол. наук: 16.00.03 / Н. А. Чупахина. - М., 2004. - 3-27 с.
14. Heres, L. Effect of acidified feed on susceptibility of broiler chickens to intestinal infection by Campylobacter и Salmonella / L. Heres , B. Engel H.A.P. Urlings, and other // Veretynary Microbiology. - 2004. - Vol. 99. - №3/4. - Р. 259-267.
15. Van, I.F. Использование органических кислот в борьбе против сальмонеллеза с.-х. птицы: механическое объяснение эффективности. (Бельгия. США) / I.F Van, J.B. Russell, M.D. Flythe, I. Gantois, L. Timbermont et al // Avian Pathology. - 2006. - Vol. 35, № 3.-P. 187-188.
