CC BY
14УДК 615.916.074
А.Б.Выштакалюк1, А.Н.Карасева^ В.В.Карлин1, С.Т.Минзанова1, В.Ф.Миронов1, А.И.Коновалов1, В.В.Зобов1, А.В.Ланцова1, И.Г.Мустафин2
ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА НАТРИЙ-, ЖЕЛЕЗО-, КОБАЛЬТ-,
МЕДЬ-ПОЛИГАЛАКТУРОНАТА
Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦРАН 2Республиканский центр по борьбе и профилактике болезни СПИД, Казань
Установлено, что комплексообразование ^-металлов с пектиновыми биополимерами приводит к снижению токсичности металлов по сравнению с неорганическими солями. Ка-, Fe-, Со-, Си-полигалактуронат не оказывает отрицательного влияния на рост и развитие молодняка лабораторных животных, а также на исследованные иммунобиологические показатели крови: белок, число лейкоцитов, лейкоцитарная формула, фагоцитарная активность нейтрофилов. Иммунологические эффекты в наибольшей степени обусловлены пектиновым биополимером, а не металлами. В дозах 150—300 мг/кг, Ка-, Fe-, Со-, Си-полигалактуронат не оказывает отрицательных эффектов на физическую работоспособность мышей.
Ключевые слова: пектиновые полисахариды, металлокомплексы, микроэлементы, токсикологическая оценка.
Введение. Пектиновые вещества часто используются в качестве вспомогательного средства при создании лекарственных форм. Это перспективно, поскольку пектины меняют физико-химические и биологические свойства некоторых лекарственных веществ. Например, нерастворимый в воде кверцетин обнаруживается равномерно распределенным в гелеподобном растворе после гранулирования с пектином. При этом наблюдается повышение желчегонной активности кверцетина на 40—50 % [1]. Благодаря набуханию в водной среде, пектин способствует быстрому распаду и повышению биологической доступности лекарственных веществ. Пектины способны усиливать и пролонгировать лечебные свойства лекарств, а также подавлять их побочные действия. Так, таблетки аспирина с цитрусовым пектином быстро распадаются в желудочно-кишечном тракте, что приводит к повышению болеутоляющего действия. При этом значительно снижается раздражающее воздействие аспирина на стенки желудочно-кишечного тракта [2]. Также обнаружено потенцирующее и детоксическое действие пектиновых веществ при комбинации их с пенициллинами, тетра-циклинами и неомицином [3].
Поскольку снижение потребления микроэлементов приводит к существенным нарушениям в организме [4—8], а применяемые в настоящее время лекарственные формы содержат преимущественно неорганические соединения металлов-микроэлементов, которые могут оказывать раздражающее воздейст-
вие на слизистую желудочно-кишечного тракта и проявлять токсические эффекты [9], поиск высокоэффективных малотоксичных лекарственных форм на основе микроэлементов является весьма актуальным. В плане данного научно-практического направления перспективным является создание водорастворимых металлокомплексов [10—12], синтезированных на основе пектиновых биополимеров. Показано [12, 13], что химическая модификация пектинов введением ионов металлов-микроэлементов Со2+, Fe2+, Си2+, Мп2+, 7п2+ приводит к изменению их биологической активности и при да ет им но вые био ло ги чес кие свой ст ва, проявляющиеся в стимулирующем действии на кроветворную и иммунную системы. Наиболее выраженный эффект на функцию кроветворения отмечается для полиметаллокомп-лекса — натрий-, железо-, кобальт-, медь- по-лигалактуроната [14], содержащего в молекуле пектинового полисахарида натрий и одновременно три ^-металла-микроэлемента. Однако, помимо функции кроветворения, для дальнейшей рекомендации к использованию данного вещества в фармакологической практике необходимо исследование его токсикологических свойств и влияния на другие функции организма.
Материалы и методы исследования. Исследуемое вещество — водорастворимый натрий-, кобальт-, медь-, железо- полигалактуронат, или полиметаллокомплекс — синтезирован согласно [1, 3]. Содержание металлов в составе вещества
Таблица 2
Токсичность водорастворимых металлокомплексов полигалактуроновой кислоты -полигалактуронатов (ПГ) и неорганических солей
Таблица 1
Содержание (в %) металлов в полиметаллокомплексе
Na Fe Co Cu
6,05 0,68-1,10 0,76-1,27 0,77-1,20
Соединение DL50, в/б, мг/кг Содержание d-металлов в дозе DL50, мг/кг
Пектин цитрусовый > 1000 0,0
ПГ Na, Cu ~ 500 ~ 18,5
CuSO4 • 5H2O 20 5,09
ПГ Na, Fe 1100 34,1
FeSO4 • 7H2O 180-200 36,18-40,2
ПГ Na, Co ~ 600 ~ 15,0
CoCl2 • 6H2O 80-85 19,84-21,08
ПГ Na, Fe, Co, Cu 1100 Fe 7,48-12,10 Co 8,36-13,97 Cu 8,47-13,20 Сумма d-металлов 24,31-39,27
приведено в табл. 1.
Острую токсичность водорастворимого поли-металлокомплекса в сравнении с биметаллоком-плексами, содержащими натрий и один из d-ме-таллов, а также с соответствующими неорганическими солями определяли на беспородных белых мышах при однократном внутрибрюшин-ном (в/б) способе введения. Соединения вводили в диапазоне от 20 до 1500мг/кг. Величину DL50 определяли по Беленькому [15] на 5 день наблюдения.
Исследования иммунобиологических и других функциональных показателей проводили на лабораторных крысах и мышах. Для эксперимента отбирали животных одинакового возраста и пола и формировали группы численностью по 3—5 особей (для крыс) и по 8 особей (для мышей). На крысах эксперименты проведены на интактных животных — половозрелых самцах в возрасте 2—3 месяца мас-
сой 150—200 г и на растущем молодняке (возраст 1—5 дней). Исследуемое вещество в виде 1 % раствора разбавляли дистиллированной водой в необходимой пропорции (1:1, 1:3, 1:4, 1:7) и давали животным, заменяя питьевую воду. Контрольные группы животных получали либо раствор цитрусового пектина, разбавленный аналогичным способом, либо чистую воду. Молодняк крыс, до 1 месяца содержавшийся с кормящими самками, получал вещества с материнским молоком, а затем, после отъема, при са мо сто я тель ном пи тье рас тво ров. Ис следовали следующие показатели: выживаемость, среднесуточный прирост массы (еженедельное взве ши ва ние, об ра бот ка дан ных в про грам ме Origin 6.0), число лейкоцитов (камера Гаряева, световая микроскопия), лейкоцитарная формула (световая микроскопия), фагоцитарная активность нейтрофилов (метод проточной цитофлуориметрии), белок плазмы (рефракто-
Испытуемый раствор, доза вещества Количество крысят Умерли при рождении, % Умерли в течение 1 месяца, % Всего мертвых Прирост массы тела, г/сутки
Контроль 35 (~ 6/самку) 1 (2,3 %) 5 (14,3 %) 6 (17,1 %) 1,40+0,13
ПГ Na, Fe, Co, Cu, 250 мг/кг: 1,9 мг Fe, 2,2 мг Co, 2,1 мг Cu 10 (5/самку) - 0 0 1,18+0,07
ПГ Na, Co, 20 мг/кг: 0,5 мг Co 16 (8/самку) 2 (12,5 %) 2 (12,5 %) 4 (25 %) 1,35+022
ПГ Na, Co, 35 мг/кг: 0,9 мг Co 12 (6/самку) 0 7 (58,3 %) 7 (58,3 %) 1,22+0,09
Таблица 3
Влияние Na-, Fe-, Co-, Cu- полигалактуроната и Na-, Co- полигалактуроната на рост и развитие молодняка крыс
Таблица 4
Количество мышей, отказавшихся от теста «Бег на третбане» и время отказа (в скобках)
Неделя опыта Контроль ПГ Fe, Co, Cu (мг/кг)
150 300 500
1 0/8 0/5 0/11 1/16 (7 мин)
2 0/8 0/5 0/11 3/16 (5 мин)
3 0/8 0/5 0/11 5/16 (5-19 мин)
4 1/8 (10 мин) 0/5 0/11 5/16 (1-5 мин)
Итого: 1/8 (12,50 %) 0/5 (0,00 %) 0/11 (0,00 %) 5/16 (31,25 %)
метрический метод). Результаты опытов обрабатывали статистически по t-критерию Стью-дента в программе Origin 6.0.
Тест на физическую работоспособность (тест «бег на третбане», 30 мин, 1 км/час) проводили на мышах массой 24—26 г. Исследуемое вещество (натрий-, кобальт-, медь-, железо- полигалак-туронат) в трех разных дозах (140, 300 и 500 мг/кг) испытывали на мышах, предварительно тренированных в течение 1 недели к бегу на третбане. Вещество в соответствующей дозе вводили животным в питьевую воду в течение 4 недель. В течение экспериментального периода тест проводили 1—2 раза в неделю при заданных параметрах.
Результаты и обсуждение. Данные по токсичности вещества в сравнении с биметаллоком-плексами (содержание ^-металлов 2,5—3,7 %) приведены в табл. 2.
Как следует из табл. 2, комплексообразова-ние ^-металлов с пектиновыми биополимерами по-разному влияет на токсикологические свойства ионов ^-металлов при внутрибрю-шинном введении веществ. Так, для меди в составе комплексов с пектинами наблюдается снижение токсичности более, чем в 3,5 раза. Для железа и кобальта DL50либо остается неизменной, либо незначительно снижается, что может быть обусловлено повышением биологи чес кой дос туп нос ти дан ных мик ро эле ментов в составе пектинового биополимера. В целом металлокомплексы пектиновых полисахаридов с ^-металлами, согласно классификации токсичности, относятся к умеренно- и малотоксичным соединениям [16].
По данным литературы [17], токсичность неорганических солей, исследованных ^-металлов при перроральном введении значительно меньше, чем при внутрибрюшинном: для CuSO4-5H2O DL50 = 300 мг/кг, что соответствует 76,4 мг меди, для FeSO4-7H2O DL50 = 1389-2778 мг/кг, что соответствует 279,2-558,4 мг/кг железа. Показано [18, 19], что при однократном пероральном введении металлокомплексы не проявляют ток-
сичность для половозрелых животных даже при дозе 12500 мг/кг, соответствующей 313—463 мг ^-металлов. Данная доза либо существенно превышает, либо соответствует диапазону доз, при котором для соответствующих неорганических солей металлов отмечается DL50.
Результаты, полученные в начальный период роста на молодняке (наиболее чувствительной группе животных) представлены в табл. 3. Как следует из табл. 3, Ка-, Со- полигалактуро-нат при дозе вещества, содержащей пятикратную суточную норму кобальта, не оказывающую отрицательного влияния на организм взрослых животных [14], вызывал гибель более чем половины крысят в течение первого месяца жизни. Однако при этом среднесуточный прирост массы тела у выживших крысят достоверно не отличался от контрольных показателей. Полиметалл окомплекс, содержащий одновременно три металла, при 10-кратной дозе кобальта практически не оказывал токсического воздействия на данную группу животных. Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что снижение токсичности кобальта в составе полиме-таллокомплекса по сравнению с Ка-, Со- поли-галактуронатом, с одной стороны, может быть обусловлено более высоким содержанием пектинового биополимера, приходящегося на единицу массы кобальта, и, соответственно, деток-сицирующим действием пектина. С другой стороны, данный эффект может быть связан с ин-гибирующим влиянием других металлов (железа и меди) на биологическую доступность кобальта.
Функциональные нагрузки в тесте «Бег на третбане» делает животных более чувствительными к химическому воздействию [20, 21]. Данный интегральный тест позволяет выявить возможные побочные и токсические эффекты лекарственных веществ, проявляющиеся в снижении физической работоспособности и невозможности животных выполнять тестовую нагрузку на третбане.
Таблица 5
Основные иммунобиологические показатели у животных в экспериментальных группах
Показатель Контроль 1 (вода) Контроль 2 (пектин, 140 мг/кг) ПГ Fe, Co, Cu, 120 мг/кг (1,3 мг Fe, 0,9 мг Co, 1,0 мг Cu)
Прирост массы тела, г/сутки 1,60+0,07 1,74+0,16 1,41+0,05
Концентрация белка в плазме крови, % 9,22±0,20 8,87+0,25 8,64+0,23
Число лейкоцитов, тыс/мкл, 12,09+1,69 20,84+2,17 ** 18,81+2,00 *
Лейкоцитарная формула (%):
Лимфоциты 77,7+2,1 81,3+1,8 75,3+2,9
Нейтрофилы
общее число 13,2+1,2 7,5+0,8** 12,4+2,0
сегментоядерные 11,8+1,2 5,8+0,8*** 11,2+1,6
палочкоядерные 1,4+0,5 1,7+0,8 1,2+0,6
Моноциты 3,5+1,8 4,5+1,0 5,6+1,1
Базофилы 2,1+0,4 2,5+0,6 2,7+0,6
Эозинофилы 3,5+0,7 4,3+0,9 4,0+0,8
Фагоцитоз staphylococcus aureus:
Фагоцитоз, % 74,74+2,21 87,18+11,59 83,06+4,57
Интенсивность фагоцитоза, ед. 1199,2+54,1 1309,5+90,9 1362,6+173,7
Фагоцитоз E. coli:
Фагоцитоз, % 89,83+1,99 87,86+10,59 92,92+6,16
Интенсивность фагоцитоза, ед. 1964,3+250,0 1033,1+80,2 * 1794,3+149,8
Примечание: * — различия с показателями контрольной группы достоверны при р < 0,05, ** — то же, при р < 0,01, *** — то же, при р < 0,001
Показано, что в контрольной группе все мыши безотказно выполняли тест в течение трех недель (табл. 4). Для Na-, Fe-, Co-, Cu- полигалактуроната выявлен дозозависимый эффект: при дозах ниже 300 мг/кг, при которых проявляется противоанемический эффект [14], снижения физической работоспособности не происходит (табл. 4). При более высокой дозе (500 мг/кг) вещество начинает снижать физическую работоспособность животных. Следует отметить, что данный эффект был слабо выражен, поскольку проявлялся лишь у 31 % животных, и наступал не сразу, а через 2—3 недели потребления вещества в данной дозе.
В настоящей работе на половозрелых самцах лабораторных крыс у животных, получавших Na-, Fe-, Co-, Cu- полигалактуронат, были исследованы некоторые иммунобиологические показатели. Результаты исследования приведены в табл. 5.
Как следует из табл. 5, Na-, Fe-, Co-, Cu- полигалактуронат не вызывал каких-либо отрицательных воздействий на исследованные имму-но-биологические показатели у лабораторных крыс. В группах, получавших пектин и полиметалл окомплекс, отмечали увеличение числа лей-
коцитов по сравнению с контрольной группой. Однако при этом, в отличие от пектина, вызывающего снижение количества сегментоядер-ных нейтрофилов, Na-, Fe-, Co-, Cu- полигалактуронат не оказывал влияния на лейкоцитарную формулу. По фагоцитозу St. aureus наблюдается небольшое повышение фагоцитарной активности нейтрофилов как для пектина, так и для по-лиметаллокомплекса. Однако по фагоцитозу E. coli отмечается некоторое снижение данного показателя в обеих группах, особенно в группе, получавшей пектин. В целом, можно сказать, что исследованное вещество Na-, Fe-, Co-, Cu- полигалактуронат оказывает влияние на иммунологические показатели, во многом сходное с таковым для пектиновых веществ.
Выводы. 1. Комплексообразование ^-металлов Fe, Co, Cu с пектиновыми биополимерами приводит к образованию менее токсичных соединений по сравнению с неорганическими солями.
2. При введении в молекулу пектинового полисахарида одновременно трех ûf-металлов-мик-роэлементов (железа, кобальта, меди) наблюдается снижение токсичности по сравнению с ме-таллокомплексами, содержащими один из перечисленных ^-металлов-микроэлементов.
3. Na-, Fe-, Co-, Cu- полигалактуронат не оказывает отрицательного влияния на рост и развитие молодняка, а также на иммунобиологические показатели крови: белок плазмы, лейкоцитарная формула фагоцитарная активность нейтрофилов. Эффекты, проявляющиеся со стороны иммунологических показателей, в наибольшей степени обусловлены пектиновым биополимером, а не металлами.
4. В дозах 150-300 мг/кг, проявляющих положительный эффект на кроветворение, Na-, Fe, Co-, Cu- полигалактуронат не вызывает отрицательных эффектов на физическую работоспособность у лабораторных животных.
Работа поддержана грантом ориентированных фундаментальных исследований РФФИ № 04— 03—97501 и Инвестиционно-венчурным фондом республики Татарстан.
Список литературы
1. Максютина Н.П., Пилипчук Л.Б. // Фармацевтический журнал, 1996. — № 2. — С. 35-41.
2. Kohnova Z. // Ceskoslov. Farmazia, 1977. — № 7. — С. 316-322.
3. Лазарева Е.Б., Меньшиков Д.Д. //Антибиотика и химиотерапия, 1999. — № 44, 2. — С. 37-40.
4. Haram K, Nilsen S.T., Ulvik R.J. Iron supplementation in pregnancy-evidence and controversies // Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica, 2001.
— V 80. — P. 683-688.
5. Rock E., Mazur A., O'Connor J.M. et al. //Free Radical Biological & Medicine, 2000. — V. 28. — № 3.
— P. 324-329.
6. Kadim I.T., Johnson E.H., Mahgoub O. et al. // Animal feed science and technology, 2003. — V. 109. — P. 209-216.
7. Mocchegiani E., Mozzioli M., Giacconi R. // Biogerontology, 2000. — V 1. — № 2. — P. 133-143.
8. Narth R. // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 1997. — V. 29. — № 11. — P. 1245-1254.
9. Лялякин П.В. Лекарства, которые вы выбираете. — М.: ТФ «Мир» ОНИКС 21 век, 2001. — С. 7-25.
10. Патент РФ № 2220981 (2004).
11. Патент РФ № 2219187 (2003).
12. Миронов В. Ф., Карасева А.Н. и др. //Химия и комп. моделир. Бутлеровские сообщения, 2003. — № 3. — С. 45-50.
13. Миронов В. Ф., Карасева А.Н. и др. //Химия и комп. моделир. Бутлеровские сообщения, 2004. — Т. 5. — № 3. — С. 36-38.
14. Карасева А.Н, Миронов В. Ф. и др. //Химия и комп. моделир. Бутлеровские сообщения, 2004. — Т.5. — № 1. — С. 33-35.
15. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. — Л.: Медицина, 1963. — С. 152.
16. Измеров Н.Ф. и др. Параметры токсикометрии промышленных ядов при однократном воздействии (справочник). - М.: Медицина, 1977. — С. 196-197.
17. Handbook of toxicology. Acute toxicities of solids, liquids, and gases to laboratory animals // Edited by W.S. Spector. — W.B. Saunders company, 1956. — 407p.
18. Набиев Ф.Г., Ямаев Э.И. //Материалы научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии. — Казань, 2001. — С. 162-163.
19. Набиев Ф.Г., Мухаметзянов М.Я. //Материалы научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии. — Казань, 2001. — С. 164-165.
20. Бобков Ю.Г. и др. Фармакологическая коррекция утомления. — М.: Медицина, 1984. — 208 с.
21. Рылова М.Л. Методы исследования хронического действия вредных факторов среды в эксперименте. — М.: Медицина, 1964. — С. 94-102.
Материал поступил в редакцию 30.05.06.
A.B.Vyshtakaluk, A-N.Karaseva1, V.V.Karlin1, S.T.Minzanova1, V.F.Mironov1, AJ.Konovalov1, V.V.Zobov1, A.V.Lantsova1, I.G.Mustafin2
TOXICOLOGICAL ASSESSMENT OF SDIUM-, IRON-, COBALT-, COPPER POLYGALACTURONATE
1A.Ye. Arbuzov Institute for Organic and Physical Chemistry, Kazan National Center of the Russian Academy of Sciences
2Republican Center for treatment and prophylaxis of AIDS, Kazan
It was established that a complex formation of d-metals together with pectin biopolymers leads to the reduction of toxicity of metals as compared to inorganic salts. Sodium-, iron-, cobalt-, copper polygalacturonate does not produce an adverse effect on the growth and development of the young of experimental animals as well as on investigated immunobiological blood indicators such as protein, number of leukocytes, leukocytic formula, phagocytic activity of neutrophils. Immunologic effects are produced to the greatest extent by pectin biopolymers and not by metals. In doses of 150—300 mg/kg sodium-, iron-, cobalt-, copper polygalacturonate exerts less adverse effects on physical working capacity of mice.
